Abstract
Gewonde CNS axonen falen om zich te vernieuwen en vaak terug te trekken uit de buurt van het letsel plaats. Axonen gespaard van het initiële letsel kan later secundaire axonale degeneratie ondergaan. Gebrek aan groeikegel vorming regeneratie, en verlies van andere gemyeliniseerde axonen verhogingen in het ruggenmerg sterk beperkt neurologisch herstel na letsel. Om te beoordelen hoe het centrum van gemyeliniseerde axonen van het ruggenmerg reageren op letsel, ontwikkelden we een ex vivo levende ruggenmerg model gebruik te maken van transgene muizen die geel fluorescerend eiwit in axonen en een centraal en zeer reproduceerbare lasergeïnduceerde dwarslaesie te betuigen aan het lot van documenteren axonen en myeline (lipofiele fluorescerende kleurstof Nile Red) na verloop van tijd met behulp van twee-foton excitatie time-lapse microscopie. Dynamische processen zoals acute axonale verwonding, axonale retractie en myelinedegeneratie best bestudeerd in real-time. Echter, de niet-focale aard van kneuzingen gebaseerde verwondingen en bewegingsartefacten ondervondentijdens de in vivo ruggenmerg beeldvorming make differentiëren primaire en secundaire axonale letsels reacties met behulp van hoge resolutie microscopie uitdagend. De ex vivo ruggenmerg model beschreven nabootst verscheidene aspecten van klinisch relevante contusie / compressie-geïnduceerde axonale pathologieën zoals axonale zwelling, sferoïde vorming, axonale doorsnijding en peri-axonale zwelling verschaffen een bruikbaar model voor deze dynamische processen in real-time bestuderen. Grote voordelen van dit model zijn uitstekend tijdruimtelijk resolutie die differentiatie tussen de primaire belediging die direct verwondt axonen en secundaire letsel mechanismen maakt; gecontroleerde infusie reagentia direct aan het perfusaat baden het koord; precieze veranderingen van het milieu milieu (bijvoorbeeld calcium, natrium-ionen, bekend bijdragers aan axonale blessure, maar bijna onmogelijk om te manipuleren in vivo); en muizen modellen bieden ook een voordeel als ze de gelegenheid bieden om te visualiseren enmanipuleren genetisch geïdentificeerd celpopulaties en subcellulaire structuren. Hier beschrijven we hoe te isoleren en het beeld van de levende ruggenmerg van muizen tot dynamiek van acute axonale letsels vast te leggen.
Introduction
Degeneratie van axonen is een prominent oorzaak van morbiditeit zelfs diverse neurologische aandoeningen zoals neurotrauma, beroerte, auto-immune en neurodegeneratieve ziekten. Anders dan het perifere zenuwstelsel (PNS), centraal zenuwstelsel (CNS) axonen een beperkte regeneratiecapaciteit eenmaal gewonden door zowel intrinsieke als extrinsieke barrières (dwz remmende moleculen axonale groei geproduceerd gedurende littekenvorming en vrijgemaakt tijdens myelinedegeneratie) 1 -7. Hoewel een aantal van deze belemmeringen zijn uitgebreid onderzocht, therapeutische interventies gericht op CNS axonale degeneratie te voorkomen, bevorderen robuuste axonale regeneratie, en het herstel van functionele connectively, beperkt blijven.
Axonen eenmaal gescheiden van hun soma ondergaan stereotiep werkwijze degeneratie genoemd Wallerian degeneratie die wordt gekenmerkt door axonaal opzwellen, sferoïde vorming en eventuele fragmentatie (beoordeeld 8). Incontrast, de proximale stomp die in continuïteit met het soma van een doorgesneden perifere axon blijft, vormt een zwelling op zijn einde, sterft terug naar het dichtstbijzijnde knooppunt van Ranvier, en kan dan starten groeikegel vorming, een belangrijke voorwaarde die nodig is voor de daaropvolgende axonale regeneratie 9-11. In tegenstelling, de proximale axonale uiteinden van veel centrale axonen Kenmerkende "endbulbs" of terugtrekking bollen, niet groei kegels gevormd en in plaats trekken weg van de verwonding waar ze blijven maanden na verwonding 12-15. Naast de primaire axonale verwonding, kunnen extra axonale schade / verlies eveneens gebeuren axons die voornamelijk worden gespaard van de oorspronkelijke verwonding. Dit vertraagde axonaal verlies van aanvankelijk gespaard axonen wordt aangeduid als secundaire axonale degeneratie. Deze inherente respons van CNS axonen schade maakt functionele axonale regeneratie nog moeilijker doel te bereiken in de hersenen en het ruggenmerg.
