Floral-Dip transformación de lino ( Linum usitatissimum) Para generar transgénicos progenies con una alta tasa de Transformación

Resumen

A continuación, presentamos un protocolo para transformar el lino utilizando Agrobacterium transformación de plantas mediada a través floral por inmersión. Este protocolo es simple de realizar y de bajo costo, sin embargo, produce una tasa de transformación más alta que los métodos actuales disponibles para la transformación de lino.

Resumen

Transformación de la planta mediada por Agrobacterium a través de floral dip-es una técnica ampliamente utilizada en el campo de la transformación de plantas y se ha informado para tener éxito para muchas especies de plantas. Sin embargo, no se ha informado de lino (Linum usitatissimum) la transformación por inmersión floral. El objetivo de este protocolo es establecer que Agrobacterium y el método de inmersión floral-puede ser utilizado para generar lino transgénico. Se demuestra que esta técnica es simple, barato, eficaz, y más importante, da una tasa de transformación más alta que los métodos actuales disponibles de transformación de lino.

En resumen, las inflorescencias de lino se sumergieron en una solución de Agrobacterium que lleva un plásmido binario vector (fragmento de ADN-T, más la secuencia de inserción Linum, LIS-1) por 1 - 2 min. Las plantas se colocan planos sobre un lado durante 24 horas. Entonces, las plantas se mantuvieron bajo condiciones normales de crecimiento hasta el siguiente tratamiento. Los process de inmersión se repitió 2-3 veces, con aproximadamente 10 a 14 días de intervalo entre la inmersión. Las semillas T1 se recogieron y se germinaron en el suelo. Después de aproximadamente dos semanas, progenie tratadas fueron probados por PCR directa; 2 - 3 hojas por planta se utilizaron además de los cebadores de ADN-T apropiadas. Se seleccionaron transformantes positivos y crecido a la madurez. La tasa de transformación fue inesperadamente alta, con 50 - 60% de las semillas de las plantas tratadas son transformantes positivos. Esta es una tasa de transformación superior a los reportados para Arabidopsis thaliana y otras especies de plantas, utilizando la transformación floral por inmersión. También es la más alta, que se ha informado hasta ahora, para la transformación del lino usando otros métodos para la transformación.

Introducción

Lino (Linum usitatissimum) es un cultivo importante crecido ampliamente por sus fibras y aceites. Transformación del genoma de lino es posible con técnicas tales como heridas, infección por Agrobacterium, y co-cultivo en cultivo de tejidos, aplicando partículas de bombardeo de partículas o sonicación seguido de la regeneración de ultrasonido. Sin embargo, estas técnicas tienen muchas desventajas, incluyendo la proclividad a muchos eventos mutacionales y un tiempo prolongado para obtener las líneas transgénicas. Algunos de estos métodos también pueden ser costosos y requieren la manipulación especializada y eficiente de los instrumentos, resultando en bajas plántulas de recuperación. Lo más importante, estas técnicas a menudo resultan en bajas tasas de transformación ^2,6.

Transformación de la planta mediada por Agrobacterium a través de floral dip-es un enfoque sencillo y eficiente para generar plantas transgénicas. Se ha utilizado de forma rutinaria y con éxito para muchas especies de plantas tales como Arabidopsis Thalianun ^1,4, Medicago truncatula ^{11, 12} de tomate, trigo y maíz ^{13 10.} Sin embargo, no ha sido pensado como una técnica viable para la transformación de lino debido a varios factores, tales como el bajo número de flores producidas por el lino, el número limitado de semillas obtenidas de cada flor, el gran tamaño de la semilla, y la capa gruesa, que también podría ser problemático para tal proceso de transformación genética. Además, el segmento de selección de la técnica de inmersión floral-requiere la germinación de semillas transformadas en un medio de planta que contiene un antibiótico, con progenie transformadas distinguidos en base a su capacidad para germinar y permanecer verde, mientras progenie no transformada o bien no germinan o germinar pero blanqueador rápidamente y morir. En la literatura actual, se ha observado que de tipo salvaje de lino tiende a escapar alta concentración de selecciones de antibióticos, la producción de resultados falsos positivos, y hacer la selección de progenie T1 basadoen resistencia a los antibióticos más difícil ^6,14. También, cuando se añadió una alta concentración de antibiótico en el medio de selección, la tasa de transformación observada disminuyó drásticamente ^9.

