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Artículo de método

Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia

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DOI:

10.3791/52114

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5 de noviembre de 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

En este artículo

Resumen

PAD4 es una enzima responsable de la conversión de peptidil-arginina en peptidil-citrulina. La desregulación de la PAD4 se ha implicado en una serie de enfermedades humanas. Se describe un ensayo PAD4 basado en fluorescencia fácil y compatible con alto rendimiento.

Resumen

Las modificaciones postraduccionales pueden conducir a estados funcionales de proteínas alterados al aumentar las variaciones covalentes en las cadenas laterales de muchos sustratos proteicos. Las colas de histonas representan uno de los tramos más modificados dentro de todas las proteínas humanas. Se ha demostrado que la peptidil-arginina deiminasa 4 (PAD4) convierte los residuos de arginina en el residuo de citrulina no codificado genéticamente. Pocos ensayos descritos hasta la fecha han sido operacionalmente fáciles y con una sensibilidad satisfactoria. Por lo tanto, es probable que la falta de ensayos adecuados haya contribuido a la ausencia de inhibidores potentes de la PAD4 no covalentes. En este trabajo se describe un nuevo ensayo basado en fluorescencia que permite monitorizar la actividad de PAD4. Se diseñó un análogo de sustrato profluorescente para vincular la actividad enzimática de PAD4 con la liberación de fluorescencia tras la adición de la proteasa tripsina. Se demostró que el ensayo es compatible con condiciones de cribado de alto rendimiento y tiene una fuerte relación señal-ruido. Además, el ensayo también se puede realizar con lisados de células crudas que contienen PAD4 sobreexpresada.

Introducción

Un gran número de proteínas de mamíferos son muy modificada por la acción de enzimas después de la biosíntesis de proteínas por el ribosoma. Estas modificaciones post-traduccionales (PTMs) pueden aumentar en gran medida la diversidad funcional del proteoma cambiando el tamaño, carga, estructura y estado de oligomerización (entre otras características) de las proteínas 1-3. Como resultado, el cambio en la estructura de la proteína puede conducir a consecuencias fisiológicas, tales como la degradación de proteínas, la diferenciación celular, la señalización, la modulación en la expresión génica, y las interacciones proteína-proteína. Mientras que estas modificaciones son frecuentes en un gran porcentaje de todas las proteínas humanas, los extremos terminales de las proteínas histonas se someten a un número inusualmente alto de modificaciones covalentes 4. Las proteínas histonas son una familia de proteínas estructurales que facilitan la condensación del ADN genómico. Las modificaciones covalentes de las colas de las histonas no estructurados se llevan a cabo y regulados por una series de enzimas que pueden catalizar la modificación covalente de residuos (escritores), revertir las mismas modificaciones (borradores), y distinguir entre los cambios que se imprime en las colas de las histonas (lectores) 5-7. De hecho, la mayoría de los PTM conocidos se puede observar dentro de este segmento corto de la histona incluyendo la metilación, fosforilación, acetilación, sumoylation, ubiquitinación, y citrullination 8.

Citrullination implica la conversión de peptidil-arginina a la no t RNA peptidil-citrulina codificada (Figura 1A). Las proteínas, responsables de esta cadena de neutralización lado, son miembros de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) familia de proteínas, todos los cuales son enzimas dependientes de calcio. 9,10. Hasta la fecha, cinco miembros de la familia PAD se han descrito (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, y PAD6). Cada miembro de esta familia aparece a proteínas diana celulares distintas y también muestra uniperfiles de distribución en tejidos Que. PAD4 es el único miembro de esta familia de proteínas conocida por ser localizada dentro del núcleo a través de una secuencia de localización nuclear 11. Por consiguiente, se ha demostrado que deiminate una serie de objetivos nucleares, incluyendo cadenas laterales de arginina en las colas N-terminales de las histonas H2A residuo de arginina 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, y H3R26) y H4 (H4R3) 12, 13. Mientras que cada una de las isoenzimas PAD tienen funciones fisiológicas específicas y críticas, PAD4 ha recibido mucha más atención debido a su papel en un número de procesos humanos en ambas células enfermas y sanas. Recientemente, PAD4 se demostró que era un miembro de la red transcripcional pluripotencia 14. Ambos niveles de expresión y actividad PAD4, se mostró a ser elevados durante la reprogramación y en estado fundamental estados pluripotentes en ratones. Mediante el control de la regulación de los genes de células madre, PAD4 puede retener un papel fundamental en la eficiencia de la reprogramación celular. PAD4 también ha sido implicado en laformación de trampas extracelulares de neutrófilos, que tras la unión de patógenos permitir su depuración de sistema. El hypercitrullination de proteínas histonas por PAD4 induce descondensación de la cromatina, que sirve como material de base para la encapsulación de bacterias patógenas por la trampa extracelular, por lo tanto alejar las infecciones bacterianas 15,16.

