Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

Resumen

Las recientes mejoras en las preparaciones organotípicas de cortes de cerebro han permitido su explotación para aplicaciones biotecnológicas. Los cortes organotípicos mantienen las características estructurales locales de la biología in vivo, incluidas las conexiones sinápticas funcionales. En este trabajo se presenta un método de administración biolística regioselectiva para etiquetar y manipular genéticamente estos cortes.

Resumen

La transfección de ADN ha sido de gran valor para las ciencias biológicas y con los últimos avances en preparaciones de cortes de cerebro organotípicos, el efecto de varios genes heterólogos por lo tanto podría ser investigado fácilmente manteniendo muchos aspectos de la biología in vivo. Ha habido un interés creciente para transfectar neuronas terminales diferenciadas para las que los métodos de transfección convencionales han estado plagado de dificultades, tales como los bajos rendimientos y pérdidas significativas en la viabilidad. Transfección biolística puede eludir muchas de estas dificultades sin embargo, sólo recientemente se ha modificado esta técnica de modo que es susceptible para su uso en tejidos de mamíferos.

Nuevas modificaciones a la cámara de acelerador han mejorado la precisión de disparo de la pistola de genes y el aumento de sus profundidades de penetración mientras que también permite el uso de presión de gas inferior (50 psi) sin pérdida de eficiencia de la transfección así como permitir un margen regioselectiva enfocada del paARTÍCULOS para dentro de 3 mm. Además, esta técnica es sencillo y rápido de realizar que microinyecciones tediosas. Tanto expresión transitoria y estable son posibles con nanopartículas bombardeo donde la expresión episomal puede ser detectado dentro de 24 horas y la supervivencia de las células ha demostrado ser mejor que, o al menos igual a, métodos convencionales. Esta técnica tiene sin embargo una ventaja crucial: permite la transfección a ser localizados dentro de un solo radio restringido permitiendo así al usuario aislar anatómicamente efectos del gen heterólogo. Aquí presentamos un protocolo detallado para preparar adultos viable rebanadas organotípicos y someterlos a regioselectiva transfección utilizando una pistola de genes mejorada.

Introducción

Originalmente la técnica biolistic, una frase a su vez-de-para "balística biológicos", se estableció para la transferencia génica mediada por partículas en las células vegetales ^1. Este método físico de la transformación celular micro o nanopartículas acelera a alta velocidad para superar las barreras físicas de las membranas impermeables a las células con el fin de entregar cargamentos tales como ADN o colorantes. Debido a que no depende de ligando de receptores específicos y / o las propiedades bioquímicas en las membranas de la superficie celular, transferencia de genes mediada por partículas se puede aplicar fácilmente a una variedad de sistemas biológicos, tales como cortes de cerebro organotípicos.

Usando rebanadas organotípicos tienen ventajas sobre otros en las plataformas in vitro ya que mantienen muchas de las propiedades anatómicas y bioquímicas que son pertinentes a la biología in vivo ^2-4. Las rebanadas mayoría conservan las características arquitectónicas locales desde donde se han originado y preserve la actividad neuroquímica y la conectividad de las sinapsis. El uso de cortes de cerebro para la investigación básica, y en los esfuerzos farmacéuticos, ha aumentado de forma concomitante con el número de posibles manipulaciones biotecnológicas para medir y monitorear los comportamientos neurobiológicas del cerebro en un in vivo como contexto ^3,5-7. Las principales ventajas para el uso de sistemas de ensayo a base de cortes organotípicos es que proporciona control experimental fácil y permite manipulaciones precisas de ambientes extracelulares.

Fructíferamente, sistemas de cultivo de cortes organotípicos se han establecido a partir de una variedad de regiones cerebrales, tales como, pero no limitado a, la corteza, la médula espinal y cerebelo ^8-10. Además, un número de cocultivos se ha demostrado, que permiten la evaluación de la comunicación intercelular entre las regiones cerebrales distales así como entre las neuronas y las células patológicas ^11,12. Muchos protocolos ya han sido establecidos para successfully rebanadas cultura organotípicos y puede mantener la viabilidad a largo plazo y muchos estudios recientes ahora utilizan los métodos de interfaz de membrana y varias modificaciones a la misma ^13. Este principio mantiene las rebanadas organotípicos en la interfaz entre el medio y la atmósfera humidificada de la incubadora colocando las rodajas en un filtro de membrana porosa. El medio puede así proporcionar suficientes nutrientes para alimentar a las rebanadas organotípicos mediante movimiento capilar. Típicamente rebanadas se han preparado a partir de animales postnatales tempranos (3 - 9 días de edad; P3 - 9). Sin embargo, los tejidos del cerebro de estas rebanadas mostrar un alto nivel de plasticidad celular y tienen una resistencia inherente a los esfuerzos mecánicos, que es útil para obtener cultivos viables, sin embargo, las sinapsis maduras y circuitos neuroanatómico no se han desarrollado completamente in vivo hasta 2 a 3 semanas de edad ^14. Por ejemplo, las observaciones anteriores habían demostrado que los cortes de hipocampo obtenidas de P0 - 1 neonatos, aunque muy viable siguiente preparación, perdiendo algunas características morfológicas. Esencialmente, ellos demostraron ser inadecuados para cultivos a largo plazo sugieren células inmaduras fueron más propensos a des-diferenciar en comparación con cultivos organotípicos de animales mayores ^15,16. Por esta razón, nuestro método ha sido optimizado para los cortes de cerebro organotípicos adultos en la que la maduración y el desarrollo arquitectónico han llegado a sus etapas terminales ^13,17-21. Sin embargo, este método también es adecuado para el recién nacido y rebanadas organotípicos juveniles.