En este protocolo, se utilizó Agrobacterium y el método de inmersión floral-para transformar una línea de lino fibra, Stormont cirrus (sensible y plástico), que se ha demostrado que responden a las tensiones en el medio ambiente mediante la alteración de su genoma ^3,5. Para superar el problema de escape de antibióticos, hemos optado por hacer la prueba PCR directa de ADN a partir de hojas T1, en lugar de la selección mediante la adición de los antibióticos a los medios de la planta. Nos aprovechamos de la sencilla anatomía de lino para rastrear flores específicos en el momento del tratamiento. Este sistema de control permite la selección de semillas de flores y la germinación específicos en suelo sin añadir antibiótico. Los transformantes positivos fueron simplemente identificar mediante pruebas de ADN obtenido de las hojas utilizando el método rápido y eficaz of PCR directa. Nuestros resultados demuestran que el método de inmersión floral-funcionó muy bien en esta línea de lino y sorprendentemente resultó en una tasa de transformación muy alta (50 - 60%), superior a los observados anteriormente para Arabidopsis thaliana, que se informó a ser 0.1 - 1 ^1%, y también superior a otras especies de plantas ^10,12. También probamos otra variedad de semilla de lino (lino oleaginoso), Bethune (estable y que no responde), y nuestros datos preliminares indican que floral-dip también trabaja para esta variedad de lino.

El objetivo de este protocolo es mostrar que Agrobacterium y floral por inmersión pueden ser usados ​​para generar lino transgénico. Se demuestra que esta técnica es simple, barato, y más rápido que otros métodos de transformación de lino. Más importante aún, se traduce en una tasa de transformación mucho más alto que los otros métodos de transformación de lino ^2,6. La anatomía de Arabidopsis thaliana, que tiene muchas ramas y las flores, makes difícil distinguir sumerge y las flores no sumerge en la misma planta. Por lo tanto, un gran número de semillas, unas 20.000 semillas por planta, tienen que someterse a las pruebas para identificar transformantes positivos ^8. Lino, por otro lado, tiene menos ramas (una rama principal y algunas ramas laterales) y menos flores, produciendo aproximadamente 100 semillas por las plantas, lo que hace posible el seguimiento de las flores individuales y para seleccionar semillas específicas durante el proceso de selección.

Proponemos que floral por inmersión es un método aplicable para transformar las especies relacionadas de lino, un género de aproximadamente 200 especies. Este método da mucho mayor tasa de transformación que otros métodos de transformación de lino. También proponemos que la selección por PCR directa de ADN de la hoja T1 es una forma eficaz para superar el problema de la resistencia a los antibióticos de escape que a menudo produce muchos falsos positivos. La selección por PCR directa se puede aplicar a cualquier otras especies de plantas y no se limita to lino. La técnica simple seguimiento de la semilla empleada en este protocolo se puede aplicar a cualquier otras especies de plantas con ramificación similar a la anatomía de lino.

Protocolo

1. Crecimiento de los Vegetales

1. 6 semanas antes de la inmersión, llenar macetas de 5 pulgadas con tierra y sembrar las semillas de lino ¼ de pulgada de profundidad en el suelo (4 semillas por maceta). Asegúrese de afirmar el suelo sobre las semillas. Riegue las plantas regularmente y mantenerlos en la luz del día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad).
2. Compruebe plantas regularmente para inflorescencias primarios (grupos de órganos flores '). Las plantas están listas para la transformación cuando los brotes son visibles y sólo se han formado en la inflorescencia (Figura 1 y 2). Para ver los brotes, cortar las hojas alrededor de él, si es necesario.
   NOTA: El uso de la mejor etapa de la flor es crítica y se detalla en la Discusión.
   1. Utilice la rama principal de la planta para el tratamiento experimental, ya que produce más flores que los manojos secundarios. Utilice las ramas laterales, ya sea como controles (que no debe de cruce) u otros tratamientos experimentales.
   2. Como alternativa, utilice los principales y secundarios ramas de lamisma planta para el tratamiento experimental y el uso de otra planta como un control o para otros tratamientos experimentales. Utilice las etiquetas para marcar las distintas ramas y flores individuales con la fecha y el tipo de tratamiento.

