Detección de In Situ Complejos proteína-proteína en la Drosophila Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Resumen

Este protocolo demuestra cómo la proximidad Ligadura ensayo se puede usar para detectar in situ en las interacciones proteína-proteína en la unión neuromuscular Drosophila larval. Con esta técnica, los discos grandes y Hu-li shao tai se muestra para formar un complejo en la región postsináptica, una asociación identificado previamente a través de co-inmunoprecipitación.

Resumen

Discos grandes (Dlg) es un miembro conservado de la familia de las guanilato quinasas asociadas a la membrana, y sirve como una importante proteína de andamiaje en la unión neuromuscular de las larvas (NMJ) en Drosophila. Estudios previos han demostrado que la distribución postsináptica de Dlg en la NMJ larvaria se superpone con la de Hu-li tai shao (Hts), un homólogo de las aducinas de los mamíferos. Además, se observa que Dlg y Hts forman un complejo entre sí sobre la base de experimentos de coinmunoprecipitación con lisados de moscas adultas completas. Sin embargo, debido a la naturaleza de estos experimentos, se desconocía si este complejo existía específicamente en el NMJ durante el desarrollo de las larvas.

El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) es una técnica recientemente desarrollada que se utiliza principalmente en cultivos celulares y de tejidos y que puede detectar interacciones proteína-proteína in situ. En este ensayo, las muestras se incuban con anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés mediante procedimientos inmunohistoquímicos estándar. A continuación, los anticuerpos primarios se detectan con un par especialmente diseñado de anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos, denominados sondas PLA, que sólo pueden utilizarse para generar una señal cuando las dos sondas se han unido muy cerca una de la otra. Así, se pueden visualizar las proteínas que están en un complejo. Aquí, se demuestra cómo se puede utilizar el PLA para detectar interacciones proteína-proteína in situ en la NMJ larvaria de Drosophila. La técnica se realiza en preparaciones musculares de la pared corporal de las larvas para mostrar que existe un complejo entre Dlg y Hts en la región postsináptica de las NMJ.

Introducción

Drosophila discos grandes (DLG) es un miembro conservada de la guanilato quinasa de la familia asociada a la membrana de andamios proteínas que ayudan a orquestar el ensamblaje de complejos de proteínas grandes en sitios específicos de la membrana plasmática. Originalmente identificado como una proteína supresora de tumores, Dlg sirve como un determinante importante de la polaridad epitelial ^1,2,3 apicobasal. Dlg también sirve como un módulo de andamio importante en la unión neuromuscular (NMJ) de las neuronas motoras glutamatérgicas durante el desarrollo larvario ^4. Dlg juega diversos papeles en la larval NMJ, y su pleiotropism se basa en su capacidad para asociarse con múltiples proteínas de ^5,6. Una de estas proteínas es shao Hu-li tai (HTS), un homólogo de los mamíferos adducins que principalmente se han descrito en lo que respecta a sus funciones en la regulación de la actina-espectrina citoesqueleto ^7. Previamente se ha demostrado que Dlg y Hts pueden formar un complejo con el uno al otro sobre la base de in vitro experimentos de co-inmunoprecipitación que participe toda adultos lisados ​​mosca ^8. Una deficiencia de estos resultados, sin embargo, es que no indican donde este complejo formas. Con el uso de inmunohistoquímica, se observan las distribuciones de Dlg y Hts a superponerse en la membrana postsináptica de NMJs larvas, pero son en un complejo en esta región ^8? Como se muestra recientemente y se detalla más adelante aquí, ligadura de ensayo de proximidad (PLA) se utiliza para buscar una en asociación situ entre Dlg y Hts específicamente en el larval NMJ ^27.