Una vez que se han producido las rebanadas organotípicos viables toda la placa que contiene las rebanadas puede ser llevado al monte biolistic y sometido a regioselectiva entrega y transfección. El montaje correcto de la pistola de genes (como se describe en la Figura 1), orientado 90 ° a una distancia de 10 mm directamente sobre las rebanadas (desde la abertura en el tejido), permite el rápido suministro biolístico de los 40 nm irld partículas recubierto cargas. Estas cargas tales como tintes y vectores de ADN fluorescentes, así como cualquier gen de interés, se entregan fácilmente en las rodajas viables con facilidad. Así pues, este método describe el protocolo necesario para ofrecer, de una manera regioselectiva, carga recubierto las nanopartículas de oro en cortes de cerebro organotípicos viables. El cañón de la pistola de genes y montaje óptimo se puede ver en la Figura 1. Para más información sobre las mejores balística barril y nanopartículas, por favor ver O'Brien, et al., ^17.

Refinamientos posteriores también están indicados para el usuario para optimizar las condiciones tales como la cantidad apropiada de oro entregado por área objetivo, definida como microportadores Cantidad de carga (MLQ), y para determinar la cantidad de ADN cargado por mg de oro, definido como de relación de ADN Cargando (DLR). Antes de la precipitación de ADN en partículas de oro y cargarlos en el tubo Tefzel que comprende cartuchos de la pistola de genes real '9 ;, es necesario para calcular la cantidad de ADN y el oro requerida para cada transfección que puede diferir ligeramente entre los tejidos y las condiciones (relación debe mantenerse entre 1 mg de oro y 1 g de ADN a 1: 5). Es vital para preparar la proporción adecuada de MLQ a DLR en contrario partículas de oro recubiertas de ADN podrían adherirse entre sí formando más grande que la aglomeración se esperaba, lo que podría reducir la homogeneidad global de la propagación biolistic así como daños incremento del tejido y la citotoxicidad.

Este método muestra las recientes mejoras en el suministro biolístico, que han sido probados y decididos a ser susceptibles de cortes de cerebro organotípicos neonatales, juveniles y adultos. Además, mediante la explotación de propagación reducida biolístico el gen arma de barril, el usuario es ahora capaz de transfectar de forma selectiva una región puntual en el cerebro. Tras el tiempo de incubación apropiado, la expresión de las proteínas fluorescentes, que alcanza sus tasas máximas entre 24 y 48hr, se puede visualizar mediante epifluorescencia y microscopía confocal. Estos fluoróforos permiten el análisis morfológico y la localización de las células individuales dentro de las estructuras biológicamente relevantes. Sin embargo, la modulación regioselectiva de las rebanadas organotípicos por otros genes heterólogos también puede ser controlado por cualquier otra prueba susceptibles de estas preparaciones. Posibles estrategias de trabajo para la entrega de genes localizados se presentan en la Figura 2.

Protocolo

El uso de animales y tejidos animales deben adherirse estrictamente a la aprobación del comité ético bajo las reglas y regulaciones locales. Todos los tejidos obtenidos durante este estudio adhirieron a la experimentación animal, el MRC-LMB.

1 Preparación de Materiales y Medios de Cultivo

1. Preparar todas las soluciones con agua Millipore; utilizar únicamente reactivos de grado analítico. Preparar y almacenar todos los reactivos a temperatura ambiente (a menos que se indique lo contrario).
2. Hacer 500 ml de solución salina tamponada con HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 120 mM pH 7,2). Filtrar a través de una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
3. Hacer 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS; 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, pH 7,4). Esterilizar en autoclave.
4. Preparar medio neuronal completándolo DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) con 25 mM HEPES, 10% de suero de ternera fetal, glucosa 30 mM, 1: 100 N2 dopplement, penicilina-estreptomicina 1.100 U / ml; pH 7,2. Filtro con una unidad de filtro estéril de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
5. Hacer disolución de polivinilpirrolidona (PVP) stock con 20 mg de PVP en 1 ml de etanol al 100%. Alícuota de esto en 1 ml cantidades, congelación y almacenar a -20 ° C. Solución de trabajo es de 0,05 mg / ml, por lo tanto, añadir 10 l de solución de PVP de stock para cada 4 ml de etanol al 100%.
6. Preparar una solución madre 0,05 M espermidina en agua Millipore; ajustar el pH a 7,2.
7. Hacer una solución de agarosa al 2% en DMEM (2 g de agarosa de grado electroforesis en 100 ml de DMEM en una botella de tapón de rosca esterilizada). Microondas esto hasta que la agarosa se haya disuelto. Guarde en la nevera 4 ° C durante varias semanas, si es necesario.

