El análisis in vitro de la respuesta inmune celular Myd88 mediada por el Virus del Nilo Occidental cepa mutante Infección

Resumen

Se utilizaron dos métodos basados en citometría de flujo: un ensayo de cebado de células T in vitro y una tinción de citocinas intracelulares para medir la capacidad de presentación de antígenos de las células dendríticas y las respuestas de las células T específicas de antígeno a una infección mutante por el virus del Nilo Occidental en ratones.

Resumen

Un virus atenuado del Nilo Occidental (VNO), una no estructural (NS) 4B-P38G mutante, inducida por citoquinas superior innata y respuestas de células T que la de tipo salvaje WNV en ratones. Recientemente, factor de diferenciación mieloide 88 (MyD88) de señalización ha demostrado ser importante para el cebado de células T inicial y el desarrollo de células T de memoria durante WNV NS4B-P38G infección mutante. En este estudio, dos métodos basados ​​en citometría de flujo-- un ensayo in vitro de células T en el cebado y una tinción intracelular de citoquinas (ICS) - se utilizaron para evaluar las células dendríticas (DCs) y funciones de células T. En el ensayo de cebado de células T, la proliferación celular se analizó mediante citometría de flujo después de co-cultivo de DCs de ambos grupos de ratones con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) - marcado células T CD4 ⁺ de ratones transgénicos otii. Este enfoque proporciona una determinación exacta del porcentaje de proliferación de células T CD4 ⁺ con mejorado significativamente la sensibilidad general que la tradiciónal ensayos con reactivos radiactivos. Un sistema de tubo de microcentrífuga se utilizó en ambos procedimientos de cultivo celular y tinción de citocinas del protocolo ICS. En comparación con el sistema tradicional basado en la placa de cultivo tisular, este procedimiento modificado fue más fácil de realizar en el nivel de bioseguridad (BL) 3 instalaciones. Por otra parte, las células infectadas WNV- fueron tratados con paraformaldehido en ambos ensayos, lo que permitió su posterior análisis fuera de las instalaciones BL3. En general, estos ensayos inmunológicos in vitro se pueden utilizar para evaluar de manera eficiente las respuestas inmunes mediadas por células durante la infección WNV.

Introducción

Virus del Nilo Occidental (VNO), una neurotrópico, plus-detectados flavivirus, es una amenaza emergente para la salud pública. Actualmente, no hay vacunas han sido aprobados para uso humano ^1. Una cepa atenuada de virus del Nilo Occidental, que tiene una sustitución en el P38G no estructural (NS) proteína 4B, se sabe que inducen no letalidad en ratones, pero citoquinas innatas superior y respuestas de células T en ratones de tipo salvaje que WNV NY99 cepa ^2. Los ratones inmunizados con el mutante NS4B-P38G fueron protegidos de un desafío secundario con letal de tipo salvaje WNV. Esto sugiere que el mutante NS4B-P38G tiene características adecuadas para un candidato a vacuna ideal. Los mecanismos por los que el mutante NS4B-P38G induce una alta inmunidad adaptativa protectora aún no se conocen del todo. Los receptores tipo Toll (TLRs), que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos, juegan un papel esencial en la iniciación de la inmunidad innata a la infección viral. La vía de señalización TLR núcleo utiliza respuesta primaria de diferenciación mieloide gene 88 (MyD88) como adaptador principal ^3,4. En un estudio reciente, la señalización de MyD88 ha demostrado desempeñar un papel importante en el desarrollo de la inmunidad mediada por células durante la infección por WNV NS4B- P38G mutante en ratones ^5. Células dendríticas (DC) son una de las células presentadoras de antígenos más importantes que presentan la capacidad única de iniciar respuestas de células T durante la infección viral primaria ^6,7. Las células T CD4 ⁺ y CD8 ⁺ tanto contribuyen a la inmunidad protectora de larga duración y son importantes para la supervivencia de host seguido de tipo salvaje infección por el VNO ^8,9. Dos ensayos inmunológicos se utilizaron en este estudio para evaluar las funciones de estas células en el mutante ratones infectados NS4B-P38G.