Además, PAD4 se ha encontrado para desempeñar un papel activo en un número de enfermedades humanas. Se ha demostrado previamente que la expresión aberrante de PAD4 se asocia con la aparición y severidad de la artritis reumatoide, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple 17. De hecho, la presencia de anticuerpos anti-proteína citrulinados es uno de los biomarcadores diagnósticos y pronósticos más confiables y definitivas de la artritis reumatoide 18. Asimismo, la actividad PAD4 dysregulated recientemente se ha observado en un número de cánceres humanos incluyendo ovario, mama, pulmón, unad cánceres esofágicos 19-22. El vínculo entre PAD4 y el cáncer se ha demostrado que ser mediada a través de la oncogén ELK1 o a través de la proteína supresora de tumores p53 22,23 y el trabajo previo ha sugerido que PAD4 podría ser un anti-cáncer de nueva diana terapéutica 17,24,25. Como prueba de principio estudio, el agotamiento de los PAD4 través shRNA en la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 fue revelado a ser suficiente para inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular 26. Un inhibidor irreversible PAD4 desarrollado recientemente condujo a una reducción del setenta por ciento de la masa tumoral en ratones 27. Muy notablemente, la inhibición PAD4 parecía actuar como una terapia dirigida que resultó en la destrucción selectiva de las células cancerosas sin dañar las células no transformadas.

El uso de moléculas pequeñas para desactivar la función de PAD4 puede llegar a ser una nueva y poderosa estrategia para dirigirse a las células cancerosas o para aumentar quimioterapéuticos de cáncer existentes 28. Por desgracia, un pocarpa inhibidor reversible PAD4 aún no se ha descubierto. Una serie de inhibidores covalentes se han desarrollado utilizando la / mango imidina flúor cloro que imita el sustrato arginina 27,29,30 y han demostrado ser herramientas prácticas para comprender el papel de PAD4 tanto en las células sanas y enfermas estatales. Sin embargo, estas moléculas inhiben todos los PAD activos con potencia similar. Por lo tanto, la necesidad de un ensayo fácil de que informa sobre la actividad de PAD4 es crucial. Hasta la fecha, PAD4 ensayos se han descrito que enlazan la liberación de amoníaco a partir de la reacción a una lectura colorimétrica 31, utilizar un análogo de sustrato chloroamidine marcado con fluorescencia para el ensayo de polarización de fluorescencia 32, se basan en la reacción de ácido asistida entre glioxal y citrulina 33, y par la actividad PAD4 a una fluorescencia desatenuación paso 34. De estos, sólo la estrategia haloacetamidine modificador covalente ha demostrado ser compatible con scre de alto rendimientoplataformas Ening 32,35,36. Se describe un ensayo basado en la fluorescencia superficial que mide de forma fiable la actividad de PAD4. El ensayo, que muestra una fuerte relación señal-ruido, la velocidad de análisis, y la robustez de la medición, tiene el potencial de descubrir un inhibidor de PAD4 verdaderamente potente y selectivo.