Hoewel hallmarks van axonale schade (bv spheroïde vorming, retractie bollen) zijn goed gekarakteriseerd uit post-mortem weefsel en experimentele modellen van axonale degeneratie, heeft opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze dynamische processen is beperkt. De meeste van deze studies zich op statische eindpunt waarnemingen die inherent niet aan individuele axonale reacties in de tijd vast te leggen. Hoewel exogeen toegepaste axonale tracers zijn nuttig axonale reacties verduidelijken statische secties en tijdens live beeldvorming geweest, heeft de beschikbaarheid van genetisch gecodeerde axonale markers sterk verbeterd ons vermogen om axonen in real time via fluorescentie microscopie visualiseren. Inderdaad, een rudimentaire rapport van Kerschensteiner en collega's eerste directe bewijs van axonale degeneratie en regeneratie voorzien in vivo gebruik Thy1 GFP-S muizen die groen fluorescerend eiwit coderen in subsets van neuronen die hun prognoses te sturen in de dorsale kolommen van de wervelkolomkoord 16. Live beeldvorming benaderingen met behulp van twee foton laser scanning microscopie (TPLSM) en genetische fluorescerend eiwit etikettering van cellen van belang blijft om direct bewijs en mechanistisch inzicht te geven in vele uiteenlopende dynamische processen zoals axonale degeneratie, Ca 2+ signalering, axonale regeneratie, astrocyten fysiologie, microglia fysiologie, en de respons op letsel 17-25.
In tegenstelling tot de neuronen, zeer weinig bekend van myeline op schadelijke stimuli in real-time. Myeline is een essentieel onderdeel van de witte stof geproduceerd en onderhouden door oligodendrocyten in het CZS en Schwann cellen in de PNS. Myeline isoleert 99% van het oppervlak van axonen en daarmee zorgt voor een hoge weerstand, lage capaciteit beschermend omhulsel dat een snelle en efficiënte saltatorische impuls vermeerdering, onlangs beoordeeld door Buttermore et al. 26 ondersteunt. Om de dynamische respons van myeline schade we de solvatochrome, lipofiele vangenfluorescerende kleurstof Nile Red 27. De solvatochrome eigenschappen van deze vitale vlek laten spectrale verschuivingen van haar emissiespectrum dat afhankelijk is van de fysisch-chemische omgeving 28,29 is. Deze eigenschappen zijn nuttig om inzicht te krijgen in de mechanismen van axomyelinic letsel en kan worden gevisualiseerd met behulp van geschikt gekozen koudlichtspiegel en emissie-filters of opgelost met behulp van spectrale microscopie 27. Bijvoorbeeld, Nile Red's emissiespectrum blauw verschoven in minder polaire lipide-rijke omgevingen zoals die gevonden in adipocyten en normale CNS myeline (piekemissie ~ 580-590 nm) 27. In tegenstelling tot deze vitale kleurstof's emissiespectrum pieken op ~ 625 nm in endbulbs gevormd als axonen ondergaan axonale dieback 27. Hoewel de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan deze spectrale verschuivingen specifiek in endbulbs versus normale myeline onduidelijk blijven, kunnen dergelijke spectrale veranderingen onderliggende veranderingen in eiwitaccumulatie of desorganisatie leidt tot onthullenblootstelling van hydrofobe bindingsplaatsen 27.
Terwijl in vivo beeldvorming de ultieme criterium voor het waarnemen ruggenmerg axonale letsels dynamiek in hun eigen omgeving, is het technisch moeilijk en aanzienlijke chirurgische deskundigheid vereist en vaak herhalen operaties aan de dorsale kolom die experimentele artefacten kunnen introduceren blootgesteld (bijvoorbeeld ontsteking en littekenvorming vorming). Daarnaast wordt kostbare apparatuur vaak nodig om ophanging en positionering van een intact dier onder de microscoop objectief mogelijk. De dieren moeten zorgvuldig worden gecontroleerd en te zorgen dat ze blijven warm, om ervoor te zorgen vloeistoffen worden bijgevuld, en om ervoor te zorgen dat er geen tekenen van hypoxie als gevolg van langdurige narcose beeldvorming sessies. Het laatste is buitengewoon belangrijk als axonen en myeline absoluut vereist constante perfusie en voldoende zuurstof om levensvatbaar te blijven. Echter vaak niet gerapporteerd of gemonitord meeste in vivo studiesdate. Daarnaast beweging artefacten als gevolg van de hartslag en de ademhaling (isofluraan verdoofd volwassen muis: ~ 300-450 slagen per minuut (BPM) is optimaal tot 97-98% zuurstofverzadiging (normaal tarief ~ 632 BPM) en onderhouden van ~ 55-65 ademhalingen per min (normaal tarief is ~ 163 ademhalingen per minuut), respectievelijk)) 30 tegengekomen tijdens in vivo ruggenmerg beeldvorming make differentiëren primaire en secundaire axonale letsels reacties met behulp van hoge resolutie fluorescentie microscopie uitdagend als zelfs de snelste laser scans onvermijdelijk zijn onderworpen aan deze beweging artefacten. Vooruitgang in ultrasnelle resonante scanners gecombineerd met een implanteerbare stijve vertebrale frame venster kan beeldvorming van de muis ruggenmerg in wakkere dieren toelaten, maar snellere cyclustijden onvermijdelijk de signaal-ruisverhouding beelddegraderende minder worden. Verdere verbeteringen in het ruggenmerg beeldvormende technieken zoals die momenteel worden gebruikt voor beeldvorming van de hersenen kunnen veel van deze obstakels te overwinnen en te beperken potentiële verwart geïntroduceerd door inadequate weefsel perfusie, bijvoorbeeld, 31-33.
