Method Article

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

DOI:

10.3791/52182

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November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Defensa temprana contra los agentes patógenos de la mucosa consiste tanto en una barrera epitelial y células inmunes innatas. La inmunocompetencia de ambos, y su intercomunicación, son de suma importancia para la protección contra las infecciones. Las interacciones de las células inmunes innatas epiteliales y con un patógeno están mejor investigados en vivo, donde el comportamiento complejo se desarrolla en el tiempo y el espacio. Sin embargo, los modelos existentes no permiten una fácil imágenes espacio-temporal de la batalla con los patógenos a nivel de la mucosa.

El modelo desarrollado aquí crea una infección de las mucosas por inyección directa del patógeno fúngico, Candida albicans, en la vejiga natatoria del pez cebra juvenil. La infección resultante permite imágenes de alta resolución de comportamiento de la célula epitelial y inmune innata en todo el desarrollo de la enfermedad de la mucosa. La versatilidad de este método permite la interrogación del huésped a la sonda la secuencia detallada de los eventos inmunológicos que conducen a phreclutamiento agocyte y examinar el papel de los tipos particulares de células y vías moleculares en la protección. Además, el comportamiento del patógeno como una función de ataque inmune se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante el uso de la proteína fluorescente que expresan C. albicans. El aumento de la resolución espacial de la interacción huésped-patógeno también es posible usando la técnica de disección vejiga natatoria rápido descrito.

El modelo de infección de la mucosa se describe aquí es sencillo y altamente reproducible, por lo que es una valiosa herramienta para el estudio de la candidiasis mucosa. Este sistema también puede ser ampliamente traducible a otros patógenos de la mucosa tales como microbios micobacterianas, bacterianas o virales que normalmente infectan a través de las superficies epiteliales.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las infecciones de la mucosa pueden provocar infecciones del torrente sanguíneo potencialmente mortales debido al daño de la barrera epitelial, que permite el acceso de los patógenos al entorno sistémico1,2. Además, las infecciones de la mucosa también pueden causar inmunopatología significativa incluso cuando están contenidas externamente3-5. El hongo unicelular comensal Candida albicans está presente en la mayoría de la población en la cavidad oral y otros sitios mucosos6-9. Aunque normalmente están contenidos por respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, los defectos inmunitarios innatos y las intervenciones médicas pueden provocar candidiasis mucosa grave. El asalto a la barrera epitelial resulta en un mayor riesgo de enfermedad diseminada potencialmente mortal, así como de inmunopatología, ya que en el caso de la candidiasis vulvovaginal, adicionalmente la colonización por C. albicans se ha relacionado con la homeostasis inmune pulmonar10,11. La candidiasis diseminada es ahora la cuarta infección del torrente sanguíneo más común en las unidades de cuidados intensivos12 y la mortalidad de hasta el 40% la convierte en una preocupación importante. Debido al aumento de los tratamientos inmunomoduladores para pacientes con enfermedades autoinmunes, cáncer o trasplantes de órganos, es imperativo comprender la interacción entre este patógeno y el compartimento inmune de la mucosa.

La mayoría de los avances biológicos celulares respecto a las interacciones entre C. albicans y células a nivel de la mucosa provienen de modelos in vitro13-15 y murinos16-18. Ambos enfoques tienen ventajas distintivas, pero la capacidad de obtener imágenes de células vivas a alta resolución en un huésped intacto ha limitado la caracterización temporal y espacial de la infección. Para estos estudios, existe la necesidad de un modelo in vivo en el que se pueda visualizar la interacción de las células patógenas, inmunitarias innatas y epiteliales en un huésped vertebrado intacto.

El pez cebra se ha convertido en una herramienta invaluable para la comprensión de las enfermedades humanas, principalmente debido a su transparencia y susceptibilidad a la manipulación genética. El desarrollo de células y órganos se ha fotografiado con exquisito detalle, lo que ha llevado a la descripción de nuevos comportamientos de las células inmunitarias, como el comportamiento de las células T en el timoen desarrollo 19 o la batalla entre micobacterias intracelulares y fagocitos20-22. Trabajos recientes han descrito las interacciones microbio-huésped intestinal en el pez cebra y han demostrado que la colonización microbiana del tracto intestinal afecta la fisiología intestinal del huésped y la resistencia a otras infecciones23,24. Además, se ha descrito la infección a través del epitelio intestinal para varios patógenos.