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Protocolo

1. PAD4 Transformación, Expresión y Purificación

  1. Para PAD4 Transformación, transformar el plásmido pGEX que contiene GST fusión PAD4 en E. químicamente competente Coli (BL21 (DE3)) las células para la expresión de proteínas utilizando el siguiente procedimiento. Preparar (cloruro de calcio) químicamente competente E. Células de E. coli (BL21 (DE3)) de acuerdo con protocolos estándar.
    1. Descongelar 50 l de preparado previamente químicamente competentes BL21 (DE3) células en hielo y se mezcla con 1 l de la plásmido pGEX que contiene el gen PAD4 en un tubo de cultivo de 5 ml. Incubar la mezcla en hielo durante 10 min mientras se agitaba suavemente cada 2 min.
    2. Choque térmico de las células mediante la colocación de la mezcla en un baño de agua de 42 ° C durante 40 segundos. Inmediatamente colocar la mezcla de células-plásmido de nuevo en hielo durante 2 min para permitir que las células se recuperen. Añadir 1 ml de caldo LB estéril a la mezcla y colocar en hielo durante 1 min.
    3. Incubar el calor conmocionado células a 37 ° C, agitando a 250 rpm durante 1hora Pipetear 75 l de las células transformadas en una placa de agar resistente a la ampicilina y se incuba a 37 ° C durante 15 hr. Placa Almacenar a 4 ° C.
  2. Expresión PAD4.
    1. Escoja 1 colonia de células BL21 (DE3) de la placa de agar ampicilina y lugar en 5 ml de LB que contienen ampicilina 1x. Colocar en incubadora y agitar O / N a 37 ° C.
    2. La transferencia de los 5 ml de LB (arranque) en 1 L de LB estéril que contiene trihidrato de ampicilina 1x (MW 403.45 g / mol). Place crecimiento en un incubador con agitación 37 ° C. Supervisar el OD 600 del crecimiento. Cuando el crecimiento llega a un OD 600 de 0,3, mueva el crecimiento en 16 ° C agitando incubadora.
    3. Al llegar a un OD 600 de 0,6, inducir a las células con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238.30 g / mol). Permitir que las células se dan durante 15 horas a 16 ° C.
    4. Las células de la cosecha por centrifugación a 4000 xg durante 20 min a 0 ° C. Retirar el sobrenadante y tienda de pellets a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificación
    1. Vuelva a suspender el sedimento que contiene el PAD4 expresado en BL21 (DE3) las células en un tampón de 50 mM de NaCl (PM 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119,98 g / mol), 10 mM de imidazol (MW 68.077 g / mol), 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174.94 g / mol) y ditiotreitol 1 mM (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisar las células a través de sonicación durante 15 min a 4 ° C. Después de la sonicación, centrifugar el lisado celular a 20.000 xg durante 20 min a 0 ° C. Retirar y guardar el sobrenadante. Lotes del sobrenadante con el glutatión (GSH) perlas de agarosa durante 30 min a RT.
    3. Escurrir sobrenadante de GST cuentas / columna a través de la gravedad. Lavar los granos con 4 x 25 ml de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH = 8,0) a TA.
    4. Eluir PAD4 con 2 x 10 ml de tampón de elución, tris 50 mM (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121.14 g / mol), glutatión 10 mM (GSH, MW 307.32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concéntrese PAD4 usando 100k MW corte-otubos de centrífuga ff y centrifugar a 4000 xg durante 20 min a 4 ° C. Alícuota de proteínas en 200 l volúmenes de 1,0 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.

2. Preparación de las soluciones de archivo para tampones

  1. Pesar de cloruro de sodio (NaCl, MW 58,44 g / mol) y preparar una solución 2 M. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  2. Pesar Tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121.14 g / mol) y preparar una solución 2 M, pH = 8,0. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  3. Pesar dihidrato de cloruro de calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) y preparar una solución de 500 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  4. Pesar Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, MW 250.19 g / mol) y preparar una solución de 200 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C.
  5. Pesar ditiotreitol (DTT, PM 154,25 g / mol) y preparar una solución de 1 M. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C.
  6. Prepararuna solución al 0,5% de Triton X-100.
  7. Pesar el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, MW 292.24 g / mol) y preparar una solución de 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  8. Pesar Z- Arg Arg 7- amido 4- metilcumarina clorhidrato (ZRcoum, MW 621.69 g / mol) y preparar una solución 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).

3. Ensayo PAD4 a 37 ° C

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 125 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 125 mM ZRcoum será Solución A.
  2. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12.5 mM CaCl 2, DTT 6,25 mM, y 5 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, y 6,25 mM TDT (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y almacenar a -20° C. Este será Solución D.
  5. Obtener una placa de 96 pocillos y designar un número de pozos para los controles (sin PAD4) y ​​pocillos de ensayo (+ PAD4).
  6. Pipetear 160 l de solución B en los pocillos de ensayo y pipeta de 160 l de solución C en los pocillos de control. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C.
  7. Pipetear 40 l de la solución A en todos los pocillos y se incuba a 37 ° C durante 45 min.
  8. Pipeta de 10 l de dH 2 O a la mitad de los pozos de control y la mitad de los pozos de prueba. Para la otra mitad de los pocillos de control y los controles de ensayo, pipetas de 10 l de solución de D. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
  9. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

4. Ensayo PAD4 a TA

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 50 mM de ZRcoum en agua. Esta solución ZRcoum 50 M será Solución A.
  2. Preparar un tampón de Na 100 mMCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% de Triton X-100, y 8 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, y 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Este será Solución D.
  5. Obtener una placa de 384 pocillos y designar pozos para los controles (sin PAD4) y ​​pozos de prueba (+ PAD4).
  6. Pipetear 25 l de solución B en los pocillos de ensayo y pipeta de 25 l de solución C en los pocillos de control. Permitir tampón con / sin PAD4 incubar en los pocillos durante 20 min a RT.
  7. Pipeta 25 l de solución C en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  8. Pipeta de 10 l de dH 2 O a la mitad de los pozos de control y la mitad de los pozos de prueba. Para la otra mitad de los pocillos de control y controles de prueba, pipeteee 10 l de solución de D. Incubar a TA durante 10 min.
  9. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