2 Preparación de Organotípicos rebanadas

1. La eutanasia a C57 Negro 6 ratones de la edad deseada por asfixia de CO ₂ seguido por decapitación. Retire el cerebro usando recortes laterales del cráneo a partir de la foramen magnum y terminando enlos lóbulos olfativos. Levante suavemente el cráneo de la parte posterior para exponer el cerebro.
2. Cortar entre los lóbulos olfativos y la corteza frontal, y a rostral del cerebelo. Levante ligeramente la parte rostral del cerebro y cortar los nervios ópticos. Por último, retire el cerebro y lo coloca en una placa de Petri llena con solución salina tamponada con HEPES frío de hielo en hielo.
3. El uso de un microscopio de disección, retire la pia utilizando unas pinzas finas; retirar con cuidado los vasos sanguíneos y meninges alrededor del cerebro.
4. Coloque el cerebro fresco en un molde receptor pequeño y cubra con la solución de agarosa enfriado ligeramente por encima de RT. Luego enfriar rápidamente el molde a 4 ° C colocándola en hielo.
   NOTA: Procesar las rebanadas lo más rápidamente posible para evitar la pérdida de viabilidad.
5. Cuando la agarosa se ha fijado (5 - 10 min), retire el cerebro agarosa embebidos del molde (recortar si es necesario) y, a continuación, péguelo en la plataforma vibroslicer. Coloque esto en una cámara vibroslicer contiene hielo estéril PBS frío. Disinfect la cámara de vibroslicer antes de ser utilizado con etanol al 70% para reducir al mínimo las contaminaciones posteriores.
6. Cortar el cerebro usando un vibroslicer hecha a la medida o su equivalente comercial. El concepto de modelo era diseñar una máquina de cortar el tejido que podría generar movimientos de gran amplitud y alta frecuencia horizontal hasta el borde de la cuchilla y reducir al mínimo las vibraciones verticales.
7. Usa la frecuencia de oscilación de 90 Hz, a una amplitud de 1,5 - 2,0 mm, y la cuchilla de corte situado en un ángulo de 15 ° con el plano horizontal; establecer el bloque de montaje sosteniendo el cerebro de agarosa embebidos para mover a 1,7 mm / min hacia la cuchilla. Recoger secciones (150 micras) en una cámara que contiene un medio de cultivo frío en hielo (DMEM Pen / Strep + 10% FCS). Ver corte y manipulación de las rodajas de tejido como un video complementario en Arsenault y O'Brien ^13.
8. Con suavidad, coloque las rebanadas en insertos de cultivo celular (0,4 m, diámetro 30 mm) en una bandeja de 6 pocillos múltiples con las med culturaia en el exterior de la pieza de inserción, y se incuban en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO _2.
   NOTA: Para la viabilidad del tejido adecuado, ser muy suave, mientras que la transferencia y la manipulación de las rebanadas. También, demasiado líquido evitará que las rebanadas organotípicos se adhiera a la membrana del inserto de filtro. Si esto ocurre, retire el exceso de líquido o placa de nuevo.
9. Aunque rebanadas organotípicos pueden ser cultivadas durante un par de semanas, procederá a la transfección no más de 4 días después de la siembra para obtener los mejores rendimientos de transfección.
   NOTA: Para evitar el crecimiento excesivo de la glía en condiciones de cultivo a largo plazo, el uso AraC o medio libre de suero ^2.