En primer lugar, un ensayo de cebado de células T in vitro se utilizó para comparar la capacidad presentadora de antígeno de las DC de WNV-infectados de tipo salvaje y MyD88 ^{- / -} ratones. Para aumentar la sensibilidad del ensayo, ingenuo CD4 ^{+ células T se aislaron de otii ratones transgénicos, que expresan una específica Vα2 / Vβ5 TCR para el péptido ovoalbúmina de pollo (OVA) 323 - 339. DCs de los ratones infectados de WNV se purificaron, y co-cultivadas con carboxifluoresceína succinimidil Pascua (CFSE ) las células T CD4 + -etiquetados en presencia de péptido OVA. Después de 5 días de co-cultivo, las células se recogieron y se fijaron con paraformaldehído (PFA) y se analizaron por citometría de flujo. Los ensayos de proliferación se han realizado tradicionalmente a través de la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) o desoxirribósido timina tritiada (3HTdR) 10. Sin embargo, estos ensayos son o radiactivo y / o en la necesidad de equipos especiales en el nivel de bioseguridad (BL) 3 instalaciones, donde se llevan a cabo estudios de WNV. El análisis de citometría de flujo de la proliferación de linfocitos por reducción a la mitad de serie de la intensidad de fluorescencia del colorante vital CFSE se ha vuelto más comúnmente utilizado en ensayos inmunológicos como el colorante es más establey uniformemente incorporados en las células, fácilmente detectado por citometría de flujo, y es no radiactivo 11. El ensayo también tiene la capacidad de evaluar el número de divisiones celulares. Una ventaja importante de usar este ensayo en los estudios de virus del Nilo Occidental es que la fijación de las células infectadas con 1-2% PFA podría inactivar WNV 12, lo que permitirá la adquisición de muestras con un citómetro de flujo en un laboratorio BL2.}

A continuación, se utilizó un procedimiento de tinción intracelular de citoquinas modificado (ICS) para estudiar el papel de MyD88 de señalización en la regulación de las respuestas de células T específicas de VNO en ratones mutantes infectados NS4B-P38G. En este ensayo, los esplenocitos aislados de ratones infectados fueron tratados in vitro con péptidos específicos del WNV. Brefeldina A se añadió a retener las citoquinas dentro de la célula. Después de 5 horas de incubación, las células se recogieron, se lavaron y se tiñeron para subconjuntos de células T. Las células fueron fijadas en PFA, permeabilizaron y se tiñeron para el interferón (IFN) -γ y se analizaron por citometría de flujo.Como con otro ensayo basado en citometría de flujo, una vez que las células se tratan con la fijación y permeabilización de amortiguación que contiene PFA, muestras infectadas pueden ser transferidos a un laboratorio BL2 para su posterior procesamiento y análisis. En varios estudios publicados, hemos utilizado ICS para medir las funciones efectoras de células T en ratones infectados con el VNO ^13,14. Aunque está bien establecido, una desventaja importante de este ensayo es que el procedimiento es muy largo y podría ser más tiempo cuando se realiza dentro de las instalaciones BL3. Aquí, un método basado en ICS tubo de microcentrífuga se demostró que era más factible, más fácil de proceder y consume menos tiempo cuando se realiza dentro de un laboratorio BL3.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas Medical Branch.

1. Aislamiento de países en desarrollo de ratones y no infectados infectado con el VNO

1. Partido por edad y sexo 6-10 semanas de edad, de tipo salvaje C57BL / 6 (B6) y MyD88 ^{- / -} ratones. Inocular por vía intraperitoneal (ip) con 500 formando la placa unidad (PFU) de WNV NS4B- P38G mutante. En el día 3 después de la infección, la eutanasia B6 y MyD88 ^{- / -} ratones con CO _2. Utilice los ratones no infectados de ambos grupos como los controles. Utilice tres ratones de cada grupo.
2. Marino mojado en el lado izquierdo del ratón sacrificado utilizando etanol al 70% y cortar la piel a lo largo del lado izquierdo del ratón, a mitad de camino entre la patas delanteras y traseras. Cortar abrir la cavidad del cuerpo. Retirar el bazo utilizando las pinzas. Coloque el bazo en una placa de Petri con medio RPMI.
3. Aislar esplénicos DCs mediante el uso de perlas magnéticas anti-CD11c segúnlas instrucciones del fabricante.

2. Purificación y Etiquetado de las células T de ratones transgénicos otii

1. Cosecha un bazo de un ratón otii ingenuo como se describe en el paso 1.2 anterior y homogeneizar el bazo entre los extremos helados de dos diapositivas. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, se añade medio RPMI hasta 14 ml. Deje reposar la suspensión durante 5 min y transferir 13 ml de ella a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
2. Aislar células T CD4 ⁺ esplénicas mediante el uso de un kit de aislamiento de células T CD4 ⁺ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. La transferencia de células en un tubo cónico de 50 ml, se lavan dos veces con PBS. Resuspender las células en PBS con albúmina de suero bovino al 0,5% (BSA) a 1 x 10 ⁶ células por ml, y añadir 0,5 mol / ml de CFSE. Incubar a 37 ° C durante 10 min, protegido de la luz.
4. Añadir 5 ml de medio completo frío (RPMI-1640 con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 1/100 volantibióticos / antimicóticos, 1/100 vol L-glutamina y 1 / 1.000 vol de 1000 x 2-mercaptoetanol).
5. Incubar en hielo durante 5 min. Lavar las células una vez con PBS, fijan 0,2 x 10 ⁶ células T CD4 ⁺ etiquetados en 2% PFA y adquieren en un citómetro de flujo. Utilice esta muestra para determinar el nivel basal de CFSE. Vuelva a suspender el resto de las células marcadas en medio completo.

