La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Resumen

La tinción de Schiff con ácido peryódico es una técnica que visualiza el contenido de polisacáridos de los tejidos. Este artículo demuestra el protocolo de tinción de Schiff de ácido peryódico adaptado para su uso en células mononucleares de sangre periférica purificadas a partir de sangre venosa humana. Dichas muestras están enriquecidas con linfocitos y otros glóbulos blancos del sistema inmunitario.

Resumen

La tinción de Schiff con ácido peryódico (PAS) es una técnica inmunohistoquímica utilizada en biopsias musculares y como herramienta de diagnóstico para muestras de sangre. Los polisacáridos como el glucógeno, las glicoproteínas y los glicolípidos tiñen de color magenta brillante, lo que facilita la enumeración de las células positivas y negativas dentro del tejido. En las células musculares, la tinción con PAS se utiliza para determinar el contenido de glucógeno en diferentes tipos de células musculares, mientras que en las muestras de células sanguíneas, la tinción con PAS se ha explorado como herramienta de diagnóstico para una variedad de afecciones. La sangre contiene una proporción de glóbulos blancos que pertenecen al sistema inmunitario. La noción de que las células del sistema inmunitario poseen glucógeno y lo utilizan como fuente de energía no ha sido ampliamente explorada. Aquí, describimos una versión adaptada del protocolo de tinción PAS que se puede aplicar en células inmunitarias mononucleares de sangre periférica de sangre venosa humana. Se observaron células pequeñas con gránulos positivos para PAS y células más grandes con tinción difusa de PAS. El tratamiento de las muestras con amilasa anula estos patrones, confirmando la especificidad de la tinción. Una técnica alternativa basada en la digestión enzimática confirmó la presencia y cantidad de glucógeno en las muestras. Este protocolo es útil para hematólogos o inmunólogos que estudian el contenido de polisacáridos en los linfocitos derivados de la sangre.

Introducción

Ácido periódico de Schiff (PAS) tinción es una técnica inmunohistoquímica que se utiliza ampliamente en la investigación y diagnóstico muscular. También se utiliza como una herramienta de diagnóstico en muestras de sangre. La técnica funciona mediante la aplicación de una solución de ácido periódico a la muestra, que se oxida unidades dentro de los polisacáridos crear grupos aldehído que reaccionan con el reactivo de Schiff la incoloro produciendo de este modo un producto magenta profundo. Los pasos de este procedimiento se muestran en la Figura 1. La mancha resulta nada con polisacáridos magenta, incluyendo glucógeno, glicoproteínas, glicolípidos, mucinas, u otras moléculas con restos de polisacáridos.

Tinción PAS se utiliza a menudo para medir los niveles de glucógeno en las fibras musculares. Secciones de tejido músculos son ideales para la técnica, ya que se adhieren firmemente a la diapositiva y soportan múltiples etapas de lavado y tinción. El glucógeno es más presente en las fibras musculares de contracción rápida de tipo II, que tienen una gran demandapara la producción de ATP rápido que requiere de glucógeno para el máximo rendimiento de ^1,2. El glucógeno es un polímero ramificado de glucosa que se puede dividir en glucosa libre a través de la acción de las enzimas de la glucógeno fosforilasa. En tiempos de descanso y nutricional-suficiencia, el glucógeno se repone a través del proceso de glucogénesis, mientras que en los momentos de alta energía o la insuficiencia de la demanda nutricional; se descompone el glucógeno en glucosa por la glucogenólisis. Ya desde la década de 1950 los científicos clínicos han explorado tinción PAS en muestras de sangre para analizar el contenido de glucógeno en diversas enfermedades ^7.3. Por ejemplo, en la enfermedad de Pompe, un almacenamiento de glucógeno de buena fe células blancas de la sangre disease- se acumulan grandes cantidades de glucógeno que difiere significativamente de los controles sanos ^8.

Este artículo de vídeo demuestra una versión adaptada de la tinción de PAS para su uso en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre venosa de los sujetos humanos sanos. PBMCs contienen en su mayoría linfocitos de los linfocitos T y las familias de linfocitos B, así como otras células inmunes, tales como células asesinas naturales y monocitos. La primera etapa de purificación elimina los eritrocitos, neutrófilos, granulocitos y otros. Esta técnica proporciona datos sobre una proporción concentrada de linfocitos que permiten para la enumeración más robusta de células PAS positivos en comparación con el uso de enteros frotis de sangre.