PLA es una técnica relativamente nueva se utiliza principalmente en las células y el tejido cultural que puede detectar interacciones proteína-proteína in situ ^9. En este ensayo, los anticuerpos primarios contra las dos proteínas de interés se detectan con un par de anticuerpos secundarios específicos de especie, denominados sondas de PLA, que están conjugados a oligonucleótidos (Figura 1A, B). Si la proteína de doss están muy cerca entre sí (es decir, dentro de unas pocas decenas de nanómetros), la distancia entre las sondas PLA adjuntos puede salvarse a través de la hibridación de dos oligonucleótidos de conectores adicionales (Figura 1C). En esta conformación, los extremos libres de los oligonucleótidos de conector son lo suficientemente cerca para hacer contacto uno con otro, y una molécula de ADN circular cerrado se pueden formar sobre la ligadura en situ (Figura 1D). La molécula de ADN circular sirve como una plantilla para in situ amplificación por círculo rodante, que se prepara por uno de los oligonucleótidos conjugados con las sondas PLA (Figura 1E). Las secuencias dentro de la amplificado, producto de ADN resultante concatemeric entonces se pueden visualizar con, sondas de oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia (Figura 1f). Dado que el ADN amplificado permanece unida a una de las sondas de PLA, la localización subcelular de la interacción proteína-proteína withitejido na puede determinarse fácilmente.

Varios métodos se usan comúnmente para detectar interacciones proteína-proteína incluyendo técnicas in vitro tales como co-inmunoprecipitación, ensayos de pull-down y la levadura de dos híbridos, y en técnicas in vivo tales como Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) y bimolecular de fluorescencia de Complementación ( BiFC). Un error de las técnicas in vitro es que no se identifican donde la interacción se produce de manera endógena, mientras que la mencionada en técnicas in vivo implican la expresión de proteínas de fusión artificial que puede no reflejar el comportamiento natural de sus homólogos endógenos. Una ventaja importante de PLA es que es capaz de determinar dentro de un tejido la localización subcelular de interactores de proteínas endógenas que se encuentran en estrecha proximidad entre sí y probablemente formando un complejo, con el grado de cercanía requerido para generar una señal comparable a FRET y BiFC. PLA puede detectar interacciones con alta especificidad y sensibilidad debido al acoplamiento de reconocimiento de anticuerpos y la amplificación de ADN. Por lo tanto, el ensayo puede generar, señales luminosas discretas en forma de puntos lagrimales que revelan la posición exacta de la interacción. Además, los antígenos apenas visibles pueden ser detectados. Finalmente, PLA es una técnica relativamente sencilla de realizar, y ya no tiene que un procedimiento inmunohistoquímico estándar para completar. Por lo tanto, PLA ofrece una ventaja técnica sobre otros ensayos de interacción proteína-proteína que a menudo se ven afectadas con largos tiempos de preparación y amplia solución de problemas.

Este protocolo se muestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos in situ. Aquí, el PLA se realiza en preparaciones de músculo de la pared corporal larvarios donde se muestran Dlg y Hts de existir de hecho en un complejo en la región postsináptica de NMJs. PLA no se ha utilizado previamente para estudiar la larval NMJ, y existen en la actualidad sólo un puñado de trabajos publicados que han utilizado este ensayo en el tejido Drosophila. Se espera que una mayor exposición de PLA a la comunidad de Drosophila se traducirá en el aumento de su uso como una herramienta adicional para complementar otros ensayos de interacción proteína-proteína más comúnmente utilizados,.

Protocolo

1. Cuerpo Preparación de la pared

NOTA: Preparación de tercer estadio larval paredes del cuerpo (para el estudio de los NMJs que inervan los músculos de la pared corporal) se realizó como se ha descrito previamente en Brent et al ^10, o Ramachandran y Budnik ^11,12, pero con algunas modificaciones..