2. Clonación y transformación para Escherichia coli (E. coli) Células

1. Clonar el fragmento / gen de interés en el sitio de clonación múltiple de un vector binario de la planta que alberga el ADN-T.
   1. Realice la clonación en un paso o dos pasos.
      1. Directamente clonar insertos pequeños en este protocolo (~ 500 pb) en el vector binario planta. En este protocolo, utilizar el vector binario de la planta (PRI909). De lo contrario, utilice otros vectores binarios de plantas en una estrategia similar.
      2. Alternativamente, clonar grandes insertos (≥6.5 kb) en dos pasos: primero usando un kit de clonación comercial general (no específica de la planta), entonces subclonar en el vector binario de la planta.
2. Configurar una reac PCRción para amplificar el gen de interés. Diseño de los cebadores con sitios de restricción en el extremo 5 '(de acuerdo con el sitio de clonación múltiple del vector binario de la planta en uso).
   1. Realizar una PCR estándar usando ADN genómico de lino con las siguientes condiciones de ciclo: un agarre inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de 98 ° C durante 5 seg, 60 ° C durante 15 seg, y 72 ° C durante 2 min. Realice una etapa de extensión final a 72 ° C durante 5 min seguido de una pausa indefinida a 4 ° C.
   2. Productos de PCR separados en 1% de Tris / borato / EDTA (TBE) en gel de agarosa, corren el gel a 100 V durante 1 hora. Purificar los productos a partir del gel y cuantificar a través de Nanodrop.
3. Configure la mezcla de ligación para clonar el producto de la PCR en el vector de clonación comercial. Siga el protocolo del fabricante.
4. Transformar la mezcla de ligación en E. químicamente competentes células de E. coli como sigue.
   1. Añadir 2 l de la mezcla de ligación en un vial de chE. punto de vista emic competente células de E. coli. Incubar en hielo durante 30 min.
   2. Choque térmico de las células durante 30 segundos a 42 ° C (Heat tiempo de choque y la temperatura depende del tipo de células utilizadas).
   3. Incubar en hielo y añadir 250 l de caldo de RT súper óptima con represión catabólica (SOC) medio.
   4. Tapar el tubo y se incuba en un agitador orbital a 200 rpm a 37 ° C durante una hora.
   5. Spread 10-50 l de cada transformación sobre una placa precalentada LB (precalentado a 37 ° C) + antibiótico selectivo apropiado (determinar el antibiótico selectivo basado en el tipo de vector de clonación comercial utilizado). Incubar las placas a 37 ° CO / N.
5. Escoja ~ 10 colonias para la purificación del plásmido prep mini, utilizando un kit comercial. Purificación Mini plásmido preparación se realiza generalmente de la siguiente manera.
   NOTA: Los nombres de amortiguamiento son específicas del kit comercial utilizado, pero sus funciones generales son similares.
   1. Inocular las colonias individuales en 2- 5 ml de LB medio que contiene el antibiótico selectivo apropiado (determinado en base al tipo de vector comercial utilizado).
   2. Incubar durante aproximadamente 8 horas a 37 ° C con agitación vigorosa (~ 300 rpm).
   3. Recoger las células por centrifugación a 6000 xg durante 10 min.
   4. Resuspender el sedimento en el tampón de resuspensión 250 l. Mezclar y agitar para dispersar completamente el pellet.
   5. Lisar las células bacterianas mediante la adición de 250 l de tampón de lisis, mezclar bien invirtiendo los tubos 4 - 6 veces.
   6. Neutralizar el lisado en el tampón de neutralización e invertir 4 - 6 veces para mezclar. Centrifugar durante 10 min a ~ 17.900 xg en una microcentrífuga de mesa.
   7. La transferencia de los sobrenadantes de la etapa anterior a una columna de centrifugación. Centrifugar de nuevo a ~ 17.900 xg durante 30 - 60 seg.
   8. Lavar la columna de centrifugación añadiendo tampón de lavado 0,75 ml y centrifugar durante 30 - 60 seg. Deseche el flujo directo.
   9. Se centrifuga durante 1 min a remohe tampón de lavado. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. Para eluir el ADN, añadir agua 50 l para el centro de cada columna. Deje reposar durante 1 minuto, y centrifugar durante 1 min.