En contraste con el tracto intestinal, la vejiga natatoria representa un modelo de mucosa más aislado y complementario. Este órgano es una prolongación del tubo intestinal en desarrollo y se forma anteriormente al hígado y al páncreas25,26. Produce surfactante, moco y péptidos antimicrobianos27,28 y tanto anatómica como ontogenéticamente, este órgano se considera un homólogo del pulmón de los mamíferos29,30. Dado que el conducto neumático permanece conectado al intestino en el pez cebra, esto permite que la infección por inmersión ocurra de forma natural. Sorprendentemente, las únicas infecciones naturales conocidas de los peces con especies de Candida son las infecciones por C. albicans en la vejiga natatoria31. Recientemente describimos un modelo experimental de infección por inmersión en el que C. albicans infecta la vejiga natatoria, y descubrimos que esta infección recapitula algunas de las características de la interacción epitelial con C. albicans in vitro32,33.

En el método presentado aquí, el modelo original de infección por inmersión se mejora inyectando directamente C. albicans en la vejiga natatoria de 4 días después de la fertilización (dpf) pez cebra. Esto permite un control temporal preciso de la infección, así como un inóculo altamente reproducible. Permite obtener imágenes intravitales detalladas, junto con la versatilidad del modelo de pez cebra. Como ejemplo de lo que se puede hacer con este método, presentamos la dinámica espacio-temporal del crecimiento de C. albicans junto con el reclutamiento de neutrófilos al sitio de infección. Debido a que el tejido de la vejiga natatoria del pez cebra es difícil de obtener imágenes intravitales, también presentamos una técnica de disección rápida de la vejiga natatoria que mejora la señal de fluorescencia y la resolución microscópica. Estos métodos amplían la caja de herramientas para la investigación fúngica, inmunológica y acuícola, además de describir una nueva ruta de infección que puede traducirse para modelar otras infecciones fúngicas, bacterianas o virales de las superficies mucosas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH bajo Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) A2012-11-03 protocolo.

1. El pez cebra Cría a 4 días después de la fecundación

  1. Recoger AB pez cebra, o cualquier otro líneas transgénicas, dentro de la primera después de la fertilización 3 hr, como se muestra en otro vídeo 34.
  2. Incubar 120 huevos en unos 15 cm placas de Petri que contenían 150 ml de medio E3 (NaCl 5 mM KCl; mM 0,17; 0,33 mM CaCl 2; 0,33 mM MgCl 2, 2 mM HEPES, pH 6,8) con azul de metileno (0,3 mg / ml final concentración) en una incubadora a 33 ° con 12/12 de luz / oscuridad fotoperíodo.
  3. Reemplace los medios de comunicación después de 6 horas con el E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, / ml concentración final de 10 mg) y retirar los huevos muertos.
  4. Incubar durante 4 días a 33 ° C, el intercambio de los medios de comunicación con frescos E3 + PTU después de 2 días.

2. Enproyección de micro-aguja Preparación

  1. Tire capilar de borosilicato (OD 1,2 mm; ID 0,69 mm) en un micro-aguja usando un extractor de aguja con los siguientes ajustes (550 Heat; 0 Tire; 130 Velocity; 110 Time).
    NOTA: Los ajustes variarán de filamento a filamento para obtener micro-agujas de forma similar (ver Figura 1) y tendrá que ser reajustado cada vez que se instala un nuevo filamento.
  2. Llenar un micro-aguja con 3 l de 0,4 micras filtrada-solución salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; 10 mM Na 2 HPO 4; 1.8 mM KH 2 PO 4; pH 7,4) usando un microloader pipeta 20 l punta.
  3. Configure la micro-aguja en un soporte micropipeta en un micromanipulador conectada a un sistema de inyección a presión. Ajuste la presión de inyección a 30 PSI y la duración del pulso en 30 ms.
  4. El uso de una placa de Petri con agua destilada, baje la micro-aguja hasta 1/5 de la aguja está en el agua. Sujete el wi micro-agujath pinzas finas justo por debajo del nivel del agua. Traiga la micro-aguja fuera del agua y empujar el pedal varias veces hasta que aparezca un bolo.
  5. Medir el diámetro del bolo mediante la reducción de la micro-aguja en un hemocitómetro en capas con una gota de aceite de inmersión tipo A. Ajustar la duración del impulso para obtener el volumen deseado (ver Tabla 1).
  6. Establecer la contrapresión para el bolo se mantenga estable en aceite (bajar la presión si el bolo aumenta el volumen y aumentar la contrapresión si el volumen del bolo disminuye). Registre la duración del pulso para cada micro-aguja.
  7. Retire la PBS de la micro-aguja aspirando usando una punta de pipeta microloader y expulsar el sobrante PBS colocándolo de nuevo en el inyector y presionar el interruptor de pulso continuo. Reserve cada micro-aguja.