Figura 1:. Paso a paso metodología de la tinción PAS en PBMC (A) En primer lugar, el aislamiento de PBMC se logra mediante gradiente de Ficoll, el panel izquierdo muestra la preparación antes de la centrifugación, el panel derecho muestra que después de la centrifugación, donde la capa leucocitaria que contiene la PBMC se observa en el centro del tubo. (B) PBMCs aisladas se fijan sobre el portaobjetos utilizando Solu la adherencia de formalina-etanolción. El portaobjetos se enjuaga suavemente con agua destilada de una botella de lavado de plástico. (C) El portaobjetos se coloca entonces en un vaso de precipitados de 100 ml a mitad de camino lleno de solución amilasa, que se disolverá glucógeno. El portaobjetos se enjuaga suavemente. (D) El portaobjetos se trató con solución de ácido periódico, donde la oxidación de los sacáridos se lleva a cabo. Los portaobjetos se aclararon de forma abundante; se eliminará el exceso de ácido periódico y detener la etapa de oxidación. (E) Cuando se añade el reactivo de Schiff a las diapositivas, es el que reacciona con aldehídos creados durante la etapa de oxidación. Este reactivo incoloro entonces resultar en un producto rojo magenta profundo. Las diapositivas se enjuagan suavemente para eliminar el exceso de reactivo de Schiff.

Protocolo

La investigación con muestras de sangre humana fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 10000618. El trabajo en músculo de ratón fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 2010BERG.

1. Aislamiento de PBMC de sangre entera

NOTA: Esta operación se realizará en un gabinete de bioseguridad mediante una técnica estéril y equipo fabricante esterilizado.

1. Vierta cuidadosamente 10-15 ml de sangre entera de los tubos (anti-coagulante) de recogida de sangre heparinizados en un tubo cónico estéril de 50 ml. Para derrames sanguíneos menores, limpie con _ddH2O y el 70% EtOH utilizando tejido de limpieza.
2. Diluir la sangre en el tubo cónico a una proporción de 1: 1 con tampón fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Asegúrese de que el volumen total máximo no exceda de 30 ml.
3. Mezclar suavemente con una pistola de pipeta serológica evitar burbujas.
   NOTA: No mezclar invirtiendo el tubo para evitar la sangre de unccumulation en la tapa y la posterior filtración durante la centrifugación.
4. Añadir 13 ml de Ficoll-Paque (ver Materiales y tabla de Equipo), a un nuevo tubo cónico de 50 ml de capacidad. Mantenga el tubo en posición vertical en el bastidor.
5. Con una pipeta de transferencia, tomar sangre diluida, toque la punta de pipeta de transferencia a la pared interior del tubo cerca de la cima. Con la presión lenta y constante, transferir la sangre a lo largo de la pared interior del tubo que forma una capa de sangre en la parte superior de la capa de sacarosa. Realice este paso varias veces hasta que toda la sangre se ha transferido.
6. Tapar el tubo herméticamente y se centrifuga el tubo a temperatura ambiente durante 30 min a 700 xg en un rotor de oscilación con el conjunto de aceleración medio a 5, y la deceleración ajustado a cero.
7. Poco a poco sacar el tubo y sin molestar a las capas, llevarlo de vuelta a la cabina de bioseguridad.
8. Recoger cuidadosamente la capa leucocitaria (fina capa de color blanco turbio), donde se encuentran las PBMC, colocado entre la PBS / plasma unnd capas Ficoll utilizando una pipeta de transferencia. Evitar recolectar capa sacarosa y no molestar a la capa de glóbulos rojos.
9. Transferir la capa leucocitaria en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. Pueden pasar varias veces de repetición del paso 1.8 para recopilar toda la PBMC.
10. Añadir PBS pH 7,4 al tubo con la PBMC y rellenar hasta la marca de 45 ml. Agitar el tubo a fondo. No lo hagas vórtice.
11. Lavar 1: Centrifugar durante 15 min a 480 xg tanto con la máxima aceleración y deceleración configurado a 9. observar la formación de un pellet de PBMC en la parte inferior del tubo cónico.
12. Desechar el PBS (sobrenadante) en un vaso de precipitados de plástico con 10 ml de lejía.
13. Afloje sedimento celular suavemente "trasiego" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). No lo hagas vórtice.
14. Añadir 25 ml de PBS pH 7,4 fresco al tubo. Si se está procesando más de un tubo, agrupar los gránulos juntos en este paso.
15. Lave 2: Centrifugar el tubo durante 12 minutos a 480 xg with tanto la máxima aceleración y desaceleración ajustado a 9.
16. Deseche la PBS (sobrenadante) en el vaso de plástico con un poco de lejía.
17. Suavemente "estante" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). No lo hagas vórtice.
18. Añadir 25 ml de PBS fresco al tubo.
    1. Sacar 50 l de las células y transferir a un tubo de microcentrífuga para el recuento de viabilidad.
    2. Añadir una cantidad igual (50 l) de azul de tripano (una mancha de viabilidad) y pipeta de arriba y abajo para mezclar suavemente.
19. Saque 10 l y transferirlo a un hemocitómetro para comprobar la viabilidad de las células por ml. Anote el número de células / ml.
20. Saque la cantidad deseada de células y centrifugar el tubo durante 12 minutos a 480 xg tanto con la máxima aceleración y desaceleración ajustado a 9.
21. Deseche la PBS (sobrenadante) en el vaso con lejía.
22. Suavemente "estante" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). Añadir 80 l de PBS en el tubo.