3 Preparación de ADN recubierto Micro & Nano-proyectiles

1. Preparar nano-proyectiles que utilizan partículas de oro de 40 nm de diámetro. Brevemente, se añaden 50 l de 0,05 M espermidina y 10 l de ADN en 1 mg / ml (pEYFP-N1) a 10 mg de partículas de oro.
   1. Añadir calcio y espermidina en la mezcla de solucióntura durante ADN micro-partículas de oro preparación con el fin de ayudar en la unión de moléculas de ADN a las nanopartículas de oro.
      NOTA: La cantidad de ADN utilizado por mg de portadores de oro (DLR), debe oscilar entre 1 y 5 g de ADN por 1 mg de oro. Además, la cantidad de partículas de soporte de oro que se rodará por cartucho (MLQ), debe sí variar de 0,1 a 0,5 mg de oro. El DLR y MLQ deben ser juzgados y optimizados para cada usuario dependiendo del sistema particular bajo investigación, así como el tipo de cañón de partículas y el gen utilizado.
2. Mezclar utilizando un vórtice mientras que lentamente la adición de 50 l de 1 M de _CaCl2 en fracciones de 10 - 15 l. Después de 5 min de agitación con vórtex ocasional, centrifugar a 1000 xg durante 30 segundos y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de partículas de oro en 3,5 ml de 0,075 M PVP.
3. Dibuje esta suspensión en un tubo (diámetro 2,36 mm interna) usando una jeringa. Colocar el tubo en la estación de preparación de tubos. Permitir elpartículas de oro se asienten y eliminar el sobrenadante por aspiración con una jeringa. Gire el tubo para repartir uniformemente las partículas de oro, que posteriormente fueron secados bajo un flujo constante de nitrógeno a 5 litros por min.
4. Para crear ADN-balas, cortar el tubo con un cortador de tubo en longitudes de 1 cm. Cualquiera de insertar inmediatamente en el cartucho de pistola de genes o mantener desecado (4 ° C) hasta que se requiera.

4. biolística transfección en Organotípicos rebanadas

1. Lleve a cabo los siguientes pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril.
2. Inserte una batería de 9 V y un soporte de cartucho vacío en la pistola de genes Helios.
3. Coloque la pistola de genes para el tanque de helio con la manguera de helio. Fuego 2 - 3 espacios en blanco (ranuras vacías) a 50 psi para presurizar la manguera de helio y los depósitos en la pistola.
4. Cargar los cartuchos que contienen el oro recubiertas de ADN en los soportes de los cartuchos y cargar el soporte en la pistola de genes.
5. Desatornille el gen arma espaciador y adjuntarel cañón del arma gen modificado a la pistola de genes.
6. Usando una pinza estéril, coloque un inserto de filtro que contiene la rebanada organotípico en un plato de plástico estéril.
7. Retire el medio de rebanadas organotípicos.
8. Ajuste la presión del gas a 50 psi.
   NOTA: La protección ocular es esencial y protección para los oídos aconsejable.
9. Coloque la pistola de genes a las distancias apropiadas utilizando el montaje medido a 10 mm. Apuntar con cuidado el centro de la barril en la región deseada para la entrega genética.
10. Después de la cocción, vuelva a colocar los insertos de nuevo en su plato con medio fresco y devolverlos a las condiciones de crecimiento normales, es decir, 37 ° C con 5% de CO ₂ incubadora.
11. Una vez terminado, cierre el tanque de helio, liberar la presión de la pistola de genes y separar la pistola de genes desde el tanque de helio.
12. Retire el soporte del cartucho y deseche los cartuchos y limpiar la pistola de genes.
13. Compruebe el tejido de la morfología y de la penetración exitosa de visualizing las rodajas usando un microscopio invertido. Si el uso de micropartículas, de manera uniforme dispersar el oro; no debe haber áreas densas de partículas de oro se ven en la división. Las nanopartículas debido a su pequeño tamaño no pueden ser vistos como unidades individuales por técnicas de microscopía convencionales.
14. Después de que el intervalo de tiempo apropiado (normalmente 1 - 2 días), fijar las rebanadas en el 4% de paraformaldehído (PFA) para la observación de la microscopía.
    NOTA: La fijación de PFA no siempre se desea. Para imágenes de células vivas evitar este paso.

5. Fijación y Visualización de cerebro rebanadas

1. Después de la transfección biolística, lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min.
2. Fijar rebanadas incubando en recién hecho, hielo frío PFA al 4% en PBS durante 20 min.
3. Lavar rodajas dos veces en PBS durante 2 min.
4. Cortar suavemente alrededor de la membrana admite el uso de un bisturí, sin perturbar las rodajas montados en ellos. El uso de fórceps para colocar cada membrana de soporte / rebanada en un portaobjetos de microscopio. Descanse el organotyprebanadas ic en la parte superior de la membrana en el portaobjetos de vidrio.
5. Añadir una gota de medio de montaje en la parte superior de la rodaja y añadir un cubreobjetos suavemente sin ninguna fuerza directamente en contacto con la rebanada organotípicos.
6. Asegure el cubreobjetos con una fina capa de barniz de uñas.
7. Ver las rebanadas en un microscopio adecuado.

