Aquí, describimos un método para la cuantificación simultánea de círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión de recombinación de eliminación de K (KRECs). El ensayo TREC/KREC se puede utilizar como marcador de la diuresis tímica y de la médula ósea.
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Artículo de método
La cuantificación simultánea de T-Cell Círculos Receptor Excision (TRECs) y Círculos K-Eliminación recombinación Excision (KRECs) por PCR en tiempo real
En este artículo
Resumen
Resumen
círculos de escisión del receptor de células T (TREC) y círculos de escisión de recombinación con eliminación de K (KREC) son elementos de ADN circularizados formados durante el proceso de recombinación que crea receptores de células T y B. Debido a que los TREC y KREC no pueden replicarse, se diluyen después de cada división celular y, por lo tanto, persisten en la célula. Su cantidad en sangre periférica puede considerarse como una estimación de la producción tímica y de médula ósea. Mediante la combinación de un ensayo TREC bien establecido y de uso común con una versión modificada del ensayo KREC, hemos desarrollado una PCR cuantitativa dúplex en tiempo real que permite la cuantificación de linfocitos T y B recién producidos en un solo ensayo. El número de TRECs y KRECs se obtiene utilizando una curva estándar preparada diluyendo en serie las uniones de señal TREC y KREC clonadas en un plásmido bacteriano, junto con un fragmento del gen de la constante alfa del receptor de células T que sirve como gen de referencia. Los resultados se informan como número de TREC y KRECs/106 células o por ml de sangre. Se ha demostrado que la cuantificación de estos fragmentos de ADN es útil para monitorizar la reconstitución inmunitaria tras un trasplante de médula ósea tanto en niños como en adultos, para mejorar la caracterización de las deficiencias inmunitarias o para comprender mejor la actividad de ciertos fármacos inmunomoduladores.
Introducción
Círculos de escisión del receptor de células T (TRECs) y círculos de escisión recombinación K-borrar (KRECs) son pequeños elementos de ADN circularized que son extirpados en una proporción de las células B, respectivamente, T y durante un proceso de recombinación de ADN genómico, lo que lleva a la formación de un repertorio altamente diversificada de T y receptores de células B. No tienen ninguna función, sino porque son estables y no se pueden replicar, se diluyen después de cada división celular, que persiste por tanto, sólo en una de las dos células hijas. Por lo tanto, sus niveles en la sangre periférica se puede asumir como una estimación de la salida de la médu....
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Protocolo
Declaración de Ética: NOTA: Este protocolo sigue las directrices de nuestra institución, el Spedali Civili di Brescia
1. Elaboración de un "Triple-Insertar" plásmido
- Selección y preparación de material de partida apropiado:
- Obtener una muestra que contiene células muy susceptibles de tener TRECs y KRECs detectable por PCR, tal como sangre periférica de un sujeto sano joven recogido en tubos de EDTA.
NOTA: En un principio, se había desarrollado el método que utiliza para TRECs timocitos y células mononucleares a partir de fragmentos de amígdalas para KRECs, pero sujetos sanos por lo general tienen una cantidad de T....
- Obtener una muestra que contiene células muy susceptibles de tener TRECs y KRECs detectable por PCR, tal como sangre periférica de un sujeto sano joven recogido en tubos de EDTA.
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Resultados
El ensayo se realizó en una muestra representativa de 87 controles sanos: 42 niños de entre 0 a 17 (hombres / mujeres: 25/17) y 45 adultos de 24 años - 60 (machos / hembras: 29/16). Los resultados fueron obtenidos como TRECs y KRECs por 10 6 PBMC, y luego los TRECs y KRECs por ml de sangre fueron calculados.
El número de TRECs disminuye con la edad debido a la involución tímica, 4, en particular, de una manera muy aguda de 0 a 3 - 4 años. En los adultos, el número TREC .......
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Discusión
La cuantificación de TREC y KREC puede considerarse una buena estimación de la producción tímica y de médula ósea reciente, siempre que se tengan en cuenta algunas advertencias. Aunque un método de cuantificación absoluta que emplea una curva estándar requiere más reactivos y más espacio en la placa de reacción de PCR en tiempo real, garantiza resultados cuantitativos altamente precisos porque las cantidades de muestra desconocidas se interpolan a partir de curvas estándar construidas sobre cantidades conocidas de materi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores no tienen agradecimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML método de | separación en gradiente de densidad |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | Extracción de ADN |
| Oligonucleótidos de ADN no modificado HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/µ l | |
| ADN polimerasa AmpliTaq: incluye 10x Buffer II y 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit para la subclonación de | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue | Stratagene | 200130 | |
| Sistema de minipreparación de plásmido PureYield | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| Tampón TE (1 mM TRIS y 0,1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master | Mix Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Sondas de doble marcado HPLC 0,01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspender el producto liofilizado a 100 pmol/µ l | |
| Espectrofotómetro NanoDrop 2000c | Termociclador ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 | Biosystems aplicados/Life-Technologies | 4359659 | |
| sistema de PCR en tiempo real Fast 7500 | Biosystems Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| 1.4 | Biosistemas Aplicados/Tecnologías de la Vida |
Referencias
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....
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Reimpresiones y permisos