3. Analizar el Purificada plásmidos para la Presencia de inserción

1. Digestión de restricción
   1. Configurar una digestión de restricción para determinar la presencia del inserto mediante la digestión del plásmido con las enzimas de restricción utilizadas para clonar el inserto. Una restricción doble típico digerir reacción de la siguiente manera: 1 g de plásmido purificado, 1 l de cada enzimas de restricción, 2 l de 10x tampón de digestión de restricción + 2 l BSA (si es aplicable), X l de agua (hasta un total de 20 l)
   2. Mezclar suavemente y se incuba a temperatura recomendada (varía de una enzima a otra).
   3. Analizar la digestión de restricción reacción el 1% TBE gel de agarosa, correr a 100 V durante 1 hora y buscar la deserción de tamaño apropiado.
2. Análisis de PCR:
   1. Configurar una PCR con el plásmido purificado, usando cebadores de la región de vector comercial para amplificar el interior de la inserción o la unión entre el vector y el inserto. Cebadores comunes son M13 adelante y atrás primers y T3 / T7.
   2. En este protocolo, utilice las siguientes condiciones de ciclo de PCR: un mantenimiento inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 94 ° C, seguido de 18 ciclos a 98 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 15 segundos y 72 ° C durante 2 min. Realice una etapa de extensión final a 72 ° C durante 5 min seguido de una pausa indefinida a 4 ° C.
   3. Productos de PCR de carga en una TBE gel de agarosa al 1% y una duración de 100 a 120 V durante 1 hora.
3. Secuenciación:
   1. Enviar el plásmido purificado a una instalación de secuenciación comercial para analizar y confirmar la presencia del inserto.
   2. Una vez obtenida la construcción correcta, lo utilizan para la segunda etapa de la clonación (en la planta de vector binario).
      NOTA: Los pasos 2.3 a 3.3puede ser eliminado si la clonación se completa en un solo paso.

4. Clonación en la Planta vector binario (PRI909) y E. coli Transformación

1. Establecer una restricción doble digerir reacciones para linealizar el vector binario de la planta y aislar el inserto clonado previamente usando los mismos sitios de enzimas de restricción que se añadieron a los cebadores (paso 2.2).
2. Analizar las digestiones de restricción mediante electroforesis en gel, correr a 100 V durante 1 - 2 horas. Cortar la pieza de inserción y la planta de vector binario linealizado a partir del gel.
3. Utilice un kit comercial para purificar los productos de gel. Consulte el manual del fabricante.
4. Configurar una reacción de ligación para ligar el inserto en el vector binario planta. El inserto de vector relación depende del tamaño del inserto y el vector binario de la planta. En este protocolo la inserción LIS1 fue de 6,5 kb y la planta vector binario fue de 9 kb. Por lo tanto, utilice un 1: 2 de inserción a la proporción de vectores.
5. Repita los pasos 2,4 a 3 para la transformación bacteriana, la purificación del plásmido y análisis. Una vez que se obtiene la construcción correcta (insert + planta vector binario), proceder a la electroporación en el paso 5.

5. electroporación en células de Agrobacterium tumefaciens competentes eléctricamente

1. Descongelar un vial de Agrobacterium tumefaciens células eléctricamente competentes en hielo.
2. Añadir 1 ng de ADN de plásmido vector binario para 20 l de células competentes, en hielo, y mezclar suavemente.
3. Enfriar una cubeta de electroporación de 0,1 cm en hielo.
4. Transfiera la mezcla de células / ADN competente para las cubetas de electroporación, y toque para recoger la mezcla en la parte inferior. Poner la cubeta en la máquina electroporador y el pulso (condiciones de tensión y de tiempo dependen del tamaño de la cubeta y electroporador utilizado).
5. Añadir 1 ml de medio SOC y las células de transferencia a un tubo de 15 ml.
6. Incubar durante 1 hora a 28-30° C, agitando a 100 rpm. Placa de 50 - 100 l de células en agar LB + antibiótico selectivo apropiado (depende del plásmido binario de la planta y la cepa de Agrobacterium utilizados en este protocolo de uso 50 mg / ml de kanamicina y 100 mg / ml de estreptomicina.).
7. Las placas se incuban hasta 48 horas a 28-30 ° C.
8. Repita el paso 2.5 para la selección de colonias y purificación de plásmidos.
9. Repita el paso 3 para analizar el plásmido y para comprobar la integridad de la inserción y T-ADN antes de usar el constructo de floral-inmersión. Repita el paso 3.2, el uso de múltiples cebadores de PCR a través de toda la región de inserción y a través de las regiones de T-DNA y por secuenciación como en el paso 3.3.
   NOTA: En este protocolo 4 cebadores diferentes fueron diseñados a través del T-ADN y 10 iniciadores de todo el inserto.
10. Una vez que se confirma la presencia del plásmido binario planta en la colonia Agrobacterium seleccionado, células de lugar in 50% de glicerol y se almacena a -80 ° C. Tienda colonias restantes de la placa a 4 ° C si se van a utilizar dentro de la semana ^7.