6. Aplicaciones Confocal

1. Visualizar las rodajas mediante el uso de un microscopio confocal láser de barrido vertical con una 60X / 1,4 apertura numérica (NA) de inmersión en aceite de lente de objetivo.
   NOTA: La característica más problemática del microscopio confocal es el tamaño del agujero de alfiler (puesta a 1 UA), que es capaz de aislar y recoger un plano de enfoque, eliminando así el fuera de foco 'bruma' se ve normalmente con una muestra fluorescente. Los detalles finos a menudo son oscurecidas por esta bruma y no pueden ser detectados en un microscopio nonconfocal.
2. Ajuste el láser de argón a una longitud de onda de excitación de 488 nm y optimizar para la recogida de emitted luz en la banda de entre 500 y 520 nm. Típicamente, recoger imágenes a 1024 x 1024 píxeles y con las pilas de z secciones a intervalos de 0,5 m para abarcar la anchura completa de cada célula nerviosa que se analizó.
   1. Para observar la morfología del núcleo, contador mancha estas células con DAPI (longitud de onda de excitación fijado en 405 nm y de emisión de luz recogida entre 420-4 40 nm). Por último, para el examen de fluorescencia roja, ajuste el láser a 561 nm para la excitación y 565-620 nm para la emisión.
3. Por lo general, la obtención de imágenes mediante el uso de un zoom 4X exploración que cubrió un área de 57,6 m ^2; tamaños de las imágenes estaban en la región de 1.024 x 1.024 píxeles. Record pilas de z secciones en intervalos de 0,5 micras y proyecciones de 5-8 cuadros combinados.

Resultados

La viabilidad organotípica del corte se puede monitorear con la actividad de la lactato deshidrogenasa, el marcaje de yoduro de propidio y la tinción de dUTP como se informó anteriormente^13,22. Evidentemente, la viabilidad y la integridad de los cortes son importantes para la expresión sostenida a largo plazo de la carga genética entregada. Después de la administración biolística en los cortes organotípicos, la expresión del gen heterólogo fluorescente se monitoreó mediante microscopía confocal. La estanqueidad de la extensión biolística utilizando el cañón modificado se puede ver en la Figura 3A. La Figura 3B muestra una imagen representativa de la región del hipocampo transfectada utilizando nanopartículas de oro recubiertas de ADN. La Figura 4 muestra imágenes representativas de cortes organotípicos de ratones adultos transfectados. Como se puede ver en la Figura 4A, una neurona de Purkinje con un notable puerto dendrítico que se encuentra en la interfaz de la capa de Purkinje y la capa molecular del cerebelo muestra un marcado pronunciado después de una transfección biolística transitoria con pEGFP-N1. La Figura 4B muestra un mayor aumento de estas dendritas donde se pueden observar espinas. La Figura 4C muestra una célula piramidal encontrada en la región CA1 del hipocampo después de la administración biolista de nanopartículas de oro recubiertas de pDSredFP.

Los tintes en lugar de las cargas de ADN codificadas fluorescentes también se pueden usar de manera similar para visualizar las características morfológicas en cortes organotípicos. El DiO, que marca las membranas plasmáticas, puede delinear más rápidamente las morfologías celulares individuales o puede utilizarse junto con un biolístico recubierto de ADN enviado a la misma región para confirmar la regioselección. Como se puede ver en la Figura 5A, una neurona teñida con DiO en el hipocampo también muestra dendritas largas con numerosas espinas. Una flecha indica el axón que se identifica por la presencia de botones sinápticos en comparación con las espinas dendríticas de las otras neuritas. La Figura 5B muestra otro ejemplo del CA1, que destaca numerosas proyecciones del hipocampo con una contratinción de DAPI para marcar el núcleo. La Figura 5C muestra un mayor aumento de estos tipos de dendritas paralelas con numerosas espinas.

Evidentemente, estas imágenes ilustran las características morfológicas siguiendo el marcaje celular. Nada impide que se aplique la misma metodología para administrar cualquier número de genes exógenos recubiertos de las nanopartículas de oro. Para permitir una confirmación visual de la transfección exitosa, se puede construir un solo plásmido para coexpresar tanto el gen de interés como una proteína reportera fluorescente en el mismo vector.

