Método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus de la oreja del ratón Interior a través de la ventana de membrana Ronda

Resumen

El abordaje quirúrgico postauricular descrito permite una administración rápida y directa en el lápido timpático coclear del ratón, al tiempo que minimiza la pérdida de sangre y la mortalidad animal. Este método se puede utilizar para la terapia coclear mediante la administración molecular, farmacológica y viral a ratones posnatales a través de la membrana de la ventana redonda.

Resumen

La terapia génica, que se utiliza para lograr la recuperación funcional de la sordera neurosensorial, se compromete a conceder una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y genéticos subyacentes que contribuyen a la pérdida de la audición. Introducción de vectores en el oído interno debe hacerse de una manera que distribuye ampliamente el agente a lo largo de la cóclea al tiempo que minimiza la lesión a las estructuras existentes. Este manuscrito describe un enfoque quirúrgico post-auricular que se puede utilizar para la terapia coclear ratón usando molecular, farmacológica, y la entrega viral a ratones día postnatal 10 y mayores a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). Este abordaje quirúrgico permite una entrega rápida y directa en la rampa timpánica y reducir al mínimo la pérdida de sangre y evitar la mortalidad de los animales. Esta técnica implica un daño insignificante o no a las estructuras esenciales del oído medio e interno, así como los músculos del cuello, mientras su totalidad preservar la audición. Para demostrar la eficacia de esta técnica quirúrgica, el glutam vesicularcomió transportador 3 knockout (KO VGLUT3) los ratones se utilizará como un ejemplo de un modelo de ratón de la sordera congénita que recupera la audición después de la entrega de VGLUT3 al oído interno utilizando un virus adeno-asociado (AAV-1).

Introducción

La terapia génica durante mucho tiempo ha sido sugerido como un posible tratamiento para la pérdida auditiva genética, pero el éxito en esta área ha sido difícil de alcanzar ^1. Hasta la fecha, las metodologías mediadas por virus han predominado por la capacidad teórica para dirigirse a tipos específicos de células dentro de la cóclea relativamente inaccesible. Ambos adenovirus (AV) y el virus adeno-asociado (AAV) se han utilizado para la entrega de genes coclear. AAV son ventajosos en la cóclea por un número de razones. Ellos son virus deficientes en la replicación y pueden transferir de manera eficiente moléculas transgénicos para diferentes tipos de células incluyendo neuronas, un objetivo importante para un número de causas de la pérdida de audición. Entrada AAV en la célula está mediada por receptores específicos ^2; Por lo tanto, la elección de un serotipo particular, debe ser compatible con los tipos de células a ser transducidas. AAV puede transfectar eficazmente células ciliadas ³ e incorporar en el genoma del huésped, lo que resulta en una expresión estable y a largo plazo de la traproteína nsgenic y cambio fenotípico en la celda ^4. Aunque no necesariamente ventajoso para aplicaciones de corto plazo, tales como la regeneración de células de pelo, expresión a largo plazo es muy importante para el rescate estable de defectos genéticos. Debido AAV no están asociados con ninguna enfermedad humana o infección y demuestran no ototoxicidad ^5,6,7, son un candidato ideal para su uso en la terapia génica para formas heredadas de la pérdida de audición ^8.