6. Floral-inmersión

NOTA: 2 días antes de Floral-inmersión:

1. Crecer células de Agrobacterium a la fase estacionaria (OD ₆₀₀ entre 0,5 a 1 es aceptable) en LB + antibióticos apropiados en medios líquidos.
   Nota: Estos son el mismo antibiótico como en el paso 5.6, basado en el vector binario de la planta y el tipo de cepa de Agrobacterium utilizada.
2. Iniciar el cultivo con 1: 100 diluciones de un (5 ml) O cultivo saturado / N y crecer por 24 - 48 horas a 28-30 ° C con agitación a 150 rpm. La cultura debería haber llegado a la fase midlogarithmic y más probable será que se acerca o en fase estacionaria ^1. DO de aproximadamente 0,8 (nuevo OD entre 0,5 a 1 son todas aceptables) ^8. Recoger las células por centrifugación a 5000 xg a TA.
3. Resuspender las células en medio de infiltración (5,0% de sacarosa + 0,05-0,003% Silwet L-77). Para la primera ronda de la inmersión, utilice 0,05% Silwet-77. Para la segunda y tercera rondas, reducir la concentración de 0,03% (detallado en Discusión).
4. Continúe con el paso floral por inmersión. Coloque la planta en su lado y sumergir sólo las yemas visibles en el medio de infiltración durante 1-2 minutos. Deja la planta en su lado y cúbrala con papel de plástico para mantener la humedad alta en el domo (Figura 3).
5. Al día siguiente, colocar la planta en una posición vertical y mantener normalmente.
6. Cuando el brote se hace más grande (por lo general después de 10 - 14 días), repita los pasos 6.1 a 6.4. Reducir el tiempo de inmersión de 30 - 60 seg y Silwet-77 concentración de 0,003%.
7. Mantener las plantas normalmente hasta que sus semillas son maduros y listos para ser recogido (Figura 4).

7. Selección de Tra Positivonsformants con PCR directa

1. Sembrar las semillas T1 en suelo como en el paso 1.1.
   1. Alternativamente, hacer Murashige y Skoog medio de sal basal (medio MS) mediante la adición de 2,2 g de medio MS + 4 g de agar en 500 ml de agua. Autoclave y verter en pequeñas macetas. Mantener en el 4 ° C hasta su uso.
   2. Siembre la semilla que los coloca en el medio MS solidificado. Mantener bajo la luz del día largo (14 horas de luz y 10 horas de oscuridad). Las semillas germinan en unos 4-6 días (Figura 5).
   3. Utilice una semilla de cada flor como un punto de partida. Si no se obtiene transformante positivo, repita este paso escogiendo otra semilla de la flor.
      Nota: Pruebe diferentes semillas de las mismas flores, porque en algunos casos no se transformarán todas las semillas de una flor. Selección de semillas adicionales de las flores experimentales a veces es necesario.
2. Compruebe en las plántulas con regularidad. En aproximadamente 10 - 14 días después de la germinación, cuando es verdaderodeja desarrollar, probar las plantas con PCR directa.
3. Preparar el extracto de ADN hoja cortando 2 - 3 hojas (5-10 mg en peso) de cada plántula y colocarlos en un tubo de microcentrífuga.
4. Añadir 180 l de NaOH 50 mM a cada tubo, y se incuba durante 10 min a 95 ° C.
5. Neutralizar el extracto mediante la adición de 20 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0).
6. Utilice 1 l de extracto en la reacción de PCR directa, usando cebadores diseñados a través de la ADN-T o de la pieza de inserción (Figura 7), para seleccionar los transformantes positivos.
   1. En este protocolo, utilizar PCR directo con un mantenimiento inicial de 24 ° C, a continuación, 2 min a 98 ° C, seguido por 40 ciclos de (98 ° C durante 10 s, etapa de recocido durante 15 segundos, y una etapa de extensión a 68 ° C). Realizar una etapa de extensión final a 68 ° C durante 5 min seguido de una espera indefinida a 4 ° C. (Consulte la Tabla 1 para más detalles sobre imprimaciones, recocido temperaturas y tiempos de extensión de los ciclos).
7. Identificar transformantes positivos y crecer hasta su vencimiento. Si las semillas se germinaron en medio MS, trasplante al suelo en una maceta más grande (Figura 5).