Figura 1. Cañón y montaje de la pistola genética.(A) El cañón mejorado desarrollado por el Dr. O'Brien en el MRC-LMB que tiene una propagación biolística restringida que minimiza el daño tisular al reducir la presión requerida para la aceleración de partículas. (B) La vista lateral de un montaje optimizado de un cañón genético desarrollado por el Dr. Henderson y el Dr. Andras Nagy en la Universidad de Toronto. El montaje mantiene la pistola de genes a una precisión de 90° perpendicular a los cortes organotípicos, al tiempo que permite al usuario controlar con precisión la distancia de entrega biológica. Para obtener condiciones biológicas óptimas, la abertura del cañón debe colocarse directamente sobre la región de interés a una distancia de 10 mm de las cortes organotípicas. (C) Vista posterior de la montura del cañón genético. La región de interés a transfectar debe colocarse directamente debajo de la abertura del cañón. La focalización puede confirmarse con colorante (diolístico) o tranfección de proteínas fluorescentes (biolístico). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Preparación organotípica del corte y focalización regioselectiva.(A) Un cerebro de ratón adulto incrustado en DMEM, listo para cortar. (B) El molde se pegó a la montura de la vibrográfica con la cuchilla lista para cortar una rebanada. (C) Estrategias regioselectivas de expresión génica heteróloga para la administración biolística en cortes de cerebro organotípicos coronales. Imágenes preparadas a partir de imágenes obtenidas del atlas anatómico de referencia Allen Brain Atlas²³. El panel izquierdo muestra dos regiones cerebrales diferentes a modo de ejemplo. Restringir la expresión génica (1) al área cortical del hemisferio izquierdo. Restringir la expresión génica heteróloga (2) a la región del hipotálamo del cerebro. El panel central muestra que la expresión de dos genes heterólogos (3 y 4) se puede aislar y compara el hipocampo de dos hemisferios en el mismo corte organotípico, eliminando esencialmente cualquier sesgo del uso de diferentes secciones y/o otorgando la posibilidad de abordar la diafonía distal de los efectos de esos genes. El panel derecho muestra la posible superposición de la administración transgénica para expresar el primer gen (5) en una región cortical precisa mientras se expresa otro gen (6) en un área cortical dispar pero superpuesta. Esto permite analizar el efecto de la modulación genética de cada gen heterólogo solo y también en combinación dentro de un mismo corte. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Patrón de dispersión biolístico visto en papel de filtro e imagen de bajo aumento.(A) El cañón mejorado se disparaba sobre papel de filtro para determinar la dispersión de las partículas de oro. El lado izquierdo muestra la distribución del cañón mejorado, mientras que el panel derecho muestra el cañón normal. Barra negra: 1 cm. Imagen tomada de O'Brien, et al.¹⁷. (B) Imagen de bajo aumento que muestra el patrón de transfección estocástica dentro de la extensión biolística de 3 mm dentro de la región del hipocampo de ratones de 6 semanas de edad. Barra blanca: 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Entrega biolística de ADN codificado por proteínas fluorescentes en cortes organotípicos de ratones de 6 semanas de edad.(A) Imágenes confocales invertidas de un corte organotípico fijo del cerebelo de una célula de Purkinje transfectada con partículas de oro recubiertas de pEGFP-N1. La imagen fue tomada con un aumento de 40X. Barra negra: 30 μm. (B) Muestra un aumento de 60x del puerto dentrítico de otra célula de Purkinje para resaltar las espinas. Barra negra: 5 μm. (C) Muestra una imagen confocal de cortes fijos tomados de la región del hipocampo con un aumento de 60x de cuatro células piramidales transfectadas DSredFP. Barra negra: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Entrega diolística de colorantes fluorescentes de marcado de membrana en rodajas organotípicas.(A) muestra la imagen en vivo de una neurona del hipocampo marcada con DiO con un aumento de 20X. Las espinas dendríticas se pueden observar claramente, así como el axón, identificado por la ausencia de espinas dendríticas y la presencia de botones sinápticos indicados por una flecha blanca. Barra blanca: 30 μm. (B) Tinción pronunciada de la región del hipocampo marcada con DiO y contrateñida con DAPI. Barra blanca: 30 μm. (C) Mayor aumento (60x) de las espinas dendríticas encontradas en la región CA1 del hipocampo. Barra blanca: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El protocolo describe enfoques para administrar tintes y materiales genéticos en cortes organotípicos adultos mediante el uso de una pistola genética mejorada. Esencialmente, los tipos de colorantes y la variedad de genes posibles hacen que este método sea multifacético y susceptible de responder a una amplia gama de preguntas biológicas. El método de administración regioselectiva utilizado, en este caso a una región específica del cerebro, abre nuevas vías para la experimentación, ya que la modulación génica heteróloga de áreas localizadas dentro de una arquitectura biológicamente relevante no ha sido fácilmente factible antes. Hemos determinado previamente que este método se puede utilizar en cortes organotípicos adultos, donde las sinapsis maduras están completamente formadas, ya que mostró una mejor supervivencia celular y expresión génica heteróloga durante muchas semanas¹³. Con el advenimiento de nuevas y mejoradas condiciones de cultivo para cerebros de mamíferos, así como para otros tejidos, el uso de modulaciones genéticas regioselectivas será cada vez más útil para una amplia variedad de análisis bioquímicos.