Transferencia de material genético exógeno en el oído interno de los mamíferos utilizando vectores virales se ha estudiado en la última década y se perfila como una técnica prometedora para el tratamiento de las formas tanto genéticas y adquiridas de la pérdida de ⁹ de la audición. La cóclea es potencialmente una diana ideal para la terapia génica por varias razones: 1) su volumen pequeño requiere una cantidad limitada de que el virus sea necesario; 2) su relativo aislamiento de otros efectos secundarios límites del sistema de órganos; y 3) sus cámaras llenas de líquido facilitan viralentrega en todo el laberinto ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Los modelos de ratón de la sordera congénita permiten el uso de muchos métodos de estudio para monitorear el desarrollo del oído interno de una manera sistemática, replicable. Mientras que el pequeño tamaño de cochleae ratón no presenta cierta dificultad quirúrgica, el ratón sirve como un modelo extremadamente importante en el estudio de la pérdida auditiva genética, con varias ventajas sobre otras especies experimentales ^16. Los modelos de ratón permiten la evaluación de una serie de características a través de análisis de ligamiento genético, colección de observaciones morfológicas detalladas, y la simulación de escenarios patógenos; Como tales, son buenos candidatos para la terapia génica mediada por virus. Extensos estudios genéticos en ratones combinados con los avances tecnológicos han hecho posible la generación de ratones modificados genéticamente de forma reproducible a través de laboratorios de ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermore, existen numerosos modelos para ambos adquiridas y heredadas de la audición fenotipos de pérdida en ratones, lo que permite a rigurosas pruebas en este modelo animal ^{22, 23,24.} Por lo tanto, la corrección de la audición mediante la terapia génica mediada por virus en un modelo de ratón es un primer paso apropiado en la búsqueda de una cura para la enfermedad humana.

Hemos demostrado previamente que los ratones transgénicos que carecen de glutamato vesicular transportador 3 (VGLUT3) nacen sordos debido a la falta de liberación de glutamato en la sinapsis cinta IHC ^25. Debido a que esta mutación no conduce a una degeneración primaria de las células ciliadas sensoriales, estos ratones mutantes son potencialmente un excelente modelo en el que para probar la terapia génica coclear para la pérdida de audición congénita.

Hasta la fecha, un número de técnicas de administración virales para la terapia génica coclear se han descrito, incluyendo la difusión membrana de la ventana redonda, la inyección de membrana de la ventana redonda, y la entrega a través de una cocleostomía. Hay potenteventajas ial y desventajas de cada uno de estos enfoques ^9.

Aquí mostramos un método quirúrgico para la entrega de genes mediada por virus en el oído interno VGLUT3 KO ratón a través de la membrana de la ventana redonda (RWM). El método de inyección de RWM post-auricular es mínimamente invasiva con la preservación audiencia excelente, y es relativamente rápido. Como hemos publicado anteriormente, en un esfuerzo para restaurar la audición en este modelo de ratón, un vector de AAV1 que lleva el gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) se introdujo en la cóclea de estos ratones sordos en el día postnatal 12 (P! @), Resultando en la restauración de la audición ^26. Audición en los ratones KO VGLUT3 se verificó por la respuesta del tronco encefálico (ABR), mientras que la expresión de proteínas transgén se verificó mediante inmunofluorescencia (IF). Por tanto, esta metodología demuestra que la terapia génica mediada por virus-puede corregir un defecto genético que de otro modo resulta en sordera.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos y manejo de los animales cumplido con las pautas de ética NIH y los requisitos del protocolo aprobado del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de California en San Francisco.

1. Preparación del Animal de Cirugía

1. Llevar a cabo procedimientos quirúrgicos en un espacio dedicado limpio. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, esterilizar con un esterilizador de vidrio de grano antes de la cirugía.
   NOTA: En este protocolo, utilice el día postnatal 10-12 (P10-12) ratones FVB. Diferentes edades y razas de ratones se pueden utilizar para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Ratones mayores de P40 puede ser un reto porque el hueso bulla se hace más difícil.
2. Anestesiar a los ratones con inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg / kg), clorhidrato de xilazina (10 mg / kg) y acepromacina (2 mg / kg). Comienza la preparación quirúrgica sólo después de que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie. Si necessary, administrar una dosis de refuerzo (un quinto de la dosis original) del cóctel anestésico para restaurar el plano original de anestésico.
   NOTA: Tenga cuidado en este paso porque la mayor parte de la mortalidad observada en esta edad es causada por sobredosis de anestésico.
3. Cubrir los ojos del animal con una pomada oftálmica de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, la supresión de parpadeo reflejo del animal.
4. Coloque el ratón con cuello extendido sobre una almohadilla caliente durante todo el procedimiento hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia.
5. Afeitarse la región post-auricular izquierda con un clipper y desinfectar con etanol al 70% y la povidona yodada antes de la manipulación quirúrgica.