2. Hacer el Slide PBMC

1. Ponga 80 l de las células en un portaobjetos de microscopio. Manchar la gota con la ayuda de otra diapositiva o colocar 2 gotas de 40 l cada uno en ambos extremos de la corredera.
2. Deja diapositiva en la cabina de seguridad biológica para secar. Etiqueta de la diapositiva con un lápiz en el lado esmerilado.

3. La fijación de las muestras en las diapositivas

1. Preparar la solución de fijación mediante la mezcla de 0,5 ml de formaldehído al 37% de etanol 4.5 ml de 99%.
2. Después los portaobjetos se secan, se llevará a cabo 2 ml de la solución de fijación recién hecho y se vierte en la diapositiva de manera que toda la superficie de la corredera está cubierto.
3. Dejar la solución en el portaobjetos durante 1 min. Enjuague el portaobjetos durante 1 minuto con agua del grifo y dejar que se seque al aire.

4. Hacer la Solución amilasa para el Control Negativo

1. Tome 0,25 g de polvo de amilasa y se disuelven en 50 ml de diagua calmado. Vierta la solución en un vaso de 100 ml limpio.
2. Sumergir el portaobjetos en el vaso de precipitados de modo que la mitad de la corredera recibe el tratamiento y la otra mitad permanece sin tratamiento y luego se incuba durante 15 min a temperatura ambiente (Figura 1C).
3. Tome nota de qué lado de la diapositiva está recibiendo el tratamiento amilasa. Dibujar una línea en la parte posterior de la corredera que indica la frontera entre el tratamiento y control.
4. Se lavan los portas con _ddH2O para eliminar la solución de amilasa y dejar el portaobjetos se seque al aire.

5. Realice ácido periódico de Schiff (PAS) de tinción e Imagen

NOTA: Reactivos de PAS son tóxicos por inhalación y son corrosivos, por lo que los pasos deben realizarse en una campana de humos químicos, y los productos de desecho deben eliminarse de acuerdo con las directrices institucionales.

1. Colocar la placa en una superficie plana y vierta 1,50 a 2,00 ml de solución de ácido periódico sobre la muestra. Incubate durante 5 min a temperatura ambiente.
2. Enjuague los portaobjetos en varios cargos de agua destilada.
3. Verter 1,50-2,00 ml de reactivo de Schiff en la diapositiva y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
4. Lavar el portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y dejar que se seque al aire.
5. Aplicar medio de montaje 10 l en el portaobjetos y cubrir con dos pequeñas cubreobjetos, o aplicar 50 l y utilizar una gran cubreobjetos.
6. Aplicar esmalte de uñas transparente en los bordes del cubreobjetos, dejar secar durante la noche.

6. Obtener imágenes con la Luz Microscopio Binocular Utilizando el objetivo 100X

Resultados

Para validar los reactivos y la técnica básica, la tinción de PAS se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en secciones de músculo sóleo ratón. La tinción se realizó mismo día que el sacrificio y en el último paso de la tinción, las secciones se fijaron por xileno. El músculo sóleo se sabe que contiene ~ 35% de glucógeno-células positivas ^9. Las células musculares teñidas muestran dos gránulos puntiformes Características- PAS positivos distintas dentro de la célula, y una línea continua dema...

Discusión

Los pasos críticos de este artículo de vídeo fueron durante el lavado y la amilasa tratamiento de las células. Mientras se lava las diapositivas, el paso clave estaba utilizando una botella de lavado squeezable plástico y dejar que el agua corra suavemente a través de la muestra en la diapositiva y no apuntar directamente contra las muestras. Incluso la más mínima presión de agua directa sería hacer que las células para salir de la diapositiva. Otro paso clave fue utilizar la misma diapositiva durante ± condiciones de a...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de Ácido Periódico de Schiff	Sigma-Aldrich	395B	Llevar a temperatura ambiente antes de usar. Los materiales de este kit son tóxicos y dañinos. Tenga precaución.
α-Amilasa de páncreas porcino	Sigma-Aldrich	A3176
Microscopio Binocular	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Kit para el ensayo de glucógeno	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Polímero sintético no iónico de sacarosa.
Centrífuga			Para el aislamiento de PBMC, se utilizaron cubetas oscilantes.