Resultados

Figura 1 - 4 ilustran algunos de los pasos en el protocolo. En las figuras 1 y 2, las hojas alrededor de los brotes de inflorescencia se cortan para exponerlos a las células de Agrobacterium y las distintas fases del brote que se utilizaron para desarrollar el protocolo. La figura 3 muestra el proceso de lino floral por inmersión. Figura 4, muestra un ejemplo de cómo los principales y secundarios ramas pueden ser etiquetados y cómo las flores individuales pueden ser rastreados e identificados. Figura 5 muestra cómo las progenies T1 pueden ser germinadas en los medios de comunicación de plantas MS y luego trasplantados a suelo para la madurez. La figura 6 ilustra cómo silvestre Tipo de lino puede escapar altas concentraciones de kanamicina, lo que confirma los resultados anteriores en la literatura ^6,9,14.

La Figura 7 muestra un ejemplo de la amplificación por PCR directa a partir de transformantes positivos T1. Las flores T1 se obtuvieron de la main y brotes laterales de una sola planta T0. Como puede verse a partir de la PCR directa, 8/12 plantas T1 resultados positivos a la PCR y se han amplificado las diferentes regiones de todo el ADN-T. Nuestros cebadores se diseñaron también entre los LIS-1 de inserción y los múltiples sitios de clonación (Figura 7B y C). Se utilizó cebadores adicionales a partir del vector binario de la planta para amplificar diferentes segmentos del ADN-T, tales como el borde izquierdo y el terminador NOS (datos no mostrados) o el borde derecho y el sitio de clonación múltiple (Figura 7D). Cebadores específicos para el inserto de LIS-1 también se utilizaron en este protocolo (datos no mostrados). Una lista de los cebadores se proporciona en la Tabla 1. Sin embargo, las secuencias de estos cebadores depende de la secuencia del vector binario planta de T-ADN y el inserto utilizado para la floral-dip. También señaló que no hubo diferencia significativa en la tasa de transformación entre las flores recogidas de los principales y secundarios ramas.

Figura 1. Cortar las hojas alrededor de los brotes de inflorescencia primaria exponerlos a las células tumefaciens. (A) Los brotes están cubiertos por las hojas. (B) Las hojas se han reducido alrededor de las yemas para exponerlos. (C) Imagen ampliada de la planta en (A) después del corte para exponer gustativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Las diferentes etapas del brote que se utilizaron en este protocolo para determinar la mejor etapa de utilizar para el baño floral. (A) La yema etapa temprana es approxima damente 2 mm. (B) La yema etapa media es de aproximadamente 5 mm. (C) La yema etapa tardía es aproximadamente de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. El proceso de lino floral-inmersión. (A) Las inflorescencias primarias se sumergen en los medios de infiltración que contienen las células de Agrobacterium. (B) ampliada a partir de (A). (C) Las plantas sumergidas se establecen plana hasta el día siguiente, y las ramas de cruce están cubiertos con plástico para mantener alta humedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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. Figura 4. El proceso de seguimiento de la flor y la semilla colecciones, de las plantas T0 tratados (A) Un ejemplo de toda la planta con la rama principal (la rama más alta del centro) y el lado ramas (B - D). Se . ejemplo de las flores de las diferentes ramas (E) Un ejemplo de las semillas recolectadas de las flores individuales (con la etiqueta a - k). de la rama principal Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Las plántulas T1 que se cultivan sin selección de antibióticos. (A) semillas T1 songerminado en los medios de comunicación de la planta MS. (B) Los transformantes positivos, según lo determinado por PCR directa, se trasplantan a tierra y se cultivan hasta la madurez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. escapar de antibióticos, un problema para la selección T1, es superada por la selección por PCR directa. (A) semillas de lino de tipo salvaje germinadas en medios MS planta sin antibiótico. (B) las semillas de lino de tipo salvaje germinaron en un medio de plantas MS + concentraciones crecientes de kanamicina (200 mg / ml, 600 g / ml, 1 mg / ml). (C) las semillas de lino de tipo salvaje germinadas en medio MS planta con 2 mg / ml de kanamicina. (D) PCR de tipo salvaje lino y T1 de plántulas usando cebadores kanamicina, todo amplified los genes kanamicina (leyendas: EZ1: marcadores de ADN, FlaxS, flaxS de tipo salvaje, C: controlar rama no cruce, Ma: T1 progenie de flor "a" obtenida de la rama principal, Sc, Sd, Se, Sf: progenie T1 de diferentes flores "c, d, e, f" recogidos de la rama lateral, W:. no-DNA) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Un ejemplo de amplificaciones de PCR con éxito de progenie T1 utilizando el método de PCR directa. (A) Diagrama del vector binario Planta + clonado LIS-1 de inserción. Las flechas azules indican la posición de los cebadores de PCR utilizados en la selección por PCR directa (modificado de Takara). (B) PCR con cebadores M13F + 3 '(C) PCR con cebadores M13R + 18a Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Adelante primer fuente de secuencia	secuencia 5'-3 '	Reverse fuente de secuencia de cebador	Secuencia 5'-3 '	Temprature de recocido (° C)	Tiempo de Extensión (Sec)	El tamaño esperado (bp)
M13F (T-DNA)	CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG	3 '(LIS-1 inserto)	GAGGATGGAA GATGAAGAAGG	57	40	450
18a (LIS-1 inserto)	TATTTTAACCC	M13R (T-DNA)	ATTAGGCACC CCAGGCTTTA	57	40	520
MCS (T-ADN)	TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG	RB (T-DNA)	TTTAAACTGA AGGCGGGAAA	60	20	200
LB (T-DNA)	TTTGATGGTG GTTCCGAAAT	NOS (T-DNA)	GAATCCTGTT GCCGGTCTT	60	30	380
NPTII (T-DNA)	GCGATACCGT AAAGCACGAG	NtpII que confiere (T-ADN)	GCTCGACGTT GTCACTGAAG	65	45	502

