PAD4 es una enzima responsable de la conversión de peptidil-arginina en peptidil-citrulina. La desregulación de la PAD4 se ha implicado en una serie de enfermedades humanas. Se describe un ensayo PAD4 basado en fluorescencia fácil y compatible con alto rendimiento.
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Artículo de método
Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia
En este artículo
Resumen
Resumen
Las modificaciones postraduccionales pueden conducir a estados funcionales de proteínas alterados al aumentar las variaciones covalentes en las cadenas laterales de muchos sustratos proteicos. Las colas de histonas representan uno de los tramos más modificados dentro de todas las proteínas humanas. Se ha demostrado que la peptidil-arginina deiminasa 4 (PAD4) convierte los residuos de arginina en el residuo de citrulina no codificado genéticamente. Pocos ensayos descritos hasta la fecha han sido operacionalmente fáciles y con una sensibilidad satisfactoria. Por lo tanto, es probable que la falta de ensayos adecuados haya contribuido a la ausencia de inhibidores potentes de la PAD4 no covalentes. En este trabajo se describe un nuevo ensayo basado en fluorescencia que permite monitorizar la actividad de PAD4. Se diseñó un análogo de sustrato profluorescente para vincular la actividad enzimática de PAD4 con la liberación de fluorescencia tras la adición de la proteasa tripsina. Se demostró que el ensayo es compatible con condiciones de cribado de alto rendimiento y tiene una fuerte relación señal-ruido. Además, el ensayo también se puede realizar con lisados de células crudas que contienen PAD4 sobreexpresada.
Introducción
Un gran número de proteínas de mamíferos son muy modificada por la acción de enzimas después de la biosíntesis de proteínas por el ribosoma. Estas modificaciones post-traduccionales (PTMs) pueden aumentar en gran medida la diversidad funcional del proteoma cambiando el tamaño, carga, estructura y estado de oligomerización (entre otras características) de las proteínas 1-3. Como resultado, el cambio en la estructura de la proteína puede conducir a consecuencias fisiológicas, tales como la degradación de proteínas, la diferenciación celular, la señalización, la modulación en la expresión génica, y las interacciones proteína-proteína. Mientras que estas modif....
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Protocolo
1. PAD4 Transformación, Expresión y Purificación
- Para PAD4 Transformación, transformar el plásmido pGEX que contiene GST fusión PAD4 en E. químicamente competente Coli (BL21 (DE3)) las células para la expresión de proteínas utilizando el siguiente procedimiento. Preparar (cloruro de calcio) químicamente competente E. Células de E. coli (BL21 (DE3)) de acuerdo con protocolos estándar.
- Descongelar 50 l de preparado previamente químicamente competentes BL21 (DE3) células en hielo y se mezcla con 1 l de la plásmido pGEX que contiene el gen PAD4 en un tubo de cultivo de 5 ml. Incubar la mezcla en hielo durante 10 min....
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Resultados
Inicialmente, se demostró que ZRcoum puede informar sobre la actividad de PAD4 en un formato de placa de 96 pocillos. Los pocillos se incubaron con el sustrato ZRcoum y en presencia / ausencia de PAD4. Tras un período de incubación de 45 min a 37 ° C, la fluorescencia se midió con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como era de esperar, los niveles de fluorescencia se mantuvo bajo como fluoróforo en ZRcoum (o el citrulinado ZRcoum)
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Discusión
En este caso, se desarrolló con éxito un ensayo basado en fluorescencia que monitorea la actividad de PAD4. El ensayo ha demostrado ser increíblemente robusto en una serie de condiciones de alto rendimiento y también es compatible con lisados de células enteras37.
La afinidad entre las proteínas histonas y las hebras de ADN que las rodean se afloja debido a la neutralización de la carga positiva en la cadena lateral de arginina al citrulinar. Se previó que la neutralización de la ca.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Paquete de Puesta en Marcha de la Universidad de Lehigh. Agradecemos al Dr. Walter Fast por proporcionar el plásmido GST-PAD4 para la expresión de proteínas.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | a href="http://www.amresco-inc.com/">http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Polvo blanquecino), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropiltiagalactona (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| Todas las sales tampón | Fisher Scientific | puede comprar a Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etcetera. | |
| Protino Glutatión (GSH) agarosa | Machery-Nagel | 745500.10 | Tienda en 4 ° C; http://www.mn-net.com/ |
| Cloroamidina | Química de las Islas Caimán | 10599 | Tienda a -20 ° C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com |
| Placas MicroWell Corning/Nunclon (96 y 384) | Comprar en Corning; Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control software | www.tecan.com | ||
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | http://www.perkinelmer.com |
Referencias
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell ....
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Reimpresiones y permisos