3. Candida Preparación

  1. Streak Candida albicans transforman con codones optimizados dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRojo de una madre congelado (-80 ° C de valores en 25% de glicerol) usando una clavija de madera estéril en un peptine dextrosa de levadura (YPD) placa de agar (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 20 g / l de dextrosa , agar / L 20 g; autoclave y se vierte 25 ml en placas de Petri) y se incuba durante la noche a 30 ° C.
  2. Elige una colonia usando una clavija de madera estéril e inocular a 5 ml de líquido YPD (10 g de extracto / L de levadura, 20 g / L de peptona, 20 g / l de dextrosa, autoclave y asépticamente alícuotas en 5 ml en cultivo de vidrio de 16 x 150 mm tubos).
  3. Incubar durante la noche a 30 ° C en un tambor de rodillo a 60 rpm.
  4. Recoge 1 ml de C. cultura albicans y la transferencia en un tubo de centrífuga estéril 1,7 ml.
  5. Centrifugar a 5000 xg durante un par de segundos. Vacíe el sobrenadante y añadir 1 ml de PBS estéril, mezclar bien. Repita esto dos veces.
  6. Contar las colonias utilizando un hemocitómetro diluyendo el 1 ml agotadas 1: 1000 en PBS estéril.

4. La inyección de Pez Cebra enla vejiga natatoria

  1. Calentar un plato de inyección (2% de agarosa) durante 30 min en una incubadora a 33 °.
  2. En el momento deseado, retirar 100 de los 150 ml de E3 + PTU desde el plato de 15 cm de Petri que contiene el pescado para inyectar usando una pipeta de 25 ml sin aspiración de cualquier pez cebra.
  3. Anestesie 4 dpf pez cebra mediante la adición de 2 ml de un / ml tamponada tricaína metano sulfonato de stock 4 mg (TR) a los 50 ml restantes medios (concentración final de 200 mg / ml) y esperar 15 min.
  4. Bajo un microscopio de disección, seleccionar peces con una vejiga natatoria inflada. Los peces también se puede examinar en ese momento para fenotipo homogéneo, tales como la distribución de los neutrófilos en mpo: línea de GFP usando un microscopio de disección de epifluorescencia.
  5. Diluir la C. Stock albicans a partir de su concentración original (paso 3.8) a 1,5 x 10 7 unidades formadoras de colonias por ml (UFC / ml) se forman en PBS.
  6. Transfiera 30 pez cebra en el plato de la inyección con un tubo de transferencia de plásticotte y eliminar el exceso de medios de comunicación.
  7. Con una herramienta de hilos de pesca (línea de pesca de diámetro 0,012 pulgadas súper pegada en un capilar de borosilicato), haga 3 líneas de 10 peces, sosteniendo el plato de inyección vertical y orientar a los peces verticalmente.
  8. Retire el exceso de medios de comunicación.
  9. Agite bien en vórtex el tubo con 1,5 x 10 7 ufc / ml C. albicans.
  10. Llene una micro-aguja con 3 l de C. albicans utilizando una nueva punta de pipeta microloader y ajustar la duración del pulso en el valor adecuado (véase el paso 2.9).
  11. Gire el plato de inyección para formar un ángulo de 20 ° entre la micro-aguja y la cabeza del pez, apuntando hacia la parte posterior de la vejiga natatoria (Figura 3A).
  12. Empuje la micro-aguja en la vejiga natatoria, asegurándose de que el orificio de la aguja está en la luz, y presione el pedal una vez.
  13. Repita el procedimiento para cada pez y transferir a un plato de recuperación (25 ml E3 + PTU) inundando el plato con un E3d vaciarlo en el plato de recuperación.
  14. Transferencia otros 30 peces para el plato de la inyección.
  15. Repetir la inyección con un nuevo micro-aguja llena de fondo vórtex C. albicans.
  16. Finalizar inyectando el control de PBS, si es necesario, utilizando un plato de inyección diferente para evitar la contaminación y la transferencia a un plato de recuperación independiente (paso 4,10).

5. El cribado del Pescado para inóculo deseado

  1. Preparar 40 ml de 0,4% bajo punto de fusión solución de agarosa (LMA) mediante la adición de 160 mg de bajo punto de fusión de agarosa a 40 ml de E3, hervir en el microondas hasta que se disuelva, y enfriamiento a 37 ° C. Añadir 400 l de TR (concentración final de 200 mg / ml) una vez enfriado.
  2. Después de 30 min de recuperación, anestesiar el pescado tal como se describe (paso 4.3 utilizando sólo 1 ml de TR en 25 ml E3 + PTU, concentración final 200 g / ml).
  3. Transferencia de 30 peces (con tan poco como sea posible los medios de comunicación) a 2 ml de LMA en un barco de peso.
  4. Aspirar peces individuales con una pipeta de transferencia y la placa a los peces con 1 gotas de LMA en una placa de imagen de 96 pocillos, utilizando sólo los 10 x 6 pozos centrales.
  5. Repita hasta que todos los peces a la pantalla se cargan a la placa de imagen.
  6. Deje que los medios de comunicación se solidifican a temperatura ambiente durante 5 min.
  7. Coloque el pescado en su lado, asegurándose de que estén en contacto con el fondo de cristal.
  8. Usando el objetivo de 20X en una epifluorescencia / microscopio confocal invertido y el filtro adecuado, registrar el número de C. células de levadura albicans en vejiga natatoria de cada pez.
  9. Seleccione el pescado con 15-25 células de levadura en la vejiga natatoria (o inóculo se desea), la eutanasia de peces no seleccionado (800 g / ml de TR en E3) y volver peces seleccionado a un plato profundo de Petri con 50 ml de E3 + PTU por la adición de 3 gotas de E3 a los pocillos de placas de imágenes seleccionados y aspirar el pescado con una pipeta de transferencia de plástico.
  10. Incubar a 33 ° C durante la duración deseada.

6. Imaging the Fish Post-screening

  1. En el momento deseado, retirar 25 de los 50 ml de medio E3 + PTU de la placa de Petri profunda que contiene el pescado a la imagen.
  2. Anestesiar el pescado tal como se describe (paso 4.3 utilizando sólo 1 ml de TR en 25 ml E3 + PTU restante, concentración final de 200 mg / ml).
  3. Placa de los peces en una placa de imagen de 96 pocillos y la posición apropiada (pasos 5.3 a 5.7).
  4. Imagen de microscopía de barrido confocal utilizando los láseres apropiados y filtros de emisión. En primer lugar se centran en los peces usando el objetivo 4X bajo contraste de interferencia diferencial (DIC) y adquirir imágenes de la región de interés utilizando el objetivo 20X con el láser confocal en el modo de exploración con 2 velocidades microsegundos / pixel y 1024 x 600 píxeles relación de aspecto. Adquirir Z-pilas con 1 m de tamaño de paso, aplicando el modo de filtro Kalman de 3 marcos.
  5. Regreso a un plato hondo de Petri con 50 ml E3 + PTU o en individual pozos (24 pocillos plato cultura, 3 ml E3 + PTU) y se incuba a 33 ° C.

7. Disección de la vejiga natatoria

  1. Llene una jeringa de 10 ml con grasa de alto vacío.
  2. Preparar una LMA 2% (paso 5.3 con 160 mg de bajo punto de fusión de agarosa en 8 ml de E3).
  3. En el momento deseado, anestesiar el pescado (paso 5.2).
  4. Transferencia de 10 peces a un tubo de 1,7 ml de centrífuga con 1 ml de E3 y la eutanasia mediante la adición de 200 l de 4 mg / ml tricaína (concentración final de 800 mg / ml) al tubo de centrífuga e incubando durante 15 min a temperatura ambiente.
  5. Preparar un portaobjetos de vidrio de formación de imágenes mediante la colocación de 4 gotas de grasa de vacío en una plaza, 1 cm de distancia en una MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2).
  6. Coloque 2 gotas de 2% LMA en el centro de la plaza.
  7. Coloque un pescado en un portaobjetos de vidrio separada bajo un microscopio de disección y verifique que el corazón ha dejado de latir, eliminar el exceso de agua.
  8. Con ayuda de pinzas finas diseccionar los vejiga natatoria por mantener la cabeza en una posición fija con las pinzas izquierda y tirando hacia abajo el intestino anterior con las pinzas derecha (Figura 4A).
  9. Recoge la vejiga natatoria por el conducto neumático con las pinzas izquierda, que lo separa del tracto digestivo, y colocarlo en el centro de la LMA 2% antes de que solidifique.
  10. Colocar un cubre (18 x 18 mm) en la parte superior de la lámina de vidrio de imágenes y empujarlo hasta que toque la grasa de vacío, así como la LMA (Figura 2).
  11. Imagen dentro de los 10 min de la disección como se describe en el paso 6.4. Repita el paso 07.07 a 07.11 con los otros peces.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microinyección en la vejiga natatoria posterior

