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Artículo de método

Neural Trasplante de células madre en Experimental contuso Modelo de Lesión de la Médula Espinal

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DOI:

10.3791/52141

17 de diciembre de 2014

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Lesión de la médula espinal es una condición traumática que causa morbilidad severa y alta mortalidad. En este trabajo se describe en detalle un modelo contusión de lesión de la médula espinal en ratones seguido de un trasplante de células madre neurales.

Resumen

Lesión de la médula espinal es una condición clínica devastadora, caracterizada por un complejo de disfunciones neurológicas. Los modelos animales de lesión de la médula espinal pueden ser utilizados tanto para investigar las respuestas biológicas a la lesión y para probar terapias potenciales. Contusión o compresión lesión entregado a la médula espinal expuesta quirúrgicamente son los modelos más utilizados de la patología. En este informe, la contusión experimental se lleva a cabo utilizando el dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite la creación de un modelo animal de lesión reproducible través de la definición de los parámetros de lesión específica. El trasplante de células madre es considerada comúnmente una estrategia potencialmente útil para la curación de esta enfermedad debilitante. Numerosos estudios han evaluado los efectos de trasplante de una variedad de células madre. Aquí se demuestra un método adaptado para la lesión de la médula espinal seguida de la inyección de cola vena de células en ratones CD1. En resumen, ofrecemos procedimientos para: i) wi etiquetado celularº un trazador de vital importancia, ii) la atención pre-operatoria de los ratones, iii) la ejecución de una lesión de la médula espinal contundente, y iv) la administración intravenosa de post mortem precursores neuronales. Este modelo contusión puede ser utilizado para evaluar la eficacia y seguridad de trasplante de células madre en un enfoque de la medicina regenerativa.

Introducción

Una lesión de la médula espinal (SCI) es la lesión más común causada por traumatismos de alta energía como vehículos de motor accidentes, caídas, el deporte y la violencia 1. En grave SCI, la fuerza de la lesión destruye o daña el tejido neural, causando la pérdida repentina de la función neurológica. Traumático SCI se produce con frecuencia en adultos jóvenes de entre 10 y 40 años de edad. Afecta en gran medida la condición mental y física del paciente y causa enorme impacto económico para la sociedad 2. El enfoque de tratamiento en la fase aguda es a menudo limitada a una dosis alta de corticosteroides, la estabilización quirúrgica y descompre....

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Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Revisión de la Universidad de Milán y cumplen las directrices italiana para Animales de Laboratorio en el cumplimiento de la Directiva Europea Comunidades fechado en noviembre de 1986 (86/609 / CEE).

1. Preparación de las células para el trasplante

NOTA: Usar las células madre neuronales entre el quinto y el noveno pasaje en cultivo durante estos experimentos; probar las culturas para la proliferación y capacidad de diferenciación antes de ser etiquetados para el trasplante. Determinar el grado de diferenciación por inmunohisto 12.

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Resultados

El número total de células trasplantadas es 1 x 10 6 células y se dividió en tres inyecciones consecutivas en la vena de la cola. Se administraron 3,3 x 10 5 células en 50 l de solución tampón de fosfato (PBS). La primera inyección se realizó dentro de 30 min después de la lesión, el segundo 6 horas más tarde y el último 18 h después de la lesión. La elección de un plazo de 18 horas después de la lesión de la administración de PM-NPC se determinó por la permeabilidad óptima de la barrera hematoence.......

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Discusión

En este trabajo se describe un método para obtener un modelo reproducible de lesión medular traumática utilizando un infinito horizonte Impactor con una fuerza de 70 Kdyne (grave). El uso de un paradigma de fuerza mayor (80 Kdyne), podemos causar una lesión más grave que por desgracia está asociada con la mortalidad ratones superiores. A fin de evitar este problema, que comúnmente escogemos un paradigma de fuerza moderada (70 Kdyne) que está asociado a una lesión repetible con una recuperación gradual de la función y un.......

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo económico de FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), Fundación "Neurogel-en-Marche" (Francia), Fondazione "La Colonna".

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PKH26GL-1KT Sigma091M0973
Dispositivo impactador de horizonte infinito (IH) Precision Systems and Instrumentation, LLCModelo 0400 Serial 0171
Gentamicina 10 mg/mlEuroclonECM0011B1 mg/ml en solución salina estéril
Isoflurano-Vet 250 mlMerialB142J12A
Blefarolin POM OFT 10 g
Calentador de portaobjetos2Biological InstrumentsHB101-sm-402
Bisturí, tamaño 10Lance Paragon26920
Pinza Graefe pequeña2Instrumentos biológicos11023-14
RongeurMedicon Instruments07 60 07
Microtijeras2Instrumentos biológicos15000-00
Suturas absorbibles (4/0)Safil QuickC0046203
Hemostático2Instrumentos biológicos13014-14
Aplicador de pinzas para heridas Reflex 72Biological Instruments12031-07
Pinzas para heridas Reflex de 7 mm2Biological Instruments12032-07
NGSEurocloneECS0200D
Triton X 100Merck Millipore1086431000
Proteína Asociada Anti Microtúbulos  (MAPA) 2MilliporeAB5622
Alexa Fluor 488InvitrogenA11008
FluorSave Reactivo Calbiochem345789
medio de célulasmedio DMEM-F12 (Euroclone) que contiene 2 mm de l-glutamina (Euroclone), 0,6% de glucosa (Sigma-Aldrich), 9,6 gm/ml de putrescina (Sigma-Aldrich), 6,3 ng/ml de progesterona (Sigma-Aldrich), 5,2 ng/ml de selenito de sodio (Sigma-Aldrich), 0,025 mg/ml de insulina (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/ml de transferrina (Sigma-Aldrich) y 2 μ g/ml de heparina (sal sódica, grado II; Sigma-Aldrich), bFGF (recombinante humano, 10 ng/ml; Life Technologies) y EGF (recombinante humano, 20 ng/ml; Tecnologías de la Vida) 
DMEM-F12EuroclonASM5002
l-glutaminaEuroclonECB3000D
glucosaSigma-AldrichG8270-100G
putrescinaSigma-AldrichP5780-25G
progesteronaSigma-AldrichP6149-1MG
Selenito de sodioSigma-AldrichS9133-1MG
transferrinaSigma-AldrichT 5391
InsulinaSigma-AldrichI1882
Heparina sal de sodioSigma-AldrichH0200000
bFGFLife TechnologyPHG0024
Jeringa 0,33 cc 29 gTerumoMYJECTOR 
buprenorfinaSchering Plough SpATEMGESIC
gel de ojosBausch & LombLIPOSIC
madre neurales h-EGF Life Technology PHG6045

Referencias

  1. Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance. , https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013).
  2. Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6(2012).
  3. Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlin....

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Etiquetas

Células madre neuralesmodelo de contusiónimpactador de horizonte infinitoinyección en la vena caudalmarcado celulartrazador PKH 26precursores neurales post mortemcirugía de ratónfunción de las extremidades posteriores