Tabla 1. Algunos de los cebadores utilizados para la prueba PCR directa.

Discusión

En algunas especies de plantas, tales como el lino (Linum usitatissimum), la transformación de plantas éxito ha sido limitado. Anteriormente, la transformación del lino ha requerido una infección por Agrobacterium hiriendo y co-cultivo, la aplicación de partículas biolísticos o utilizando ultrasonidos ultrasonidos, seguido de la regeneración; un proceso que es largo y propenso a ser acompañado de muchos eventos mutacionales. Por otra parte, el proceso de selección de estas técnicas requiere el uso de marcadores de selección de antibióticos, tales como kanamicina. Sin embargo, se ha observado en la literatura que este método de selección produce muchos falsos positivos, como lino tiende a escapar de altas concentraciones de antibióticos ^6,9,14. Otra desventaja de las técnicas anteriores en la transformación del lino ha sido las bajas tasas de transformación de ^2,6.

En el protocolo descrito aquí, la transformación de plantas mediada por Agrobacterium a través floral-inmersión se demostrópara dar lugar a una alta tasa de transformación para el lino (50 - 60%). Los transformantes se obtuvieron a partir de las flores de cruce y el cobro de principal y lateral ramas. La selección de transformantes positivos se hace simplemente mediante el cultivo de plantas T1 en suelo y cribado sus hojas poco después de que germinaron, sin pasar por el uso de la selección de antibióticos, un paso utilizado anteriormente como una norma en floral-DIP para otras especies de plantas. Mediante la realización de pruebas de PCR directa de las hojas, y utilizando los cebadores de ADN-T apropiadas, los transformantes positivos se pueden seleccionar rápidamente. Esta técnica es simple, barato y fácil de realizar, sin embargo, resulta en una tasa de transformación mucho más altos que los reportados previamente para Arabidopsis y otras especies de plantas utilizando este método ^1,10,12. También es la más alta tasa de transformación descrito de lino.