Veel van wat er bekend is over materie fysiologie en mechanismen van stof schade wit wit is bepaald met behulp van in vitro of ex vivo voorbereidingen van de witte stof van de oogzenuw, perifere zenuwen en stroken van het ruggenmerg witte stof 34-41. Deze preparaten blijven onze kennis van witte stof schade mechanismen vooruit als zij toestaan gecontroleerde veranderingen in omgevingsfactoren, gecontroleerde toepassing van drugs en reagentia, functionele evaluaties met behulp van elektrofysiologie en directe fluorescentie microscopie observaties van axonen en myeline in levend weefsel. Toch een aantal eerdere benaderingen van axonen van het ruggenmerg dorsale kolom stroken of ventrale witte stof stroken in acht onvermijdelijk verwonden oppervlak axonen tijdens het verwijderen stadium dat de reactie van de voet tegen axonen kunnen beïnvloeden. Om te profiteren van de experimentele manipulaties boven en schade te voorkomen aan de very vezels onderzochte, gebruiken we een ex vivo ruggenmerg model zoals het voorkomt direct contact van het dorsale aspect van het koord. Zo is de architectuur van de pia mater en aangrenzende oppervlakkige dorsale kolom axonen levensvatbaar en onverstoord blijven tijdens isolatie.
Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige benadering die directe visualisatie centrale gemyeliniseerde axonen ze dynamisch reageren op een focaal letsel realtime tot 8 laat - 10+ uur na verwonding. De lasergeïnduceerde dwarslaesie (LISCI) model maakt onderscheid tussen primaire en secundaire axonale letsels mechanismen als de primaire laesie (ablatie ter plaatse) blijft ruimtelijk beperkt in de tijd. De open-bad beeldvorming kamer is toegankelijk voor therapeutische interventie, reagens levering, en milieu-manipulaties. Vermeende axomyelinic beschermende middelen kunnen snel worden beoordeeld in real-time door directe waarnemingen versus langdurige en kostbare experimenten met weefsel procesing, snijden, immunokleuring, het vastleggen van beelden, en de analyse en biedt daarom een bruikbaar surrogaat model om acute reacties en beschermende manipulaties beoordelen voordat het testen van de experimentele agenten in levende dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in het kader van richtlijnen die door de Institutional Animal Care en gebruik commissie aan de Universiteit van Louisville ingesteld, die vastzit aan federale regelgeving.
1. Bereiding van Laag Ca2 + en 2 mM Ca2 + Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) Perfusates
- Bereid 2x lage Ca 2+ (0,1 mM) Stock C buffer, 2x normale Ca 2+ (2 mm) Stock Een buffer, en 2x Stock B buffer zoals beschreven in Tabel 1. De individuele voorraad oplossingen stellen wijziging van ionen (bv nul of Ca 2+) en kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal één maand.
- Voor intracardiale perfusie tijdens dissectie, voeg 100 ml 2x lage Ca 2+ Stock C en 100 ml 2x Stock B in een plastic fles te 1x lage Ca 2+ aCSF maken. Meng en bewaar overnacht bij 4 ° C of maak verse.
- Voor perfusie van ex vivo ruggenmerg tijdens IMAGing, 500 ml 2x normale Ca2 + De A en 500 ml 2x voorraad B in een 1 L fles met 1x aCSF genereren. Meng en bewaar overnacht bij kamertemperatuur of maak verse.
- Stel de pH van aCSF buffers tot 7,4. Terwijl de aCSF bij kamertemperatuur, zet de lage Ca2 + aCSF op ijs en vervolgens bel beide buffers met carbogen gas (95% O2; 5% CO2) gedurende 30 min voor continu gebruik en tijdens perfusie.
2. Voorbereiding van ex vivo beeldvorming kamer
- Wikkel een verwarming deken (geen automatische uitschakeling) rond de aCSF fles en warmte aan te passen aan lage / gemiddelde instelling.
- Plaats een speciale aCSF perfusie lijn in de fles verbonden met een perfusiepomp en in-line kachel die wordt bestuurd door een bipolaire temperatuurregelaar en feedback temperatuursensor zoals getoond in figuur 1A.
- Bevestig een platte microscoop podium insert (152 x 102 mm) om de 2-foton excitatie / confokale microscoop podium voorzien van een lekbak.
- Plaats een grote open-bad perfusie kamer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) in de lekbak om tegemoet en bieden een continue stroom van vers zuurstofrijk aCSF naar de ex vivo ruggenmerg (zie Figuur 1B naar een geschikte ex vivo beeldvorming kamer-ontwerp).
- Sluit metalen uitgang van de in-line heater om de ex vivo beeldvorming kamer met behulp van geschikte slangen. Een dun absorberend kussen onder de ex vivo beeldvorming kamer om de temperatuur van de buffer / weefsel tijdens beeldvorming handhaven.
- Houden de ex vivo beeldvorming kamer naar de bodem van de lekbak / podium insert behulp verwijderbare kleverige overstag. De buigzaamheid van het kleverig kopspijker zal de kamer te worden aangepast om te garanderen lichtpad doel is loodrecht op het weefseloppervlak. Gebruik indien nodig een bullseye niveau om de kamer aan te passen.
- Secure eenin-line heater feedback temperatuursonde in de buurt van de kamer fluiduminlaat en een roestvrijstalen zuigbuis aangesloten op een vacuüm lijn op de kameruitlaat. Magnetische tape en passende micropipet houders zijn nuttig in dit verband. Schakel het vacuüm bron.