1. Disección
   1. Elevar las existencias de moscas y cruces a 25 ° C durante cinco o seis días, utilizando procedimientos estándar ^13.
   2. Escoja arrastrándose larvas de tercer estadio de frascos o botellas utilizando unas pinzas finas.
   3. Lavar las larvas en una pequeña placa Petri que contenía tampón fosfato salino (PBS) para eliminar las partículas de comida.
   4. Coloque una sola larva en un disco Sylgard y sumergirlo en unas gotas de helado de PBS. El uso de helado de PBS ayudará aturdir la larva por lo que es más fácil de manipular. A lo largo de la disección, asegúrese de que la preparación siempre se sumerge en PBS para evitar que se seque.
   5. Coloque la larva con el lado dorsal de modo que las dos secciones traqueales son visibles bajo un microscopio de disección (Figura 2A). Usando las pinzas para agarrar un alfiler minutien, Pin de la larva hacia abajo en el extremo posterior cerca de los espiráculos (Figura 2B). Con otro pin, perforar a través de la cutícula en el extremo anterior cerca de los ganchos de la boca. Estire suavemente la larva a cabo a lo largo, entonces pin abajo (Figura 2B).
   6. Con unas tijeras de microdisección, pellizcar el extremo posterior cerca del pasador para crear una pequeña abertura. La incisión debe ser lo suficientemente superficial sólo tiene que pasar a través de la cutícula.
   7. La colocación de la punta de la cuchilla inferior de las tijeras en la incisión, corte a lo largo de toda la longitud de la línea media dorsal entre las dos secciones traqueales (Figura 2C). Señalar las cuchillas de la tijera ligeramente hacia arriba cuando se corta para evitar dañar los músculos de la pared ventral del cuerpo.
   8. Hacer una pequeña incisión horizontal ligeramente anterior al puestopin colocado eriorly (Figura 2C). Haz otra incisión similares posterior ligeramente a la aguja colocada anteriormente (Figura 2C). Las incisiones deben sólo tiene que pasar a través de la cutícula.
      NOTA: Los tres incisiones de los pasos 1.1.7 y 1.1.8 combinados debe ser similar a un " "Una vez terminado, es decir, una aleta izquierda y derecha en la parte dorsal del cuerpo de la larva debe ser producido.
   9. Limpiar cuidadosamente los órganos internos con los fórceps. Añadir unas gotas contundentes de PBS ayudará a desplazar a los órganos fuera del cuerpo de la larva, por lo que es más fácil para eliminarlos. Evite meter el cuerpo de las larvas, ya que puede causar daños en los músculos de la pared corporal.
   10. Desplegar el cuerpo larval abierta y fijar las esquinas hacia abajo (Figura 2D). Cuando fijación, estirar la pared del cuerpo, tanto horizontal como verticalmente para formar un rectángulo uniformemente tensado (see Figura 2G para la forma), teniendo cuidado de no romper los músculos de la pared del cuerpo en el proceso.
   11. Termine de retirar cualquiera de los órganos internos restantes (Figura 2E).
2. La fijación y permeabilización
   1. Sumerja las paredes del cuerpo clavado en varias gotas de solución de Bouin. Incubar durante 15 min en hielo. Como alternativa, utilice el 4% de paraformaldehído (PFA) como una solución fijadora alternativa; incubar durante 30 min.
   2. Enjuague tres veces con tampón fosfato salino con Triton (PBT).
   3. Con unas pinzas finas, retire con cuidado los pasadores y transferir las paredes del cuerpo por sus esquinas en un tubo de microcentrífuga de 0,65 ml siliconado.
   4. Guarde las paredes del cuerpo de PBT a 4 ° C hasta el momento de PLA. Para obtener resultados óptimos, comience inmunotinción las paredes del cuerpo dentro de un día o dos de disección.
      NOTA: Para ahorrar en reactivos y para asegurar que todas las paredes del cuerpo son tratados por igual durante el ensayo, diferentes genotipos se pueden colocar en una solatubo. Los genotipos se pueden distinguir por el corte de las esquinas de las paredes del cuerpo de forma diferente (véase la Figura 2F para los ejemplos).

2. La inmunohistoquímica

NOTA: La inmunotinción de tercer instar paredes del cuerpo de las larvas se realizó como se ha descrito previamente en Brent et al ¹⁴ y Ramachandran y Budnik ^11, pero con algunas modificaciones ^11,14..
NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave a menos que se indique lo contrario.

