Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.
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Artículo de método
Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) se pueden generar con las metodologías de reprogramación a base de lentivirus. Sin embargo, los rastros de genes potencialmente oncogénicos restantes en regiones activamente transcrito del genoma, limitan su potencial para su uso en aplicaciones terapéuticas humanas 1. Además, los antígenos no humanos derivados de la reprogramación de células madre o la diferenciación en derivados terapéuticamente relevantes se oponen a estas hiPSCs se utilicen en un contexto clínico humano 2. En este vídeo, se presenta un procedimiento para la reprogramación y analizar hiPSCs factoriales libre libres de transgenes exógenos. Estos hiPSCs se pueden analizar para detectar anomalías de expresión génica en el intrón específico que contiene el lentivirus. Este análisis puede llevarse a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa sensible (PCR), que tiene una ventaja sobre técnicas menos sensibles utilizado anteriormente para detectar diferencias de expresión génica 3. La conversión total enbuenas prácticas de fabricación de grado clínico (GMP), permite relevancia clínica humana. Nuestro protocolo ofrece otra metodología, siempre que los criterios actuales de salvaguarda ampliarán e incluir los derivados basados en hiPSC caracterizados factoriales libre para aplicaciones fines terapéuticos humanos derivadas hiPSCs GMP-grado, que debe eliminar cualquier riesgo inmunogenicidad debido a antígenos no humanos. Este protocolo es ampliamente aplicable a lentiviral reprogramado células de cualquier tipo y proporciona un método reproducible para la conversión de células reprogramadas en condiciones GMP grado.
Introducción
Se ha demostrado que las células humanas adultas son capaces de experimentar remodelación y reprogramación epigenética, como resultado de la expresión lentiviral de cuatro factores de transcripción clave4,5. Un avance importante en el campo de la reprogramación fue el uso de un único casete de células madre lentivirales sometidas a impuestos especiales (STEMCCA), que albergaba los cuatro factores de transcripción de reprogramación que permitían una relación estequiométrica precisa de la expresión de proteínas6. Además, cuando se transduce en una multiplicidad específica de rangos de infección, STEMCCA puede conducir a eventos de integración genóm....
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Protocolo
NOTA: Este método se utilizó en la investigación publicada en Awe et al 10..
1. Reprogramación Humana Adulto fibroblastos dérmicos con STEMCCA
- Fibroblastos dérmicos Descongele adultos humanos (HUFS), paso 4 o inferior, en un 37 ° C baño de agua durante 2 minutos, teniendo cuidado de no sumergir la parte superior del vial con agua.
- Coloque la suspensión 1 ml de fibroblastos humanos en un vial cónico de 15 ml y colocar lentamente 4 ml de medios estándar HUF, pre-calentado a 37 ° C, de una forma gota a gota, para diluir a cabo sulfóxido de dimetilo (DMSO) y volver a suspender las células.
- Ce....
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Resultados
Se presenta un protocolo para derivar hiPSCs factor libre de grado clínico utilizando el enfoque basado reprogramación lentiviral-STEMCCA. La figura 1A muestra una imagen representativa de tres diferentes líneas hiPSC previamente extirpada, después de la reprogramación con el enfoque STEMCCA sobre una capa de MEFs. La principal ventaja del enfoque de reprogramación STEMCCA radica en el éxito reprogramación consistente alcanzado por múltiples científicos, en diferentes grupos y las ubicaciones de investi.......
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Discusión
Se describe una metodología de derivar hiPSCs factor libre y hacerlos clínicamente relevante mediante la conversión de estas células en condiciones GMP grado de diferenciación celular aguas abajo en futuras terapias humanas. Aunque este protocolo es ampliamente aplicable a una variedad de tipos de células, que elegimos para reprogramar fibroblastos dérmicos humanos, debido a la facilidad de extracción de la paciente y su aplicabilidad a la terapéutica humana personalizados. Una vez que se subsanen las limitaciones en cu.......