5. PAD4 Tiempo Ensayos del curso a 37 ° C y RT

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 125 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 125 mM ZRcoum será Solución A.
  2. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12.5 mM CaCl 2, DTT 6,25 mM, y 5 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Esta será la solución C.
  4. Obtener 2 placas de 96 pocillos y pipeta de 160 l de solución B en # cantidad de pozos (# de pozos dependerá de cuántos puntos de tiempo).
  5. Incubar una placa de 96 pocillos a 37 ° C. Incubar la otra placa de 96 pocillos a TA.
  6. Pepitaette 40 l de la solución A en todos los pocillos en ambas placas de 96 pocillos e inmediatamente pipeta de 10 l de solución de C en los pocillos t = 0 min. Continuar la adición de 10 l de solución de C en los puntos de tiempo específicos hasta que todos los pozos han sido templado.
  7. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

6. PAD4 ensayo de inhibición a RT

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 83 mM de ZRcoum en agua. Esta solución ZRcoum 83 M será Solución A.
  2. Pesar Cl-amidina (MW 424.8 g / mol) y preparar una solución madre 100 mM. Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% de Triton X-100, y 8 M PAD4 (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, y 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thes que será la solución D.
  5. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Este será Solución E.
  6. Obtener una placa de 384 pocillos y designar pozos para los controles (sin PAD4), pozos de prueba (+ PAD4), y pozos de inhibición (PAD4 + Cl-amidina).
  7. Pipetear 25 l de solución C en los pocillos de ensayo y pipeta de 25 l de solución D en los pocillos de control. Permitir tampón con / sin PAD4 incubar en los pocillos durante 20 min a RT.
  8. Pipeta de 10 l de solución B en pozos de inhibición y se incuban durante 20 minutos a Rte.
  9. Pipeta 15 l de solución A en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  10. Pipetear 10 l de solución E a todos los pocillos. Incubar a TA durante 10 min.
  11. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

7. Ensayo de lisado celular brutoa TA

  1. Después de cosechar las células de crecimiento PAD4 1 L, Resuspender las células en 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174.94 g / mol) y ditiotreitol 1 mM (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lisar las células a través de sonicación durante 15 min a 4 ° C. Se centrifuga el lisado celular a 20.000 xg durante 20 min a 0 ° C. Se concentra el sobrenadante claro a la mitad del volumen mediante centrifugación a 4000 rpm a 4 ° C utilizando 100k MW tubos de centrífuga de corte.
  3. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 250 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 250 mM ZRcoum será Solución A.
  4. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, y 2 mM TCEP (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  5. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Esta será la solución C.
  6. Obtener una placa de 384 pocillos negro y diseñocomió pozos para los controles (sin lisado celular) y pocillos de ensayo (+ lisado celular).
  7. Pipetear 100 l de solución B en todos los pozos y las pipetas de 60 l de lisado celular en los pocillos de ensayo. Incubar durante 20 min a TA.
  8. Pipeta 40 l de solución A en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  9. Pipetear 10 l de la solución C a todos los pocillos. Incubar a TA durante 10 min.
  10. Obtener una lectura de fluorescencia en el lector multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

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Resultados

Inicialmente, se demostró que ZRcoum puede informar sobre la actividad de PAD4 en un formato de placa de 96 pocillos. Los pocillos se incubaron con el sustrato ZRcoum y en presencia / ausencia de PAD4. Tras un período de incubación de 45 min a 37 ° C, la fluorescencia se midió con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como era de esperar, los niveles de fluorescencia se mantuvo bajo como fluoróforo en ZRcoum (o el citrulinado ZRcoum)

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Discusión

En este caso, se desarrolló con éxito un ensayo basado en fluorescencia que monitorea la actividad de PAD4. El ensayo ha demostrado ser increíblemente robusto en una serie de condiciones de alto rendimiento y también es compatible con lisados de células enteras37.

La afinidad entre las proteínas histonas y las hebras de ADN que las rodean se afloja debido a la neutralización de la carga positiva en la cadena lateral de arginina al citrulinar. Se previó que la neutralización de la ca...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Paquete de Puesta en Marcha de la Universidad de Lehigh. Agradecemos al Dr. Walter Fast por proporcionar el plásmido GST-PAD4 para la expresión de proteínas.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI)AmrescoJ106-2KGa href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Polvo blanquecino), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP902-25 http://www.fishersci.com
Isopropiltiagalactona (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
Todas las sales tampón Fisher Scientificpuede comprar a Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etcetera.
Protino Glutatión (GSH) agarosa Machery-Nagel745500.10Tienda en 4 ° C; http://www.mn-net.com/
Cloroamidina Química de las Islas Caimán 10599Tienda a -20 ° C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLa href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com
Placas MicroWell Corning/Nunclon (96 y 384)Comprar en Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control softwarewww.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com
<< de lectura de microplacas

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