1. Bloqueo
   1. Lavar las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno.
   2. Bloque con 1% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hr.
2. Inmunoticción
   1. Incubar las paredes del cuerpo con anticuerpos de ratón y primarios de conejo contra las dos proteínas de interés (diluido en 1% de BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. En este caso, utilice 1:10 de ratón anti-Dlg y 1: 250 de conejo unnti-HtsM ^15,16. Los anticuerpos contra los marcadores que no se hacen en el ratón o conejo también se pueden incluir - por ejemplo, utilizar 1: 200 cabra anti-HRP para delinear las membranas neuronales.
   2. Lavar con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno.
   3. Incubar con anticuerpos secundarios conjugado con fluoróforo para detectar los marcadores (diluido en 1% de BSA) durante 2 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. Como la señal de PLA se visualizó más tarde con un fluoróforo rojo, otro fluoróforo debe ser utilizado para detectar el marcador - por ejemplo, usar 1: 200 anti-cabra conjugado con FITC para detectar el anticuerpo de cabra anti-Hrp. Debido a la utilización de los reactivos sensibles a la luz, mantener los tubos en la oscuridad desde este punto en adelante.
      NOTA: El kit que se utiliza para PLA permite que se realice entre los anticuerpos primarios planteadas en ratón y conejo, con la señal visualizado en el canal rojo bajo microscopía confocal. Si se desea, otros kits están disponibles que permiten que el ensayo se realiza con primaanticuerpos ry criados en otras especies, y la señal visualizaron en otros canales.

3. Proximidad Ligadura Ensayo

NOTA: Realice todos los pasos a temperatura ambiente y con agitación suave a menos que se indique lo contrario.

1. PLA Sondas
   1. Lavar las paredes del cuerpo con PBT tres veces durante 10 minutos cada uno.
   2. Incubar con sondas de PLA (dilución 1: 5 cada uno en 1% BSA) durante 2 horas a 37 ° C. En este caso, utilizar 40 l de sonda de PLA MENOS anti-ratón, 40 l de sonda de PLA anti-conejo PLUS y 120 l de BSA al 1% para asegurar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo. Hasta una dilución 01:25 de las sondas de PLA todavía puede resultar en una adecuada relación señal a ruido (es decir, para este experimento).
2. Ligadura
   1. Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado A dos veces durante 5 minutos cada uno.
   2. Incubar con solución de ligación (dilución 1:40 de ligasa en tampón de ligación) durante 1 hr unat 37 ° C. En este caso, utilizar 5 l de ligasa, 40 l de tampón de ligación y 5 155 l de agua de alta pureza para garantizar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo.
3. Amplificación
   1. Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado A dos veces durante 2 minutos cada uno.
   2. Incubar con solución de amplificación (1:80 dilución de la polimerasa en tampón de amplificación) durante 2 horas a 37 ° C. En este caso, utilizar 2,5 l de polimerasa, 40 l de tampón de amplificación 5 y 157,5 l de agua de alta pureza para garantizar la inmersión adecuado y mezcla de 5-10 paredes del cuerpo.
4. Preparación de la Imagen
   1. Lavar las paredes del cuerpo con el tampón de lavado B dos veces durante 10 minutos cada uno.
   2. Lavar con 0,01x Wash Buffer B una vez durante 1 min.
   3. Equilibrar en unas pocas gotas de solución de montaje por lo menos 30 min antes del montaje, o almacenar durante la noche a 4 ° C.
   4. Con unas pinzas finas, transferir cuidadosamente las paredes del cuerpo en un portaobjetos plataforma wITH sus cutículas hacia abajo. Coloque las paredes del cuerpo en filas y en la misma orientación dentro de una o dos gotas de medio de montaje. Coloque un 22 mm x 40 mm cubreobjetos sobre la preparación con cuidado de no generar burbujas de aire, y luego sellar la diapositiva con esmalte de uñas transparente.
   5. Guarde las diapositivas de la oscuridad a -20 ° C hasta el momento de la imagen confocal.

