Análisis rápido y robusto de Celular y Molecular Polarización Inducida por Chemokine Señalización

Resumen

La señalización de quimiocinas provoca marcadas alteraciones de la morfología celular y algunas redistribuciones importantes de las proteínas intracelulares. Aquí, se proporciona un protocolo rápido y detallado para estudiar estos eventos.

Resumen

Las células responden a la estimulación de quimiocinas por la pérdida de su forma redonda en un proceso llamado polarización, y mediante la alteración de la localización subcelular de muchas proteínas. Las técnicas clásicas de imágenes se han utilizado para estudiar estos fenómenos. Sin embargo, se requiere la adquisición manual de de muchas células, seguido de tiempo cuantificación de la morfología y la co-localización de la tinción de decenas de células. Aquí, un método rápido y potente se describe para estudiar estos fenómenos en muestras compuestas por varios miles de células por medio de un flujo de imágenes citometría de tecnología que combina las ventajas de un microscopio con los de un citómetro. El uso de linfocitos T estimulados con CCL19 y tinción para las moléculas MHC de clase I y actina filamentosa, una estrategia gating se presenta para medir simultáneamente el grado de alteraciones de la forma y el grado de co-localización de los marcadores que se ven afectados por la señalización de CCL19. Por otra parte, esta estrategia gating nos permitió OBSERVe la segregación de actina filamentosa (en el frente) y fosforilados proteínas Ezrin-radixina-Moesin (fosfo-ERM) (en la parte trasera) en las células T polarizadas después CXCL12 estimulación. Esta técnica también es útil para observar el efecto de bloqueo en la polarización de dos elementos diferentes: la inhibición de la polimerización de la actina por un inhibidor farmacológico y expresión de mutantes de la / PKC atípicas vía de señalización Par6. De este modo, se muestra evidencia de que esta técnica es útil para analizar tanto las alteraciones morfológicas y redistribuciones de proteínas.

Introducción

Las quimioquinas son pequeñas proteínas solubles que atraen a las células a ubicaciones especializados ^1. Por lo tanto, participan en la correcta posición de las células en los tejidos, una función crucial en el desarrollo y la fisiología. El sistema inmunológico no es una excepción a esta regla, ya que se basa en la acción de muchos tipos de células diferentes que actúan en concierto para montar una respuesta inmune efectiva. Mediante el control de la ubicación específica de un tipo de célula inmune en un estado dado, quimiocinas son pre-requerido antes de antígenos extraños pueden ser detectados y neutralizados.

En los linfoc....

Protocolo

1. Preparación de los linfocitos T

1. Preparar ratón primaria o células T humanas como se describe ^10,11.
2. Cultivar las células T humanas en medio completo RPMI con 10% de suero humano AB a una densidad de 2 - 3 x 10 ⁶ células / ml.
   NOTA: El uso de suero de ternera fetal (FCS) en lugar de suero humano puede provocar la polarización espontánea de una gran fracción de células T humanas en cultivo. Mantener estas células en cultivo durante 4 - 5 días, y otro proceso en cualquier momento durante este período.
3. Mantener las células T de ratón en medio completo RPMI suplementado con 10% de FCS a una densidad celular si....

Resultados

El primer ejemplo elegido aquí se refiere al uso de linfocitos T primarias humanas estimuladas con CCL19. Sin embargo, la misma estrategia se puede utilizar con las células T de ratón primario, líneas de células T o cualquier otro tipo de células sensibles a la estimulación de quimiocina. La estrategia gating que aquí se presenta incluye una serie de ventanas que se seleccionan los eventos enfocados, entonces las células individuales. Por último, la gama de intensidad de fluorescencia se sigue aquí como un ejemplo en do.......

Discusión

Usando una tecnología reciente del flujo de imágenes citometría, una estrategia rápida e informativo gating para analizar los eventos celulares y moleculares inducidos por la estimulación de quimiocinas se presenta. De un solo experimento, se pueden obtener dos tipos principales de información: los cambios en la morfología celular inducida por la estimulación de quimioquinas y la distribución subcelular de proteínas diferentes durante el proceso de polarización. Curiosamente, también se proporciona evidencia de la posib.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI	Gibco	61870-010
Suero humano AB	PAA	C11-021	Precalentar para inactivar el complemento.
Suero fetal de pantorrilla	PAN Biotech	P30-3300	Precalentar para inactivar el complemento.
Kit de nucleofactor de células T humanas	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Warm in 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Las alícuotas se descongelan en hielo antes de añadir la quimiocina a las células.
humanas CCL19	Peprotech	300-29B	se descongelan en hielo antes de agregar la quimiocina a las células.
humanas CXCL12	Peprotech	300-28A	se descongelan en hielo antes de agregar la quimiocina a las células. Esta quimiocina también se puede usar en células T de ratón.
Ciencias de la microscopía electrónica de	PFA	157-8-100	Esta es una solución de PFA al 8% en agua. Mezcle volumen a volumen con 2x PBS para obtener una solución de PFA al 4% en PBS.
BSA	Sigma	A3059
Saponina	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 faloidina	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC	Beckman Coulter	IM1838	B9.12.1
Anticuerpo anti-P-ERM	Tecnología de señalización celular	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis