La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real

Summary

Aquí, describimos un método para la cuantificación simultánea de círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión de recombinación de eliminación de K (KRECs). El ensayo TREC/KREC se puede utilizar como marcador de la diuresis tímica y de la médula ósea.

Abstract

círculos de escisión del receptor de células T (TREC) y círculos de escisión de recombinación con eliminación de K (KREC) son elementos de ADN circularizados formados durante el proceso de recombinación que crea receptores de células T y B. Debido a que los TREC y KREC no pueden replicarse, se diluyen después de cada división celular y, por lo tanto, persisten en la célula. Su cantidad en sangre periférica puede considerarse como una estimación de la producción tímica y de médula ósea. Mediante la combinación de un ensayo TREC bien establecido y de uso común con una versión modificada del ensayo KREC, hemos desarrollado una PCR cuantitativa dúplex en tiempo real que permite la cuantificación de linfocitos T y B recién producidos en un solo ensayo. El número de TRECs y KRECs se obtiene utilizando una curva estándar preparada diluyendo en serie las uniones de señal TREC y KREC clonadas en un plásmido bacteriano, junto con un fragmento del gen de la constante alfa del receptor de células T que sirve como gen de referencia. Los resultados se informan como número de TREC y KRECs/10⁶ células o por ml de sangre. Se ha demostrado que la cuantificación de estos fragmentos de ADN es útil para monitorizar la reconstitución inmunitaria tras un trasplante de médula ósea tanto en niños como en adultos, para mejorar la caracterización de las deficiencias inmunitarias o para comprender mejor la actividad de ciertos fármacos inmunomoduladores.

Introduction

Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médu....

Protocol

Declaración de Ética: NOTA: Este protocolo sigue las directrices de nuestra institución, el Spedali Civili di Brescia

1. Elaboración de un "Triple-Insertar" plásmido

1. Selección y preparación de material de partida apropiado:
   1. Obtener una muestra que contiene células muy susceptibles de tener TRECs y KRECs detectable por PCR, tal como sangre periférica de un sujeto sano joven recogido en tubos de EDTA.
      NOTA: En un principio, se había desarrollado el método que utiliza para TRECs timocitos y células mononucleares a partir de fragmentos de amígdalas para KRECs, pero sujetos sanos por lo general tienen una cantidad de T....

Results

El ensayo se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de entre 0 a 17 (hombres / mujeres: 25/17) y 45 adultos de 24 años - 60 (machos / hembras: 29/16). Los resultados fueron obtenidos como TRECs y KRECs por 10 ⁶ PBMC, y luego los TRECs y KRECs por ml de sangre fueron calculados.

El número de TRECs disminuye con la edad debido a la involución tímica, ^4, en particular, de una manera muy aguda de 0 a 3 - 4 años. En los adultos, el número TREC .......

Discussion

La cuantificación de TREC y KREC puede considerarse una buena estimación de la producción tímica y de médula ósea reciente, siempre que se tengan en cuenta algunas advertencias. Aunque un método de cuantificación absoluta que emplea una curva estándar requiere más reactivos y más espacio en la placa de reacción de PCR en tiempo real, garantiza resultados cuantitativos altamente precisos porque las cantidades de muestra desconocidas se interpolan a partir de curvas estándar construidas sobre cantidades conocidas de materi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML método de	separación en gradiente de densidad
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)	QIAGEN	51106	Extracción de ADN
Oligonucleótidos de ADN no modificado HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/µ l
ADN polimerasa AmpliTaq: incluye 10x Buffer II y 25 mM MgCl2	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit para la subclonación de	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue	Stratagene	200130
Sistema de minipreparación de plásmido PureYield	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
Tampón TE (1 mM TRIS y 0,1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master	Mix Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Sondas de doble marcado HPLC 0,01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/µ l
Espectrofotómetro NanoDrop 2000c	Termociclador ThermoFisher
Applied Biosystems 2720	Biosystems aplicados/Life-Technologies	4359659
sistema de PCR en tiempo real Fast 7500	Biosystems Applied Biosystems/Life-Technologies
1.4	Biosistemas Aplicados/Tecnologías de la Vida