3. Co-cultura otii células T con los países en desarrollo de ratones infectados con el WNV

1. Cultura 2 x 10 ⁵ células T CD4 ⁺ purificadas de ratones otii solos o con purificados los DC de tipo salvaje o MyD88 ^{- / -} ratones (2 x 10 ⁴⁾ en una placa de 24 pocillos con o sin OVA residuos 323-339 (1 g / ml) en 1 ml de medio completo por pocillo.
2. Se incuban las células a 37 ° C durante 5 días. Las células de la cosecha, se lavan dos veces en tampón FACS (PBS con 1% de SFB) y fijan en 0,25 ml de 2% PFA. Vortex inmediatamente.

4. Análisis de citometría de flujo in vitro </ Em> de células T de cebado

1. Para la adquisición, haga doble clic en el icono del software de citometría de flujo. Para un gráfico de densidad lineal de FSC-A vs lineal SSC-A, seleccionar canales de 0 a 200 mil en FSC-A y de 0 a 200 mil en SSC-A. A continuación, crear una puerta en células vivas (P2; véase la Figura 1A).
2. Para analizar la intensidad de fluorescencia de CFSE, abra el histograma del canal FL1 y adquirir 20.000 eventos en la población cerrada. Establecer un marcador en muestras de células otii cultivadas solas (Figura 1A).
3. Adquirir muestras para células otii co-cultivadas con DCs de tipo salvaje (Figura 1B) o MyD88 ^{- / -} DCs (Figura 1C) de una manera similar.

5. Aislamiento y estimulación de esplenocitos de citoquinas Ensayos

1. Infect B6 y MyD88 ^{- / -} ratones con WNV NS4B-P38G mutante utilizando el mismo procedimiento como se describe en step 1,1. En el día 30 después de la infección, re-desafío de sobrevivir ratones con 2000 UFP de la de tipo salvaje cepa WNV ip En los días 8 y 21 de infección por el VNO post-primaria o en el día 4 después de la infección secundaria, eutanasia ratones con CO ₂ para la recolección de bazos .
   NOTA: Se utilizó 2-3 ratones por grupo para cada punto de tiempo.
2. Hacer una suspensión de células de esplenocitos como se describe anteriormente en el paso 1.2 y paso 2.2. Contar las células usando un hemocitómetro y re-suspender en 10 ml de medio completo.
3. Diluir las células con medio completo a 2,5 x 10 ⁶ células / ml. Añadir 1 ml de esplenocitos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Para simular las células T CD8 ^+, diluir NS4B y E-WNV péptidos específicos (SSVWNATTA y IALTFLAV) a 1 mg / ml en DMSO. Para la estimulación de las células T CD4 ^+, diluir NS3 y péptidos E-WNV específica (RRWCFDGPRTNTILE y PVGRLVTVNPFVSVA) a 1 mg / ml en DMSO. Añadir 10 l de péptidos a las células followed por 1 l de solución de Brefeldina A. Utilice células sin péptidos tratamiento como controles. Mezclar las células.
5. Haga dos agujeros con un 18 G aguja en el tapón del tubo. Se incuban las células a 37 ° C durante 5 horas.