2. El procedimiento quirúrgico y la inyección del vector

1. Utilice un enfoque post-auricular para exponer la bulla timpánica. Incisión en el tejido subcutáneo con unas tijeras pequeñas para exponer el músculo post-auricular. Después de la retracción del tejido adiposo a Mlado posterior e de la incisión, separar los músculos a la derecha y el lado izquierdo perpendicular a la incisión para exponer el hueso temporal. Asegúrese de que esta incisión es el tiempo suficiente para trabajar cómodamente con una visualización adecuada.
2. Perforar la bulla timpánica con una aguja 25 G y ampliar el agujero como sea necesario con unas pinzas por el pelado de la columna vertebral para permitir el acceso a la espira basal de la cóclea, y luego ampliar suficientemente para visualizar la arteria estapedial y la membrana de la ventana redonda (RWM) .
3. Perforar el RWM suavemente en el centro con una pipeta capilar de borosilicato. Observe flujo de salida de líquido a través de la RWM en este punto; esto es normal. Esperar hasta que el flujo de salida se ha estabilizado (el líquido effluxed de la cóclea se seca con un papel de filtro estéril).
   NOTA: Tenga cuidado al sostener y hacer avanzar la aguja de vidrio para que la perforación RWM es lo más pequeño posible. Dependiendo del microscopio usado, tienen las pipetas usando un micromanipulador o a mano usando una pipetatitular.
4. Preparar las pipetas para inyección con una pipeta extractor se preparan de la misma manera pipetas de patch clamp. Asegúrese de que el diámetro de la punta es grande (unos 15 m de diámetro) para que dispensó el virus de entrada y salida se hace fácilmente.
5. Elaborar 1 a 2 l de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP en una pipeta de inyección. Después se estabiliza el flujo de salida (5 a 10 minutos), microinyectar este volumen fijo en la rampa timpánica por el mismo agujero hecho previamente en RWM.
6. Sellar el nicho RW rápidamente después de sacar la pipeta con un pequeño tapón de músculo y seguro que con una pequeña gota de adhesivo tisular colocado en el músculo para evitar la fuga de la ventana redonda.
   NOTA: Selle este agujero muy bien después se retira la aguja con un pequeño tapón de músculo para evitar cualquier fuga perilinfa de la cóclea, este paso es fundamental para preservar la audición. El fracaso para sellar completamente el VM se traducirá en la pérdida de audición en el tiempo.
7. Después de la inyección, cubra elagujero en la ampolla auditiva con el tejido adiposo, los músculos de regreso post-auricular y el tejido adiposo a su posición normal y la sutura de la herida en capas con una sutura absorbible crómico 6-0 o más pequeño.
8. Desinfectar la herida con povidona yodada.

3. Cuidado posoperatorio

1. Coloca los ratones en una jaula caliente y no los deje sin supervisión hasta que estén completamente recuperados luego pasar de nuevo con la madre. Se recomienda retirar el macho de la jaula antes de poner los cachorros de vuelta con la madre.
2. Administrar subcutánea carprofeno (2 mg / kg) para la analgesia después de la operación y cada 24 h durante 3 días a partir de entonces, para gestionar la inflamación y el dolor. Monitorear los animales diariamente para detectar signos de sufrimiento, pérdida anormal de peso, dolor o infección. Generalmente por el ^3er día después de la cirugía todos los ratones deberían estar actuando normalmente. Si cualquier signo de sufrimiento o la enfermedad aparecen en un ratón después de los ³ días, considere la eutanasia de tél ratón según las directrices institucionales.

4. Evaluación de la función coclear después de un parto Viral Utilizando respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) Grabaciones

NOTA: La respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) es una auditivo potencial extraído de la actividad eléctrica en curso en el cerebro y grabado a través de electrodos colocados bajo el cuero cabelludo evocado. El animal se estimula con el sonido. La grabación resultante consiste en cinco ondas que reflejan la actividad eléctrica de los puntos sucesivos en la vía auditiva en los primeros 10 mseg después de la aparición de un estímulo auditivo.