- Zet de perfusie pomp om te beginnen met het vullen van de beeldvorming kamer met zuurstofrijk aCSF. Stel de perfusiepomp tot 1,5-2 ml per min.
- Regel het volume van aCSF in de beeldvorming kamer door het aanpassen van het vacuüm lijn. Het is belangrijk dat er genoeg aCSF in de beeldvorming kamer naar het ruggenmerg segment dekken en voldoende werkafstand tussen water dompelen objectief en het weefseloppervlak. Myeline en axonen kan nadelig worden beïnvloed als het weefsel segment is niet volledig ondergedompeld in vers zuurstofrijk aCSF leidt tot experimentator-geïnduceerde artefacten.
- Pas de in-line heater temperatuur controller zodat perfusaat temperatuur in de beeldvorming kamer ligt vlak bij kamertemperatuur.
- Euthanaseren een volwassene 6-10 week oud thy1 -YFP transgene muis (gebruik de juiste stam die fluorescerend eiwit expressie in ganglion neuronen heeft) door het injecteren van een overdosis van de anesthesie natrium-pentobarbital (200 mg / kg) via intraperitoneale injectie.
- Eenmaal onder het juiste niveau van de anesthesie (bijvoorbeeld geen reactie op teen knijpen en verlies van knipperreflex), zorgvuldig de huid bovenliggende het ruggenmerg en de hersenen met chirurgische clippers scheren. Reinig de huid met behulp van betadine en 70% ethanol pads.
- Spray borst / buik gebied met 70% ethanol, dan perfuse het onderwerp transcardiaal behulp van gekoelde, carbogen geborreld laag Ca 2+ aCSF. (Zie Figuur 1C voor suggereerde dissectie bench top ingesteld).
- Omdat de lever verbleekt, zet de perfusie naald in het hart met behulp van een kleine clip. Draai het onderwerp op om de geschoren dorsale zijde vanhet onderwerp en veeg het geschoren gebied met 70% ethanol.
- Maak een dorsale incisie langs de middellijn vanaf de neus tot hip met behulp van dissectie schaar om de hersenen en de wervelkolom (figuur 2A) bloot. Zet de voorbereiding door het plaatsen van pinnen op de neus en heup.
- Met behulp van een dissectie microscoop vanaf dit punt, stevig dwars door de dorsale oppervlak van de schedel op het niveau van de olfactorische bollen. Plaats een van de schaar uiteinden in de laterale randen van de incisie en snijd langs de randen van het schedeldak bilateraal tot het cerebellum.
OPMERKING: niet helemaal schedeldak uitsnijden zoals later nodig om de overliggende weefsel opheffen van het ruggenmerg gehele dissectie (zie figuur 2B). - Til het schedeldak naar de hersenen bloot te leggen. Zachtjes snijd de linker en rechterkant van de interparietal bot (gelegen aan de kleine hersenen) en trek hem terug caudaal naar de hersenstam / ruggenmerg bloot (figuur 2C
- Gebruik fijne getipt schaar gehouden op een hoek van 45 ° aan het tafeloppervlak en snijd de wervels bilateraal gewoon inferieur aan de achterste zenuwwortels.
OPMERKING: het contact met de heldere witte dorsale kolommen vermijden. Deze vezels zijn degenen die worden afgebeeld (Figuur 2D) en kan gemakkelijk worden beschadigd. - Til het keppeltje en de dorsale oppervlak van de wervelkolom met fijne getipt tang, zachtjes trekken de bovenliggende weefsel in een stuk als bezuinigingen zijn gemaakt om het ruggenmerg bloot. Blijf wervels gesneden om de thoracale niveau 1-2 cm segment van de cervicale koord voor latere beeldvorming (figuur 2E) te isoleren.
- Gebruik een schaar om het weefsel / bot parallel gesneden om de wervelkolom en duidelijke weefsel onder de kolom. Maak deze bezuinigingen zo horizontaal mogelijk. Het is zeer belangrijk dat het weefsel plat in de kamer zodat het koord niveau beeldvorming.
- Gebruik een # 11 scalpel aan de hersenstam doorsnijden (voorbij debeëindiging van de fasciculus gracilis vezels) en bij de thoracale niveau om de cervicale ruggenmerg segment isoleren (zie figuur 2F). Gebruik een schaar om weefsel / bot afgesneden op deze zelfde twee punten. De geïsoleerde weefsel moet 2/3 van de wervelkolom omvat de caudale hersenstam, cervicale uitbreiding, en de bovenste thoracale ruggenmerg (figuur 2G) bevatten.
- Plaats de geïsoleerde wervelkolom in een petrischaal van-carbogen geborreld, gekoeld lage Ca 2+ aCSF. Indien nodig, trim het weefsel onder de wervelkolom tot hij plat ligt in het gerecht.
- Breng de geïsoleerde wervelkolom de ex vivo beeldvorming kamer en geleidelijk de perfusievloeistof temperatuur gedurende 1 uur tot 36-37 ° C. Houd deze temperatuur tijdens de beeldvorming.