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Divulgaciones
James A. Byrne (JAB) y Agustín Vega-Crespo reciben fondos de investigación de Fibrocell Science, Inc. JAB es consultor científico de Fibrocell Science, Inc. Ningún otro autor tiene intereses contrapuestos que divulgar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Patrick C. Lee, Cyril Ramathal y Saravanan Karumbayaram (SK) por su asistencia en la realización de los experimentos de derivación y caracterización de iPSC; Aaron Cooper por realizar los experimentos de análisis de iPSC; Vittorio Sebastiano y Renee A. Reijo Pera por dirigir los esfuerzos iniciales de reprogramación; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack y Donald B. Kohn por dirigir el establecimiento de las instalaciones de GMP de UCLA que permiten la conversión y caracterización de iPSC de grado clínico; Gustavo Mostoslavsky por proporcionarnos el vector de reprogramación policistrónico STEMCCA. Este trabajo se basa en una colaboración de inv....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medios y reactivos | |||
| DMEM/F12 (medios basales) | Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU. | )11330057 | |
| Suero fetal bovino | Invitrogen | 16000044 | |
| Medio esencial mínimo (MEM) aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicilina-estreptomicina, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar en &menos; 20 ° C |
| Suero knockout de reemplazo | Invitrogen | 10828028 | Descongelar a 4 & grados; C, alícuota y almacenar en &menos; 20 ° C |
| Tripsina/EDTA, 0,5% | Invitrogen | 15400-054 | Diluir el stock al 0,05% en 1x PBS |
| Factor básico de crecimiento de fibroblastos | GlobalStem (Rockville, MD, EE. UU.) | GSR-2001 | Reconstituir a 10 µ g/ml de stock en albúmina sérica bovina al 0,1% disuelta en 1x PBS y almacenar en &menos; 80 ° C |
| β-mercaptoetanol | Millipore (Billerica, MA, EE. UU.) | ES-007-E | |
| Matrigel (matriz de membrana basal) | BD Biosciences (San José, CA, EE. UU.) | 356231 | Vial de Matrigel de caldo diluido con 10 ml de DMEM/F12 mientras está en hielo para una dilución 1:2. Alícuota y almacenamiento en &menos; 20 °C. |
| CELLstart (sustrato sintético) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, EE. UU.) | 04-0012-02 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basilea, Suiza) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medio/medio de congelación | Lonza (Basilea, Suiza) | 12-769E | |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen 15628019 | ||
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, EE. UU.) | 161-3101 | |
| Gelatina, de piel porcina | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Hacer stock al 0,2% en PBS, autoclave y almacenar a temperatura ambiente. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canadá) | 5850 | Combine el Suplemento 5x con el medio básico, alícuota y almacene a 4 ° C hasta por 2 semanas. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Cultivo Medio | Tallo | 05-100-1A Descongelar | a 4 & ° C O/N, alícuota y almacenamiento a 4 ° C hasta por 2 semanas. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, EE. UU.) | ANT-PM-1 | |
| Accutase (Reactivo de disociación) | Invitrogen | A1110501 | |
| Burro anti-Pollo IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, EE. UU. | )703-546-155 | |
| Polibreno/agente de transfección | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12 pocillos | VWR (West Chester, PA, EE. UU.) | 29442-038 | |
| placas de 6 pocillos | VWR | 29442-042 | |
| placas de 10 cm | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| aguja de calibre 18 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EE. UU.) | 148265D | |
| aguja de calibre 21 | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Citómetro de flujo | KSystem by Nikon (Tokio, Japón) | ||
| BD FACSDiva Versión 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit Invitrogen | K182000 | ||
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit KAPA | Biosystems (Wilmington, MA, EE. UU.) | KK2601 | |
| Kit de aislamiento de ARN de alta pureza | Roche | ||
| Transcriptor de primera cadena Kit de síntesis de ADNc | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack | Sialix (Newton, MA, EE. UU.) Paquete | ||
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies y Stemgent | Consta de partes iguales de mTeSR1 y Nutristem | |
| Combined Media 2 | StemCell Technologies y Stemgent | Consta de partes iguales de TeSR2 y | |
| Nutristem HUF Media | Dulbecco' Águila modificada' s medium/F12 [DMEM/F12] suplementado con un 10% de suero fetal bovino, 1x aminoácidos no esenciales, 1x Glutamax y 1x Primocin | ||
| Medios de Células Madre | DMEM/F12 suplementado con un 20% de reemplazo de suero knockout, 1x Glutamax, 1x aminoácidos no esenciales, 1x Primocina, 1x β-mercaptoetanol y 10 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco' Águila modificada' s medio/F12; PBS: solución salina tamponada con fosfato. | |||
Referencias
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al.
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