6. intracelular de citoquinas tinción

1. La transferencia de células a un nuevo tubo de microcentrífuga. Haga girar las células durante 5 minutos a 300-400 xg y verter el líquido sobrenadante. Añadir 1 ml de tampón FACS, vuelta 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células mediante pipeteo con 120 l de tampón FACS.
2. Añadir 2 l Fc bloqueador de células y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir 1 ml de tampón FACS a cada tubo. Girar 5 min a 300-400 x g.
3. Vuelva a suspender las células en 300 l de tampón FACS y dividirlos en tres tubos (alrededor de 0,8 x 10 ⁶ células por tubo). Como se muestra en la Tabla 1, reservar el primer tubo de cada condición de cultivo para la rata tinción de IgG-PE. Para el segundo tubo, añadir 3 l de anti-CD4 APC a las células CD4-péptidos tratados, 3 μl de anti-CD8 FITC a las células tratadas con péptidos CD8 o ambos anticuerpos a las células sin tratamiento péptidos. Utilice el tercer tubo para la tinción de compensación. Para cada condición de cultivo, utilizar tres tubos de células teñidas con APC-conjugado CD4, CD8 conjugado con FITC o PE anticuerpos marcados CD3 solos (3 l por tubo) como controles de compensación para FL1, FL2 y canales FL4.
4. Células Vortex brevemente. Deja en hielo durante 20 min y protegerlo de la luz. Añadir 1,4 ml de tampón FACS. Haga girar 5 min a 300-400 xg y verter el líquido sobrenadante.
5. Agitar para interrumpir sedimento celular (o vórtice brevemente). Vuelva a suspender sedimento de células en 250 l de fijación / permeabilización solutionby pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min y proteger de la luz.
6. Añadir 1,2 ml de tampón FACS. Girar 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células en tampón FACS 300 l.
   NOTA: En este punto, las células se pueden transferir a un laboratorio BL2 para su posterior procesamiento o almacenado en un refrigerador y protegido de la luz para up a tres días.
7. Añadir 500 l de tampón FACS. Girar 5 min a 300-400 xg y volver a suspender las células en 500 l de tampón de permeabilización / lavado 1x. Girar 5 min a 300-400 x g.
8. Células en 100 l 1x Perm / Wash Vuelva a suspender, añadir 3,5 l anti-IFN-PE al tubo previamente adicionado con anticuerpos para CD4 y / o marcadores de células T CD8 en el paso 6.3 y 3.5 l rata IgG-PE en el tubo reservados para el control de IgG durante 25 minutos en hielo y protegerlo de la luz. Lavar las células mediante la adición de 1,4 ml de 1x tampón de permeabilización / lavado. Girar 5 min a 300-400 x g. Repita el paso de lavado añadiendo 1.4 ml 1x tampón de permeabilización / lavado.
9. Haga girar 5 min a 300-400 xg y decantar el sobrenadante. Lavar las células mediante la adición de 1,4 ml de tampón FACS y re-suspender en 400 l de tampón FACS para la adquisición final.

7. Análisis de citometría de flujo intracelular de citoquinas tinción

1. Utilice la misma configuración de adquisición como en el paso 4.1. Create una puerta en células vivas (P2; ver Figura 2A). Ajuste los voltajes que utilizan los tubos de compensación para cada grupo.
2. Abra dos nuevos gráficos de puntos, uno para mostrar los datos recogidos para FL1 frente. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), y el otro es para mostrar los datos recopilados para FL4 vs. FL2 (CD4 vs. IFN-γ). Adquirir 50.000 eventos para la población privada de cada muestra.

Resultados

En el ensayo de células T de cebado, las células T CD4 ⁺ CFSE etiquetados fueron cultivadas con DCs purificados a partir del mutante infectados de tipo salvaje NS4B-P38G y MyD88 ^{- / -} ratones en la presencia o ausencia de péptidos OVA. Células T marcadas cultivadas solas con o sin OVA se utilizaron para 5 días como controles negativos. Como se muestra en la Figura 1A, las células T totales fueron cerrada para el análisis de la intensidad de fluorescencia en el canal FL1. El marcado...

Discusión

WNV es un patógeno BL3. Debido a las regulaciones de seguridad, ensayos inmunológicos con muestras infectadas con el VNO son a menudo limitadas por la disponibilidad de equipos en BL3 instalaciones o más largo y tedioso de realizar. En un estudio reciente, se utilizaron dos métodos basados ​​en la citometría de flujo para estudiar respuestas inmunitarias celulares durante la infección por VNO ^5. En ambos ensayos, las células infectadas con el VNO fueron tratados con 2.1% PFA directa o con una solución de fija...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Invitrogen	11875	calentar a 37 ° C
perlas magnéticas anti-CD11c	Miltenyi Biotec	130-052-001	seguir el fabricante' s instrucciones
anti-CD4 perlas magnéticas	Miltenyi Biotec	130-095-248	seguir las instrucciones del fabricante s instrucciones
CFSE	Invitrogen	C34554
Residuo de OVA 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Péptidos	Proinmunes	PC0AD-D
Brefeldin A solución	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
CD4	conjugado con APCe-Bioscience	17-0041-81
CD8 conjugado por FITC	e-Bioscience	11-0081-82
Solución de fijación/permeabilización	BD-Bioscience	554722
Tampón de permeabilización/lavado	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Citómetro de flujo Accuri	BD Biociencia