Como destacaremos aquí y como ya hemos mencionado otros²⁴, muchos factores diferentes podrían afectar fácilmente a la precisión y fiabilidad de la administración biolítica. En primer lugar, la preparación de la partícula de oro unida a tintes o ADN debe estar adecuadamente equilibrada para evitar la agregación y facilitar la expulsión de la carga del cartucho. El calcio y la espermidina en la solución de micropartículas de ADN y oro pueden ayudar a la unión de las moléculas de ADN a las nanopartículas de oro. La capacidad de las nanopartículas para penetrar en las células bajo presión reducida se determinó previamente¹⁷. En segundo lugar, la pistola genética debe montarse de la manera más estable posible con el ángulo y la distancia correctos. También es necesario un manómetro confiable para la reproducibilidad, para mantener la integridad del tejido y para acelerar adecuadamente las partículas de oro a sus objetivos previstos. De hecho, la distancia, la orientación y la estabilidad del equipo también son factores cruciales para la orientación y la precisión de la entrega regioselectiva. Como estas estructuras cerebrales son muy pequeñas, las variaciones menores en el ángulo de disparo podrían hacer que todo el procedimiento sea menos confiable. Y, por último, la preparación y el mantenimiento de cortes organotípicos viables han estado plagados de dificultades durante muchas décadas, pero actualmente se dispone de protocolos abundantes y fiables para diferentes animales, regiones cerebrales, edades y cocultivos^2,4,25,26. Estos procedimientos deben ser optimizados por el usuario antes de someter los tejidos a procedimientos biolíticos. Esto permitirá al usuario determinar más fácilmente de manera imparcial el impacto de las partículas biolíticas y el efecto del gen heterólogo en sus propios cultivos. Con este fin, el uso de genes fluorescentes como EYFP y EGFP puede permitir a un nuevo usuario probar la precisión de la orientación y también seguir la viabilidad celular a través de la expresión génica heteróloga durante un período de tiempo sostenido¹³. Muchos de los pasos críticos para un uso confiable y reproducible de este protocolo se destacan en los siguientes tres párrafos.

Para una transfección eficiente, la concentración de ADN debe ser adecuada. Las concentraciones demasiado bajas dificultarían el rendimiento de la transfección, mientras que las concentraciones demasiado altas pueden causar la aglomeración de las nanopartículas. Los agregados de oro pueden reducir drásticamente la eficiencia de la transfección, causar distribuciones desiguales y pueden conducir a un aumento de la citotoxicidad y el estrés oxidativo. Es probable que los problemas con la eficiencia del recubrimiento se deban a la expiración de la solución de espermidina (debe reemplazarse cada 2 a 3 meses). Para una distribución biolítica adecuada, el etiquetado debe ser uniforme. Un etiquetado no homogéneo de la suspensión de nanopartículas/ADN de oro puede deberse a la solución de PVP. También debe reemplazarse cada 2 a 3 meses. El recubrimiento de las nanopartículas de oro se puede ver en la electroforesis en gel de agarosa como una banda MW²⁷ más alta.

Cada sistema biológico bajo investigación, así como cada instrumento diferente utilizado, puede requerir pequeños cambios en la presión del gas para alcanzar niveles optimizados de transfección y propagación biolítica. El parámetro crítico es la presión del pulso de helio requerido para extraer los micro o nanoportadores del cartucho de plástico e impulsarlos hacia el tejido. Una alta presión de gas afectará la supervivencia celular, ya que creará ondas de choque a través del objetivo y alterará o separará el tejido de la matriz¹⁷. Apuntar el cañón de la pistola de genes y tener el aparato exactamente perpendicular al tejido es importante para una administración biolítica precisa. El área seleccionada debe colocarse en el centro directo del barril a exactamente 10 mm de la abertura exterior. Esto da como resultado un diámetro de 3 mm de entrega de partículas de oro alrededor del epicentro. El cañón de la pistola genética debe limpiarse con etanol al 70% después de cada uso. Para proteger el tejido de los agregados de partículas grandes, el barril también contiene una malla de nailon que debe reemplazarse regularmente para mantener un rendimiento óptimo. Para reemplazar la malla, desenrosque la tapa y luego inserte una nueva malla de nailon entre la tapa y la junta tórica.

Las células marcadas con fluorescencia deben ser visibles al menos 1 o 2 días después de la transfección alrededor del epicentro. La ausencia o desalineación del etiquetado puede ser el resultado de una preparación inadecuada y la inestabilidad del montaje de la pistola de genes. Las observaciones de células mediante microscopía confocal dependen de una serie de factores: la longitud de onda de la luz de excitación/emisión, el tamaño estenopeico, la NA de la lente del objetivo, el índice de refracción de los componentes en la trayectoria de la luz, la profundidad del tejido y la alineación del instrumento. Estos factores deben optimizarse para cada sistema bajo investigación.

Los avances recientes en biolística se aprovecharon para el éxito de este método. El cañón de la pistola genética utilizado en este estudio se modificó para reducir la presión necesaria, así como para canalizar el patrón de dispersión biolística hacia un área más restringida y específica^17,19. Otras modificaciones del cañón han tratado de restringir la propagación biolítica y reducir la presión de salida²⁸ , sin embargo, este cañón de pistola de genes diseñado a medida diseñado por el Dr. O'Brien es un solo componente instalado en la pistola Helios Gene estándar. Posteriormente, se utilizaron partículas de oro submicrométricas para reducir la invasividad de las partículas micrométricas que previamente habíamos determinado que causaban daño celular y, en última instancia, pérdida de expresión génica heteróloga sostenida. Estos cambios en el procedimiento biolítico mejoraron la viabilidad general y la reproducibilidad del método¹³. Otras mejoras en la preparación de cortes, como la resolución de problemas en profundidad del procedimiento de corte, el uso de una matriz de DMEM-agarosa para preservar el cerebro y muchos otros avances útiles en la preparación organotípica de cortes cerebrales informados anteriormente¹³ , nos permitieron explorar el uso de cortes adultos que han desarrollado redes sinápticas maduras.