Resultados

En los de tipo salvaje tercer instar NMJs larvales, Dlg es predominantemente encontrar en la membrana postsináptica de boutons glutamatérgicos tipo I, con niveles de inmunorreactividad Dlg siendo más pronunciada en boutons tipo Ib que el tipo es boutons (Figura 3) ^4. Hts está presente en todo el músculo sino que se concentra en la región postsináptica con Hts niveles de inmunorreactividad aparece igual en ambos tipo I boutons, y también se encuentra presinápticamente (Figura 3A ')

Discusión

Este informe demuestra cómo PLA se puede aplicar a la Drosophila larval NMJ. El ensayo se realizó en preparaciones de músculo de la pared corporal de larvas para el propósito de la detección de interacciones proteína-proteína endógenos presentes en la NMJ. Con esta técnica, Dlg y Hts se muestran a estar en estrecha proximidad entre sí, y por lo tanto existir en un complejo, específicamente en la región postsináptica ^27. En apoyo de este resultado, un estudio previo ha proporcionado pruebas de su asoc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas (finas #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mezcle la base de elastómero y el agente de curado en una proporción de 10:1. Duración de 30 min. Vierta en un molde (por ejemplo use una placa de cultivo celular de 12 pocillos). Deje curar durante al menos 24 horas. Adherir a la tapa de una placa de Petri de 60 x 15 mm al diseccionar.
Pines minuciosos (0.0125  mm de diámetro de la punta)	Fine Science Tools	26002-10
Tijeras de microdisección (ultrafinas)	Fine Science Tools	15200-00
Portaobjetos			Pegue dos cubreobjetos de 22 x 22 mm2 en un portaobjetos de microscopio con esmalte de uñas transparente, dejando un < Espacio entre ellos de 20 mm para el montaje de la muestra.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	El stock se reequilibró sobre un equilibrador de GFP para que los mutantes homocigotos puedan seleccionarse en función de la ausencia de señal de GFP.
1x PBS (solución salina tamponada con fosfato): 3  mM NaH2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Laboratorios Caledon - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Solución de Bouin	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehído): 4% PFA en 1x PBS			PFA (Ciencia de la Anaquimia - 66194-300). Consulte doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 para obtener instrucciones sobre cómo hacer la solución.
[header]
1x PBT (solución salina tamponada con fosfato con Triton): 1x PBS con 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (Albúmina sérica bovina): 1% BSA en 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Almacenar a 4 °C.
ratón anti-Dlg (Discos grandes)	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	4F3	Úselo en una dilución 1:10 en BSA al 1%.
conejo anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Proporcionado por la Dra. Lynn Cooley (Universidad de Yale). Úselo en una dilución de 1:250 en BSA al 1%.
conejo anti-Pak (quinasa activada por p21)			Proporcionado por el Dr. Nicholas Harden (Universidad Simon Fraser). Úselo en una dilución de 1:500 en BSA al 1%.
ratón anti-Wg (sin alas)	Estudios del desarrollo Banco de hibridomas	4D4	Uso en una dilución 1:5 en BSA al 1%.
cabra anti-Hrp (Peroxidasa de rábano picante)	Jackson                           ImmunoResearch	123-065-021	Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.
burro conjugado FITC anti-cabra	Jackson                        ImmunoResearch	705-095-003	Úselo en una dilución de 1:200 en BSA al 1%.
Duolink Sonda PLA In Situ anti-ratón MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink Sonda PLA In Situ anti-conejo PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink Reactivos de Detección In Situ Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Tampón de lavado A: 0.01  M Tris, 0.15  M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Tampón de lavado B: 0.2  M Tris, 0.1  M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Laboratorios Caledon - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x Tampón de lavado B: 2  mM Tris, 1  mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Medio de montaje in situ Duolink con DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040

de plataforma