4. Plaatsing van ex vivo Spinal Cord in beeldvorming kamer en myeline Labeling met Nile Red
- Zet de wervelkolom voorzichtig in de imaging kamer met een passende fitting stukje ingedrukt bewerkt met een verticale grid platform bestaande uit fijne Lycra draden (verwijder middelste draden van grid platform om ruimte voor het ruggenmerg mogelijk te maken; zie figuur 3A).
- Ontdooi een hoeveelheid van Nile Red (5 mM voorraad in DMSO en 0,22 urn gefiltreerd, kunnen worden bewaard gedurende 1 maand bij 4 ° C, of 6 maanden bij -20 ° C in het donker). Net voor het toevoegen Nile Red de beeldvorming kamer, verminderen de stroom van de perfusie aan en stel de vacuümleiding te zorgen voor de vloeistof in de kamer bedekt altijd de ruggenmerg.
- Voeg 5-10 ul Nile Red voorraad oplossing voor de beeldvorming kamer in de buurt van het caudale einde van het koord (Figuur 3B). Gebruik een pipet 1 ml om voorzichtig te mengen Nile Red door de kamer. Laat Nile Red om te verblijven in de kamer voor 1-2 min, dan plaats vacuüm lijn terug en stel perfusiepomp tot 1,5-2 ml per min continu perfuseren het ruggenmerg.
- Verhogen zorgvuldig de microscoop podiumen lijn het doel met het midden van het ruggenmerg segment en mediaal via dorsale kolommen totdat het water immersie objectief is ongeveer 10 mm vanaf het oppervlak van de aCSF in de kamer. Gebruik de microscoop neusstuk focuswiel langzaam brengen de doelstelling naar beneden totdat deze net tegen het oppervlak van de aCSF. Gebruik een epifluorescerende lichtbron om de dorsale kolommen richten in het gezichtsveld (Figuur 3C).
5. Ex vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met TPLSM en Laser-induced Spinal Cord Injury (Lisci)
OPMERKING: De achterste ader biedt een nuttige marker om het weefsel als het gracile fasciculus vezels te centreren (afkomstig van cellichaam van ganglia en opklimmen van T6 en beneden langs de middellijn van het ruggenmerg) lopen parallel aan het bloedvat. De dikkere YFP + cervicale dorsale wortel projecties bieden ook een bruikbare marker als de vezels opstijgen en dalen de zijkanten aan de Y-FP + gracile fasciculus vezels die zijn kleiner in diameter.
- Zodra de ruggenmergweefsel adequaat is afgestemd, switch naar laser scanning mode om basislijn beeldvorming van de oplopende gracile fasciculus gemyeliniseerde vezels voeren. Om zowel YFP en Nile Red wekken, gebruikt een twee-foton laserbron afgestemd op 950 nm golflengte (~ 17 mW, gemeten bij de uitgang van een 25X, NA 1,1 objectief) en geschikte koudlichtspiegel (DM) en banddoorlaatfilters de fluorescente emissie isoleren van de fluoroforen (we 525/50 DM560, DM640 600/60 en 685/70 aan YFP en Nile Red scheiden in geel-oranje en rood uitgebreide kanalen, respectievelijk).
- Als er meer dan 3% van de axonen tonen axonale sferoiden tijdens basislijn beeldvorming (30-60 min), gooi de voorbereiding te wijten aan-experimentator geïnduceerde artefacten.
- Laten een Lisci door vergroot het gezichtsveld 30.3X (een ~ 20 urn diameter ablatie te maken). Stem de laser 800 nm, en verhogen de kracht van de laser ~ 110 mW bijhet monster. Laat 5 volledige gezichtsveld laser scans om ervoor te zorgen vezels zijn volledig doorsneden.
- Bevestig Lisci door het veranderen van de laser-instellingen terug te imaging-instellingen (950 nm, 17 mW bij het monster, 2.08X) en scan het weefsel aan de ablatie te visualiseren. Controleer de diameter van de ablatie en de primaire geablateerd axonen volledig doorsneden (zie figuur 3D). Gebruik time-lapse instellingen op de microscoop combinatie met z vangen van de dynamische respons van axonen en myeline schade tot 10/08 + uur na verwonding opgenomen.
OPMERKING: Als de ablatie onvolledig is (dat wil zeggen, onvolledige doorsnijding van vezels), gooi de voorbereiding, zoals het bepalen van de primaire en secundaire letsel mechanismen zullen beschaamd worden. Bovendien kunnen geïsoleerd ruggenmergsegmenten worden afgebeeld tot 24 uur na LISCI met slechts milde tot matige LISCI onafhankelijk weefselschade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Details van een geschikt laboratoriumopstelling nodig isoleren, onderhouden levensvatbaarheid en het ex vivo ruggenmerg wordt getoond in figuur 1. De microscoop uitgerust te zijn met een afstembare gepulseerde femtosecondelaser passende dicroics en emissiefilters, en een water- dompelen objectief met een hoge numerieke apertuur (≥1.0). Om de levensvatbaarheid van het ruggenmerg te verzekeren tijdens de dissectie, moet de procedure worden uitgevoerd in aanwezigheid van gekoelde geoxygeneerde laag Ca2 + aCSF dat voldoende Ca 2+ maakt de geïsoleerde axonale membranen afdichting 42. Doet u dit niet kan axomyelinic schade waaronder scheiding van myeline uit de axolemma en axonale spheroïde formatie duidelijk zichtbaar tijdens de uitgangssituatie beeldvorming veroorzaken. Representatieve beelden van de dissectie proces en isolatie van de ex vivo ruggenmerg wordt getoond in figuur 2. Na afsluiting van de levensvatbaarheid van het ruggenmerg maintained door continue perfusie van geoxygeneerd aCSF die bij 36-37 ° C wordt gehouden. De myeline vlek Nile Red 27,43 kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de perfusie kamer en basislijnregistratie van de fasciculus gracilis gemyeliniseerde axonen kunnen (figuur 3) beginnen.