Sin embargo, hay pasos críticos en los procedimientos, incluyendo la selección de la mejor fase de la flor y la mejor concentración de tensioactivo, de modo queel Agrobacterium puede penetrar en las células vegetales sin matar a los órganos de la flor. Si una etapa temprana del brote se utiliza (Figura 2A) con alta concentración Silwet-77 de más de 0,05%, la flor no se desarrollará ni establecer semillas. Si la etapa de brotación tardía se utiliza (Figura 2C), aunque la transformación podría funcionar, que se producirá a un ritmo mucho menor. Se obtuvieron resultados similares con la transformación de Arabidopsis floral dip ^1,4. Para este protocolo, todas las etapas florales fueron probados con diferentes concentraciones Silwet-77 y la mejor etapa se determinó que era la etapa de brote media (Figura 2C) con Silwet-77 al 0,05% para la primera inmersión, seguido de una segunda inmersión en la etapa de brotación tardía (Figura 2C) con una concentración Silwet-77 ligeramente reducida de 0,03%. La transformación también funcionó bien utilizando la etapa de brotación temprana (Figura 2) la mínima Silwet-77 concentración de 0,003%, seguido deuna segunda inmersión con fase de capullo medio (Figura 2B) en mayor Silwet-77 concentración de 0,05%.

En este protocolo, algunos otros parámetros se intentaron para optimizar la tasa de transformación, pero se encontró que no tienen efectos sobre el resultado final. Los ejemplos incluyen la ampliación del tiempo después de la inmersión que las plantas ponen de su lado y cubiertas de plástico de un día a dos días; usando una DO de más de 1 para el cultivo de Agrobacterium, en lugar de 0,5 - 1; aumentando el tiempo de inmersión a 5 - 15 min en lugar de 1 - 2 min. Una vez más, no hemos notado ningún efecto sobre la tasa de transformación utilizando estas estrategias. Los factores más eficaces, sin embargo, se encontraron a utilizar plantas sanas en las etapas de flores correctas, y el uso de la mejor concentración Silwet-77. Nos dimos cuenta de que dos intervalos de inmersión, obras de alguna manera mejor de una vez, a pesar de que una inmersión tiempo también trabaja.

Modificación a este protocolo se puede lograr mediante Reducing la concentración Silwet-77 a tan poco como 0,003% en el segundo o tercero de inmersión. Desde Silwet-77 es tóxico, demasiado altas se produce una concentración en las flores desarrollando mal, lo que no hay producción de semilla. La frecuencia de inmersión puede reducirse a una, con la segunda o tercera eventos eliminados si las plantas no están buscando saludable y las yemas no se están desarrollando bien.

Una limitación importante de esta técnica es el bajo número de flores producidas por el lino, el número limitado de semillas obtenidas de cada flor, y el ciclo de vida largo de lino. Se tarda 6-8 semanas a partir de la siembra de semillas de tener las papilas primarias listos para la primera inmersión y un adicional de 8 a 10 semanas después de la inmersión para llegar a la generación T1. En total, una gama de 5 - Se necesita 6 meses para obtener la generación T1. A diferencia de otras especies de plantas, que florecen en cualquier momento del año, un poco de flor variedades de lino mejor en momentos específicos del año. Planificación de forma reflexiva para esta técnica es importante.

En resumen, nuestros resultados de inmersión floral con dos variedades de lino diferentes: el lino de fibra, Stormont Cirrus (plástico sensible y) y el aceite de linaza, Bethune (estable y que no responde), muestran que Agrobacterium - transformación de la planta mediada a través de floral dip-es un método aplicable y eficaz para la transformación de lino y se puede utilizar para reemplazar las técnicas utilizadas previamente para la transformación de lino. Las modificaciones del método floral por inmersión en este protocolo serán aplicables para su uso con cualquier otra especie vegetal y no se limita al lino.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Semillas de lino de la variedad original Stormont Cirrus (PL)
Macetas de 5"
			macetas
Invernadero con ajuste
Termociclador
de electroféresis en gel de agarosaConfiguración
Silwet-77	LEHLE SEEDS	VIS-01	Tóxico, use guantes
GoTaq Green Master Mix	Promega	Parte # 9PIM712
Terra PCR Mezcla directa de polimerasa	Clontech	639270
Vector binario PRI 909	Takara	3260
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E	Takara	9115
Kit de clonación TOPO TA	Invitrogen	K4595-01
Sacarosa	Fisher Scientific
Electroporador y cubetas	Bio-Rad	165-2092
Shaker
Spinner
Envoltura de plástico y envoltura
speedSTAR ADN polimerasa	Takara	RR070A/B
QlAquick kit de extracción de gel	Qiagen	28704
QIAGEN mini kit de plásmidos	Qiagen	12123
Enzima SalI-HF	NEB	R3138S
Enzima SacI-HF	NEB	R3156S
T4 kit de ligadura de ADN	NEB	M0202
Murashige Skoog	Sigma	M5524
Agar	Fisher Scientific	A360-500

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