1. Anestesiar ratones por inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina.
2. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calefacción en toda la prueba de audición hasta que el ratón está totalmente despierto, para prevenir la hipotermia post-anestesia.
   NOTA: El usolos siguientes estímulos sonoros en este experimento: haga clic (5 milisegundos de duración; 31 Hz tasa de presentación).
3. Coloque los electrodos de aguja subdérmicos en el vértice, por debajo del pabellón auricular del oído izquierdo (de referencia), y por debajo de la oreja contralateral (tierra) y empezar ABRs grabación como se describe anteriormente en una cámara insonorizada ^27,28. Grabar formas de onda ABR en 5 intervalos de nivel de presión sonora dB por debajo del máximo de amplitud.
4. Determinar los umbrales ABR postoperatorio tan pronto como 4 días después del parto viral
   NOTA: Umbral se define como el nivel de estímulo más bajo al que de respuestas de los picos para las ondas I-V eran claramente y repetidamente presente en la inspección visual.
5. Mida Wave I para analizar la actividad del nervio coclear. El nivel de estímulo más bajo que produce una forma de onda de ABR detectable se define como el umbral.

5. Coclear Transgén expresión de la proteína mediante inmunofluorescencia

1. Anestesiar ratones por una sobredosis de intrapinyección eritoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina y clorhidrato de xilazina como se describe en la sección 1.2 de este protocolo, sólo que sin la acepromacina.
2. Decapitar la cabeza solamente después que el animal ya no responde a los estímulos dolorosos, como la pizca dedo del pie.
3. Diseccionar las cócleas y proceso para todo el montaje de inmunofluorescencia como se describe ^26. Un protocolo detallado de coclear inmunofluorescencia de montaje en toda utilizando anticuerpos anti-7a anti-miosina VGLUT3 y se describe en Akil et al., 2013 ^29.
4. Para el etiquetado GFP, incubar los cocleares enteros monta la noche a 4 ° C con un anticuerpo de conejo anti-GFP en dilución 1: 250.
5. Enjuague el cochleae dos veces durante 10 min con PBS y luego se incuba durante 2 horas en IgG de cabra anti-conejo conjugado con Cy2 diluido 1: 4000 en PBS.
6. Enjuague el cochleae dos veces con PBS durante 10 minutos y se incuba con DAPI durante 15 min.
7. Monte el cochleae en portaobjetos de vidrio y observar under un microscopio con inmunofluorescencia confocal.

Resultados

Para verificar las características técnicas y utilidad del enfoque post-auricular para la terapia molecular coclear, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP y AAV2-GFP se entregaron en ratones P10-12 oído interno a través de la RWM. Este enfoque demuestra con éxito la expresión del transgén dentro de las células ciliadas internas (IHC) (VGLUT3 Figura 1 y Figura 2 GFP y GFP Figura 3A), las células ciliadas externas (OHC) (GFP Figura 2) y células de soporte (GFP Fi...

Discusión

En este trabajo, se describe en detalle una técnica que se puede utilizar para la terapia génica coclear, con el objetivo de restaurar o rescatar la función auditiva normal que se ve comprometida por un defecto genético. Como es típicamente atraumática, este enfoque es seguro para la transferencia de genes coclear u otras terapias moleculares potenciales ^30. Se han descrito otros enfoques para la terapia coclear, incluyendo un enfoque ventral ^24, cocleostomía ^31,32 y el saco endolinfátic...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamina	Butler Schein
Xilacina	AnaSed
Acepromazine Proporcionado	por UCSF LARC
Analgesia de carprofeno	Proporcionado por UCSF LARC
	Betadine Betadine Puredue Pharma
ungüento oftálmico de dexametasona (TobraDex)	Alcon
Almohadilla térmica	Braintree scientific, inc.
Aguja 25G	BD	305127
Pipeta capilar de borosilicato	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Sutura PDS*plus Antibacteriano	Ethicon	PDP149
Pegamento para tejidos (Vetcode)	Butler Schein	31477
Anticuerpo anti-GFP	de conejo Invitrogen	A11122
Microscopio de disección	Leica		MZ95
Micropipeta Flaming/ Marrón	Extractor Sutter Instrument Co
modelo P-97
Sistema TDT BioSig III	Tecnologías

Tucker-Davis