Representatieve beelden van gracile fasciculus gemyeliniseerde axonen zijn weergegeven in figuur 4. Onder basislijnomstandigheden timelapse TPLSM opnames onthullen parallel uitgelijnd YFP + axonen gevat in myeline (Nile Red) met grotendeels constante diameter over de lengte van de axon. Enkele axonale sferoiden of andere morfologische tekenen van axonale degeneratie zijn aanwezig. Vanwege de solvatochrome eigenschappen van Nile Red en de lipide en eiwitgehalte van myeline, wordt myeline gekleurd geel-oranje, terwijl rijen van vermeende oligodendrocytceldood lichamen lijken donkerder oranje (figuur 4A). Fijne details zoals knopen van Ranvier kan worden opgelost (bv pijlen Op 10 min na Lisci, onmiddellijk doorsneden axonen (primaire letsel) gelegen rostrale en caudale aan de ablatie plaats beginnen te weg van de schade ter plaatse te trekken en te vormen sigmoidaal-achtige spoelen binnen gezwollen ballonvaren myeline. Myeline ensheathing axonen afstandsbediening om de ablatie verschijnen ongewijzigd op dit tijdstip. Met 40 min post-Lisci meest primaire doorsneden axonen en axonen ondergaan secundaire degeneratie (dwz in eerste instantie gespaard van de belediging, maar later gedegenereerde) vormen karakteristieke endbulbs als ze trekken uit de laesie (Figuur 4B). Ongeveer een derde van deze doorsneden axonen ondergaan pan-fragmentatie waar de proximale segment eerste zwelt, vormt axonale bolletjes, en uiteindelijk doorsnijdt het axon in verschillende onregelmatige lengtes van axon 43. Scheiding van myeline uit de axonen (peri-axonale zwelling) en vesiculaire degeneratie van myeline is ook duidelijk. Na verloop van tijd, primaire en secundaire trandoorsneden axonen verder terugtrekken uit de buurt van de laesie site, axonen direct aan weerszijden van de ablatie website ondergaan secundaire degeneratie en peri-axonale zwelling wordt prominenter evenals myeline zwelling en vesiculaire degeneratie (Figuur 4D-G, zie ook 43). Een duidelijk verschil in de mate van axonale terugtrekken blijkt tussen proximale axonale stompen (caudaal van laesie) en hun distale segmenten (rostraal laesie) die bestemd zijn om Wallerian degeneratie (Figuur 4D-G) te ondergaan. Axonen aanvankelijk gespaard door de Lisci ondergaan vertraagde secundaire degeneratie (figuur 4H). Een representatief controle-experiment zonder Lisci suggereert dat lang beeldvorming sessies (tot 13 uur na snoer isolatie in dit voorbeeld) mogelijk zijn zonder nadelige effecten integriteit witte stof (Figuur 4I, J). Representatieve high-resolutie afbeeldingen axomyelinic veranderingen na LISCI zijn weergegeven in figuur 5. Door 3 uur na Lisci, hebben diverse proximale (caudale) axonen uit de buurt van de laesie site waar ze binnen gezwollen myeline buizen die uit de buurt van het axon zijn gescheiden blijven ingeschoven. Andere axonale endbulbs lijken te zijn afgedekt door myeline (Figuur 5A). Axonen grenzend aan de ablatie website ondergaan secundaire degeneratie terwijl anderen onaangetast verschijnen. YFP laag / negatief vermeende blaasjes (lichtblauw) binnen het axon en axonale endbulbs zijn ook aanwezig. In tegenstelling tot caudaal terugtrekken vezels, zijn de meerderheid van de rostraal terugtrekken axonale endbulbs en bolletjes op 3 uur na Lisci sterk gelabeld met Nile Red (minder blauw verschoven) indicatief voor een milieu-verandering binnen de axon (Figuur 5B). Nile rood gemerkte gebieden binnen het actief terugtrekken axonen vooral lijken te omringen of cap de axonale kern. Hoewel de precieze locatie en identity van deze intra-axonale Nile rood gemerkte structuren zijn nog niet bekend, kunnen zij dicht blaasje accumulatie via axonaal transport en / of gesplitst eiwitten bloot hun hydrofobe kern 27 vertegenwoordigen. Nile Red label myeline blijft overwegend geel-oranje in de normaal uitziende myeline. In onderscheid, Nile Red gesondeerd vesiculaire myeline verschijnt geel (dwz blauw verschoven) indicatief voor veranderingen in het milieu binnen deze structuren. Door 7 uur na Lisci axonen blijven terugtrekken uit de buurt van de laesie site; dit is echter duidelijker in rostrale (figuur 5D) versus caudaal (figuur 5C) endbulbs. Andere axonen ondergaan volledige of gedeeltelijke desintegratie verlaten van een lege myeline buis of een dunne steel enkele microns weg van de degenererende segment. Vertraagde toepassing van Nile Red na Lisci onthult vergelijkbaar axonale etikettering als pre-applicatie van Nile Red suggestief dat de ablatie per se en potentiële thermische effecten op eiwitdenaturatie iswaarschijnlijk niet verantwoordelijk voor de Nijl Rode spectrale verschuivingen in myeline en axonen na een blessure (figuur 5E, F). Tezamen zijn deze gegevens illustreren de bruikbaarheid van de ex vivo LISCI model welbekende maar slecht begrepen mechanismen van acuut letsel axomyelinic bootsen in real-time. Het model kan daarom nuttig zijn om onze kennis van de pathofysiologie van stof schade wit te bevorderen, en ontdek de belangrijkste moleculaire doelwitten voor integriteit witte stof te behouden. 