En nuestro estudio, utilizamos principalmente colorantes y genes heterólogos fluorescentes para visualizar la morfología celular como una lectura de la eficiencia de la transfección y la capacidad de obtener imágenes de las características morfológicas de las neuronas en los tejidos cerebrales de ratón. La relación señal / ruido de la entrega estocástica dentro de un radio definido nos permitió aislar completamente el puerto dentrítico de una sola célula dentro de su contexto nativo. Dado que se utilizan numerosos esfuerzos para investigar estas características morfológicas, mapear la "conectómica" o etiquetar células individuales para diversos análisis, este método podría combinarse fácilmente con protocolos existentes como la electrofisiología y las mediciones de neuritas^29,30. Evidentemente, las combinaciones de genes heterólogos fluorescentes podrían permitir una delineación mucho más robusta de células individuales como la distribución estocástica de proteínas fluorescentes, y su combinación determinaría el color de las células individuales^31,32. El uso de promotores específicos de células como la sinapsina y la proteína del ácido fibrilar glial aguas arriba del exón del gen heterólogo también puede restringir la expresión a subpoblaciones³³. De hecho, la variedad interminable de material genético también podría ser entregada de manera regioselectiva por nanopartículas de oro utilizando este mismo procedimiento. Por lo tanto, las regiones transfectadas totales podrían analizarse con métodos tradicionales, como la disección y el sometimiento de esa región a inmunotransferencia occidental para analizar el efecto localizado del gen heterólogo.

Las mejoras en los procedimientos de corte organotípico también permitirán un uso más amplio de los tejidos cerebrales para la experimentación a largo plazo, así como el uso de otros tejidos y cocultivos, y facilitarán los procedimientos de transfección. Se ha informado previamente que la transfección de lípidos y polímeros afecta la homeostasis de la membrana, la internalización, la permeabilidad de las proteínas³⁴ y con frecuencia muestra una eficiencia muy baja para transfectar neuronas diferenciadas terminalmente. La orientación de la carga específica de la célula también es susceptible solo a las células que expresan los receptores de la superficie celular necesarios para la internalización, y aunque este método puede ser altamente selectivo, puede carecer de regioselectividad dirigida³⁵. De lo contrario, los vectores virales suelen ser difíciles y costosos de producir, requieren regulaciones estrictas y, en ocasiones, han demostrado problemas de seguridad. Por lo tanto, la administración biolítica tiene una capacidad incomparable para transfectar regioselectivamente neuronas y otros tipos de células dentro de tejidos viables. Como el oro no es tóxico, los avances adicionales en el uso de biolíticos podrían allanar el camino para usos biomédicos como la administración farmacéutica transdérmica, la administración de genes in vivo no invasiva, así como las terapias génicas no virales localizadas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de pistola génica Helios	Bio Rad	165-2431 Pistola génica	y estación de preparación de tubos
HEPES	Sigma	83264-100ML-F
NaCl	Sigma	S7653-250G
KCl	Sigma	P9333-500G
Na2HPO4	Sigma	S7907-100G
KH2PO4	Sigma	P9791-100G
0.2 &; m unidad de filtro estéril	Millipore	SCGPU05RE	a medio filtrante
DMEM	Gibco	21885-025
Suero fetal para terneros	Gibco	10270-098
D-Glucosa	Sigma	G8270-100G
N2	Life Technologies	17502-048
Penicilina/Estreptomicina	Sigma	p4333
Polivinilpirrolidona	Sigma	856568-100G
Etanol	Sigma	277649-100ML
Espermidina	Sigma	S2626
Agarosa	Bio Rad	161-3100EDU
Vibroslicadora	Laica	VT1200	Utilizamos un montaje
		pistola genética	Construido internamente en la U de T
			cultivo celular humidificada Nanopartículas
oro	citodiagnóstico	G-40-20
pEYFP-N1	Clontech
Cortador de tubos	Bio Rad	165-2422
Tubo de Tefzel	Bio Rad	165-2441
Barril			Hecho a medida por el LMB
Inserto de cultivo celular	Millipore PICM0RG50
Paraformaldehído	Sigma	76240 Fluka
Microscopio			para mayor comodidad
Microscopio			definido por el usuario para su uso
Portaobjetos	de vidrio VWR	2588-CA48323-185
Microcover de vidrio	VWR	2448-CA48366-067-1
Medios de montaje Vectashield Laboratorios	vectoriales	H-1400