El método experimental presentado aquí describe la inyección de una dosis constante de C. células de levadura albicans en la vejiga natatoria de 4 dpf pez cebra. El trabajo previo con el modelo de inmersión sugiere que la respuesta inmune a la vejiga natatoria C. albicans es similar a la candidiasis mucosa de mamíferos 32. Aquí se demuestra un método de infección modificado que es más sencillo, reproducible...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avances y limitaciones del modelo de enfermedad microinyección vejiga natatoria

El modelo que se presenta aquí es una extensión del modelo de inmersión candidiasis mucosa se ​​describe en Gratacap et al (2013).; que añade las ventajas de un tiempo de infección controlada, una dosis infección altamente reproducible, y por lo tanto mejora de la eficiencia. Se demuestra aquí nuevos métodos que permitan la documentación temporal no invasiva de la dinámica de la infección en gran detalle, a...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al Dr. Le Trinh y el Dr. Tobin generosamente para proporcionar la α-catenina: línea de peces citrino y Bill Jackman para permitirnos hacer el rodaje en su laboratorio. Los autores reconocen las fuentes de financiación Institutos Nacionales de la Salud (Becas 5P20RR016463, 8P20GM103423 y R15AI094406) y USDA (Proyecto # ME0-H-1-00517-13). Este manuscrito se publica como principal Agricultura y Silvicultura Experimento Estación publicación número 3371.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de 1,7 mlAxygenMCT-175-C
Placas de Petri profundasFisher Scientific89107-632
Pipetas de transferenciaFisher Scientific13-711-7M
Extracto de levaduraVWR Scientific90000-726
PeptonaVWR Scientific90000-264
DextrosaFisher ScientificD16-1
AgarVWR Scientific90000-760
Pinzas finas (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Tacos de maderaVWR Scientific10805-018
Agarosa de bajo punto de fusiónVWR Scientific12001-722
Tirador de micropipetas FlamingBrown Sutter InstrumentsP-97
Capilar de borosilicatoSutter InstrumentsBF120-69-10
Sistema de inyección MPPI-3Instrumentación Científica AplicadaMPPI-3
Unidad de contrapresiónInstrumentación CientíficaAplicada BPU
Kit de soporte de micropipetasInstrumentación científica aplicadaMPIP
Interruptor de pieCiencia Aplicada InstrumentaciónFSW
Micromanipulador InstrumentaciónCientífica AplicadaMM33
Base magnéticaInstrumentación Científica AplicadaBase
Sulfanato de metano de tricaínaWestern Chemical Inc.MS-222
Microscopio de disecciónOlympusSZ61 top SZX-ILLB2-100 base
Microscopio confocalOlympusIX-81 con sistema confocal de escaneo láser FV-1000 Objetivo
microscopio 20XOlympusUPlanSApo 20x/0.75
Tambor de rodilloNew Brunswick ScientificTC-7
Puntasde pipeta de microcargadorEppendorf930001007
Tubos de cultivo de vidrio (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Arcilla para niños (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Azul de metilenoVWR ScientificVW6276-0
PTUSigmaP7629-10G
Placas de PetriFisher ScientificFB0875712
Hemocitómetro ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Aceite de inmersión tipo AProductos de mármol azul51935
CentrífugaEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Cable de pescaStren
96 placa de imagen de pocillos (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
Grasa de alto vacío (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Microportaobjetos (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
Cubreobjetos (18 x 18 mm), n.º 1,5VWR Scientific48366-045
Placa de Petri de 15 cm (plásticos Olympus)Genesee Scientific32-106
Glicerol (productos químicos EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
Plato de cultivo de 24 pocillos (plásticos Olympus)Genesee Scientific25-107
Peso de los botes (8,9 cm)VWR Scientific89106-766
Magnética de

References

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