Figuur 1: Overzicht van de dissectie en imaging setup. (A) Een voorgestelde opstelling ex vivo beeldvorming van het ruggenmerg. De grote apparatuur noodzakelijk is voorzien van een carbogeen (95% O2 / 5% CO2) gasleiding aan zuurstof de aCSF, een perfusiepomp de carbogen-bub leverenbloedde aCSF via een in-line heater / temperatuurregelaar apparaat uitgerust met een temperatuur feedback sonde, en een open-bad ontworpen beeldvorming kamer uitgerust met een vacuüm bron. (B) Een hogere vergroting van de beeldvorming bad kamer wordt getoond. (C) Een voorgestelde set-up voor perfusie en dissectie van de ex vivo ruggenmerg. Gekoeld lage Ca 2+ aCSF wordt zuurstofrijk met carbogen en gebruikt om de levensvatbaarheid van het ruggenmerg tijdens dissectie te houden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 2:. Isolatie van het ruggenmerg voor de beeldvorming (A) Onder continu gekoeld, zuurstofrijk lage Ca 2 + perfusie de skullcap wordt blootgesteld. (B) een incisie gemaakt door het dorsale oppervlak van de schedel ter hoogte van de reukkwabben (stippellijn). (C) bilaterale incisies worden vervolgens via de laterale randen van het schedeldak tot deze net kan worden opgetild en trok caudaal (in de richting van de pijl) om de hersenstam bloot. (D) verder bilaterale insnijdingen met fijne getipt schaar om het laterale aspecten van de wervels de dorsale kolommen gesneden en bloot (pijlpunt). (E) De blootgestelde hersenstam en volledige cervicale uitbreiding naar de thoracale deel van ruggenmerg getoond. (F) Twee insnijdingen met een aantal 11-scalpel zijn aan het ruggenmerg isoleren in de hersenstam, voorbij de fasciculus gracilis axonale uiteinden en thoracale niveau ( stippellijnen). (G) De geïsoleerde ruggenmerg wordt vervolgens overgebracht naar een petrischaal die gekoeld laag Ca2 + aCSF geborreldcarbogen gas. Cervicale dorsale wortels (bijvoorbeeld, pijlpunten), ganglion, en het ruggenmerg van de bovenste thoracale segment aan de hersenstam (~ 15-20 mm) zijn intact gelaten. Schaal bar in G:. 2 mm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 3:. Beeldvorming van de ex vivo ruggenmerg (A) Eenmaal in de kamer geplaatst, wordt de ruggenmergweefsel beveiligd met behulp van een gemodificeerde tissue / slice ingedrukt uitgerust met Lycra draden (B) De myeline vlek Nile Red wordt direct toegevoegd aan. de beeldvorming kamer. (C) Een water immersie objectief wordt ondergedompeld in de aCSF en geplaatst over de gracile fasciculus vezels. 
