Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder
En este artículo
Resumen
Resumen
Defensa temprana contra los agentes patógenos de la mucosa consiste tanto en una barrera epitelial y células inmunes innatas. La inmunocompetencia de ambos, y su intercomunicación, son de suma importancia para la protección contra las infecciones. Las interacciones de las células inmunes innatas epiteliales y con un patógeno están mejor investigados en vivo, donde el comportamiento complejo se desarrolla en el tiempo y el espacio. Sin embargo, los modelos existentes no permiten una fácil imágenes espacio-temporal de la batalla con los patógenos a nivel de la mucosa.
El modelo desarrollado aquí crea una infección de las mucosas por inyección directa del patógeno fúngico, Candida albicans, en la vejiga natatoria del pez cebra juvenil. La infección resultante permite imágenes de alta resolución de comportamiento de la célula epitelial y inmune innata en todo el desarrollo de la enfermedad de la mucosa. La versatilidad de este método permite la interrogación del huésped a la sonda la secuencia detallada de los eventos inmunológicos que conducen a phreclutamiento agocyte y examinar el papel de los tipos particulares de células y vías moleculares en la protección. Además, el comportamiento del patógeno como una función de ataque inmune se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante el uso de la proteína fluorescente que expresan C. albicans. El aumento de la resolución espacial de la interacción huésped-patógeno también es posible usando la técnica de disección vejiga natatoria rápido descrito.
El modelo de infección de la mucosa se describe aquí es sencillo y altamente reproducible, por lo que es una valiosa herramienta para el estudio de la candidiasis mucosa. Este sistema también puede ser ampliamente traducible a otros patógenos de la mucosa tales como microbios micobacterianas, bacterianas o virales que normalmente infectan a través de las superficies epiteliales.
Introducción
Las infecciones de la mucosa pueden provocar infecciones del torrente sanguíneo potencialmente mortales debido al daño de la barrera epitelial, que permite el acceso de los patógenos al entorno sistémico1,2. Además, las infecciones de la mucosa también pueden causar inmunopatología significativa incluso cuando están contenidas externamente3-5. El hongo unicelular comensal Candida albicans está presente en la mayoría de la población en la cavidad oral y otros sitios mucosos6-9. Aunque normalmente están contenidos por respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, los defectos inmunitarios innatos y las intervenciones médicas pu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH bajo Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) A2012-11-03 protocolo.
1. El pez cebra Cría a 4 días después de la fecundación
- Recoger AB pez cebra, o cualquier otro líneas transgénicas, dentro de la primera después de la fertilización 3 hr, como se muestra en otro vídeo 34.
- Incubar 120 huevos en unos 15 cm placas de Petri que contenían 150 ml de medio E3 (NaCl 5 mM KCl; mM 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES, pH 6,8) con azul de m....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La microinyección en la vejiga natatoria posterior
El método experimental presentado aquí describe la inyección de una dosis constante de C. células de levadura albicans en la vejiga natatoria de 4 dpf pez cebra. El trabajo previo con el modelo de inmersión sugiere que la respuesta inmune a la vejiga natatoria C. albicans es similar a la candidiasis mucosa de mamíferos 32. Aquí se demuestra un método de infección modificado que es más sencillo, reproducible.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Avances y limitaciones del modelo de enfermedad microinyección vejiga natatoria
El modelo que se presenta aquí es una extensión del modelo de inmersión candidiasis mucosa se describe en Gratacap et al (2013).; que añade las ventajas de un tiempo de infección controlada, una dosis infección altamente reproducible, y por lo tanto mejora de la eficiencia. Se demuestra aquí nuevos métodos que permitan la documentación temporal no invasiva de la dinámica de la infección en gran detalle, a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Le Trinh y el Dr. Tobin generosamente para proporcionar la α-catenina: línea de peces citrino y Bill Jackman para permitirnos hacer el rodaje en su laboratorio. Los autores reconocen las fuentes de financiación Institutos Nacionales de la Salud (Becas 5P20RR016463, 8P20GM103423 y R15AI094406) y USDA (Proyecto # ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito se publica como principal Agricultura y Silvicultura Experimento Estación publicación número 3371.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,7 ml | Axygen | MCT-175-C | |
| Placas de Petri profundas | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Pipetas de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Extracto de levadura | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptona | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrosa | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Pinzas finas (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Tacos de madera | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Tirador de micropipetas Flaming | Brown Sutter Instruments | P-97 | |
| Capilar de borosilicato | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| Sistema de inyección MPPI-3 | Instrumentación Científica Aplicada | MPPI-3 | |
| Unidad de contrapresión | Instrumentación Científica | Aplicada BPU | |
| Kit de soporte de micropipetas | Instrumentación científica aplicada | MPIP | |
| Interruptor de pie | Ciencia Aplicada Instrumentación | FSW | |
| Micromanipulador Instrumentación | Científica Aplicada | MM33 | |
| Base magnética | Instrumentación Científica Aplicada | Base | |
| Sulfanato de metano de tricaína | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Microscopio de disección | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Microscopio confocal | Olympus | IX-81 con sistema confocal de escaneo láser FV-1000 Objetivo | |
| microscopio 20X | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Tambor de rodillo | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Puntas | de pipeta de microcargadorEppendorf | 930001007 | |
| Tubos de cultivo de vidrio (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Arcilla para niños (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Azul de metileno | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Placas de Petri | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocitómetro ( Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Aceite de inmersión tipo A | Productos de mármol azul | 51935 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Cable de pesca | Stren | ||
| 96 placa de imagen de pocillos (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| Grasa de alto vacío (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microportaobjetos (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cubreobjetos (18 x 18 mm), n.º 1,5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| Placa de Petri de 15 cm (plásticos Olympus) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glicerol (productos químicos EMD) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| Plato de cultivo de 24 pocillos (plásticos Olympus) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Peso de los botes (8,9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
Referencias
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
