La tinción de Schiff con ácido peryódico es una técnica que visualiza el contenido de polisacáridos de los tejidos. Este artículo demuestra el protocolo de tinción de Schiff de ácido peryódico adaptado para su uso en células mononucleares de sangre periférica purificadas a partir de sangre venosa humana. Dichas muestras están enriquecidas con linfocitos y otros glóbulos blancos del sistema inmunitario.
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Artículo de método
La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción
En este artículo
Resumen
Resumen
La tinción de Schiff con ácido peryódico (PAS) es una técnica inmunohistoquímica utilizada en biopsias musculares y como herramienta de diagnóstico para muestras de sangre. Los polisacáridos como el glucógeno, las glicoproteínas y los glicolípidos tiñen de color magenta brillante, lo que facilita la enumeración de las células positivas y negativas dentro del tejido. En las células musculares, la tinción con PAS se utiliza para determinar el contenido de glucógeno en diferentes tipos de células musculares, mientras que en las muestras de células sanguíneas, la tinción con PAS se ha explorado como herramienta de diagnóstico para una variedad de afecciones. La sangre contiene una proporción de glóbulos blancos que pertenecen al sistema inmunitario. La noción de que las células del sistema inmunitario poseen glucógeno y lo utilizan como fuente de energía no ha sido ampliamente explorada. Aquí, describimos una versión adaptada del protocolo de tinción PAS que se puede aplicar en células inmunitarias mononucleares de sangre periférica de sangre venosa humana. Se observaron células pequeñas con gránulos positivos para PAS y células más grandes con tinción difusa de PAS. El tratamiento de las muestras con amilasa anula estos patrones, confirmando la especificidad de la tinción. Una técnica alternativa basada en la digestión enzimática confirmó la presencia y cantidad de glucógeno en las muestras. Este protocolo es útil para hematólogos o inmunólogos que estudian el contenido de polisacáridos en los linfocitos derivados de la sangre.
Introducción
Ácido periódico de Schiff (PAS) tinción es una técnica inmunohistoquímica que se utiliza ampliamente en la investigación y diagnóstico muscular. También se utiliza como una herramienta de diagnóstico en muestras de sangre. La técnica funciona mediante la aplicación de una solución de ácido periódico a la muestra, que se oxida unidades dentro de los polisacáridos crear grupos aldehído que reaccionan con el reactivo de Schiff la incoloro produciendo de este modo un producto magenta profundo. Los pasos de este procedimiento se muestran en la Figura 1. La mancha resulta nada con polisacáridos magenta, incluyendo glucógeno, glicoproteínas, glicolípidos, m....
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Protocolo
La investigación con muestras de sangre humana fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 10000618. El trabajo en músculo de ratón fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 2010BERG.
1. Aislamiento de PBMC de sangre entera
NOTA: Esta operación se realizará en un gabinete de bioseguridad mediante una técnica estéril y equipo fabricante esterilizado.
- Vierta cuidadosamente 10-15 ml de sangre entera de los tubos (anti-coagulante) de recogida de sangre heparinizados en un tubo cónico estéril de 50 ml. Para derrames sanguíneos me....
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Resultados
Para validar los reactivos y la técnica básica, la tinción de PAS se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en secciones de músculo sóleo ratón. La tinción se realizó mismo día que el sacrificio y en el último paso de la tinción, las secciones se fijaron por xileno. El músculo sóleo se sabe que contiene ~ 35% de glucógeno-células positivas 9. Las células musculares teñidas muestran dos gránulos puntiformes Características- PAS positivos distintas dentro de la célula, y una línea continua dema.......
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Discusión
Los pasos críticos de este artículo de vídeo fueron durante el lavado y la amilasa tratamiento de las células. Mientras se lava las diapositivas, el paso clave estaba utilizando una botella de lavado squeezable plástico y dejar que el agua corra suavemente a través de la muestra en la diapositiva y no apuntar directamente contra las muestras. Incluso la más mínima presión de agua directa sería hacer que las células para salir de la diapositiva. Otro paso clave fue utilizar la misma diapositiva durante ± condiciones de a.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por una subvención del programa NSERC Discovery número de subvención RGPIN 418522-2013. Agradecemos a R. Kilgour por sus útiles discusiones, y a Katelin Gresty y al Dr. A. Berghdal por proporcionar las secciones de músculos de ratón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Kit de Ácido Periódico de Schiff |  Sigma-Aldrich | 395B | Llevar a temperatura ambiente antes de usar. Los materiales de este kit son tóxicos y dañinos. Tenga precaución. |
| α-Amilasa de páncreas porcino | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| Microscopio Binocular | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Kit para el ensayo de glucógeno | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Polímero sintético no iónico de sacarosa. |
| Centrífuga | Para el aislamiento de PBMC, se utilizaron cubetas oscilantes. |
Referencias
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea p....
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Reimpresiones y permisos