Figuur 4:. Liščí model van centrale gemyeliniseerde axon letsel TPLSM werd gebruikt om de dynamiek van de axon en myeline reacties volgende LISCI (*) vast te leggen. Representatieve beelden worden weergegeven als maximale intensiteit projecties van vijf 1 pm dikke optische secties vastgelegd op 0,24 micrometer / pixel met een Nikon A1RMP + multifoton / confocale microscoop uitgerust met een 25X; NA: 1,1; WD: 2 mm water immersie objectief. Standard koudlichtspiegel en emissie filters werden gebruikt om YFP + axonen (525/50 DM560, weergegeven in blauw) en de solvatochrome lipofiele fluorescerende kleurstof Nijl R scheidened in kortere (600/60 DM640, weergegeven in groen) en langere (685/70 nm, weergegeven in rood) emissie-kanalen. De laatste twee filter combinaties zijn voordelig omdat ze Nile Red's bekend spectrale verschuivingen in de verschillende fysisch-chemische omgevingen vast te leggen. (A) In basislijnomstandigheden axonen (YFP +, blauw) en myeline (NR, geel-oranje) lijken zich normaal met een paar bolletjes of andere tekenen van axomyelinic letsel. Rijen van glia met karakteristieke morfologie van witte stof oligodendrocyten (NR, donkeroranje, bijv pijlpunten) zijn ook zichtbaar (wat gemarkeerd voor de duidelijkheid) en fijne structuren zoals knopen van Ranvier ook opgelost (bv pijlen). (B) 10 min na Lisci, doorsneden axonen gelegen rostrale en caudale aan de laesie beginnen om binnen gezwollen myeline weg van de schade ter plaatse te trekken en te vormen sigmoidaal-achtige spoelen (pijlen). Myeline ensheathing axonen afstand van het ablatie lijken onveranderd op dit tijdstip. (C) By 40 min post-Lisci meest primaire doorsneden axonen en axonen ondergaan secundaire degeneratie vorm karakteristieke endbulbs als ze trekken uit de laesie (pijlpunten). Sommige doorsneden axonen vormen tevens sferoïden langs de lengte van hun axonen (pijlen). Scheiding van myeline van het axon (peri-axonale zwelling) en vesiculaire degeneratie van myeline is ook duidelijk (+). (DG). Na verloop van tijd, primaire en secundaire gewonden axonen verder terugtrekken uit de buurt van de laesie site, en zoals blijkt uit yz projecties van de Lisci, aanvankelijk gespaard axonen aan weerszijden van de ablatie website ondergaan vertraagde secundaire degeneratie (H, linkerpaneel voordat Lisci, middelste paneel 10 minuten na Lisci en rechter paneel 7 uur na Lisci; witte stippen markeren de eerste Lisci, rode stippen geven de verlies van axonen met 10 min en groene stippen geven de mate van vertraagde secundaire degeneratie van axonen met 7 uur). Peri-axonale zwelling wordt prominenter op latere tijdstippen post-Lisci. De mate of axonale terugtrekken en morfologie van axonale endbulbs tussen proximale axon stompen en hun distale segmenten blijkt ook (zie ook figuur 5 voor een hogere vergroting afbeeldingen). Schaalbalk:. 50 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 
Figuur 5:. Vertegenwoordiger van hoge-resolutie afbeeldingen van axomyelinic veranderingen na Lisci TPLSM werd gebruikt om ingewikkelde details van axon en myeline vangen verandert caudaal (A, C) en rostrale (B, D) om verwondingen op 3 uur (A, B) en 7 uur (C, D) na Lisci. Representatieve beelden worden weergegeven als maximale intensiteit projecties van drie 1 pm dikke optische sectiesvastgelegd op 0,0832 micrometer / pixel met een Nikon A1RMP + multifoton / confocale microscoop. (A) caudaal van de Liščí (*), meerdere axonen (blauw) worden verwijderd terugtrekken uit de laesie (grote pijlpunten) binnen gezwollen myeline buizen (geel-oranje ) dat weg hebben afgescheiden van de axonale endbulb. Sommige axonen grenzend aan de ablatie website ondergaan secundaire degeneratie (kleine pijlpunten), terwijl andere onaangetast verschijnen. YFP laag / negatief vermeende blaasjes (lichtblauw) binnen het axon en axonale endbulbs zijn aanwezig (pijlen). Een centrale knooppunt van Ranvier (n) is ook duidelijk zichtbaar met behulp van deze beeldvorming en etikettering techniek. (B) In tegenstelling tot caudaal terugtrekken vezels, zijn de meerderheid van de rostraal terugtrekken axonale endbulbs en bolletjes op 3 uur na Lisci sterk gelabeld met de Nijl rode (roze). Nile rood gemerkte gebieden in het terugtrekken van axonen vooral lijken te omringen of pet YFP gelabelde axonen (blauw, grote pijlpunten). Hoewel de aard van deze Nile Red-labeled structuren is momenteel niet bekend, kunnen zij dicht blaasje accumulatie via axonaal transport en / of gesplitst eiwitten bloot hun hydrofobe kern vertegenwoordigen. In onderscheid, Nile Red label vesiculaire myeline (pijlen) verschijnt geel (dwz spectrum is blauw verschoven) in vergelijking met de normale myeline (geel-oranje), een indicatie van mogelijke veranderingen in het milieu binnen de eerste. Peri-axonale zwelling is ook duidelijk (kleine pijlpunten). Om 7 uur na Lisci, axonen verder weg het terugtrekken uit de laesie site; dit is echter duidelijker in rostraal (D) versus caudaal (C) endbulbs. Sommige axons ondergaan volledige of gedeeltelijke desintegratie laat een lege myeline buis (pijl in C) of een dunne steel enkele microns van het degenererende segment (pijltjes in D) respectievelijk. Vertraagde toepassing van Nile Red produceert gelijkaardige spectrale verschuivingen in caudale versus rostral centrale gemyeliniseerde axonen (E en F
| 2x Stock A (2 mM Ca 2+) | Reagens | mM |
| NaCl | 252 | |
| KCl | 6 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 4 | |
| 2x Stock B | NaH 2 PO 4 | 2.5 |
| MgSO4 | 4 | |
| NaHCO3 | 52 | |
| Dextrose (D-glucose) | 20 | |
| 2x lage Ca 2+ Stock C (0,1 mmol Ca 2+) | NaCl | 252 |
| KCl | 6 | |
| • MgCl 6H 2 O | 3.8 | |
| CaCl2 • 2H 2 O | 0.2 |
Tabel 1: kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) buffers.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen,, R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
