Artículo de método

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

DOI:

10.3791/52214

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8 de marzo de 2015

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1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

En este artículo

Resumen

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Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Resumen

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No se ha descubierto una cura para la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de pérdida de visión en personas mayores de 55 años. La DMAE es una enfermedad multifactorial compleja de etiología desconocida, aunque se cree que se produce en gran medida debido a la muerte o disfunción del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células que subyace a la retina y proporciona un apoyo fundamental a los fotorreceptores. Las estrategias de reemplazo de células EPR pueden ser muy prometedoras para proporcionar alivio terapéutico a un gran subconjunto de pacientes con DMAE, y las células EPR que se parecen mucho a las células humanas primarias (eRPE) se han generado en varios laboratorios independientes, incluido el nuestro. Además, los usos de iPS-RPE no se limitan a las terapias basadas en células, sino que también se han utilizado para modelar enfermedades de RPE. Este tipo de estudios no solo pueden dilucidar las bases moleculares de las enfermedades, sino que también pueden servir como herramientas invaluables para desarrollar y probar nuevos medicamentos. Presentamos aquí un protocolo optimizado para la diferenciación dirigida de EPR a partir de células madre. La adición de nicotinamida y activina A o IDE-1, una pequeña molécula que imita sus efectos, en puntos de tiempo específicos, mejora en gran medida el rendimiento de las células EPR. Con esta técnica podemos derivar un gran número de EPR de paso bajo en tan solo tres meses.

Introducción

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Los diversos tipos de células que ocupan la retina están organizados en una arquitectura funcional. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se encargan de convertir la luz en impulsos eléctricos a través de la fototransducción. Sin embargo, la fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de otros tipos de células vecinas, incluidas las células de la glía de Mueller y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Una monocapa de células EPR separa la retina sensorial de la coriocapilar, el principal suministro de sangre para los fotorreceptores, y están idealmente situadas para controlar múltiples funciones importantes para la homeostasi....

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Protocolo

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1. diferenciación dirigida de Stem Cell-RPE derivados

NOTA: Todos los pasos de la incubación se realizó a 37 ° C en el 5% de CO 2

  1. Mantener el SUH o ​​caderas líneas (alimentar diariamente) en medio de mantenimiento (MM, Tabla 1). Una vez que las líneas han llegado a las normas suficientes de control de calidad, mantenerlos en una capa de células alimentadoras de ratón embrionario (MEFs) sembradas a una densidad de 250.000 / pocillo de una placa de seis pocillos. Culturas-Xeno libre también pueden ser generados siguiendo el protocolo establecido por Tucker et al.

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Resultados

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Los pasos descritos en este manuscrito, como se representa en la Figura 1, pueden ser utilizados para generar fácilmente RPE partir de células madre como se informó anteriormente 10,12. Después de mantener las líneas iPS para varias semanas, las colonias pigmentadas comienzan a aparecer en las colonias después de 5-7 semanas (7 semanas viejas culturas se muestran en la Figura 2A-C). Estas colonias pueden continuar creciendo durante semanas mientras se mantienen las culturas. .......

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Discusión

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En este manuscrito resumimos los pasos para generar eficientemente un gran número de culturas iPS-EPR puros. Hemos demostrado anteriormente utilizando este protocolo diferenciación dirigida con activina A que podemos generar iPS-EPR que se asemejan fuertemente hRPE basado en la transcriptómica, proteómica, metabolómica y funcionalidad, y que retardar la degeneración de la retina cuando se implanta en ratas RCS 12,31,32 . El proceso de generación de iPS-RPE es mucho tiempo, pero no laboriosa (Figura 1).......

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Divulgaciones

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Ninguno de los autores tiene divulgaciones comerciales que declarar.

Agradecimientos

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Deseamos agradecer a las siguientes personas: Dres. Tim Krohne y Eyal Banin (junto con la Dra. Mandy Lehmann y David Friedlander) por su generosa ayuda en el desarrollo de los protocolos de diferenciación. La Dra. Felicitas Bucher brindó asistencia para diferenciar las células EPR utilizadas en este estudio. También agradecemos al Instituto Nacional del Ojo (subvenciones del NEI EY11254 y EY021416), al Instituto de Medicina Regenerativa de California (subvención CIRM TR1-01219) y al Instituto de Investigación Médica Lowy (LMRI) por su generosa financiación para este proyecto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cuchillo de córnea Cuchillo SurgiproSPOI-070x
1 DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032500 ml x 4 
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X sin Ca o mgVWR45000-434500 ml x 6
Suero fetal bovino, regular (inactivado por calor)VWR45000-736500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Proteína humana recombinanteLife TechnologiesPHG0021100 y micro; g x 1
IDE-1Vástago04-00262 mg x 1
Knockout DMEMLife Technologies10829-018500 ml x 1 
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM Life Technologies25030-081100 ml x 1
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X Life Technologies11140-050100 ml x 1
NicotinamidaSigma-AldrichN0636-100G100 g x 1
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)Life Technologies15140-14820 ml x 1
Activina Recombinante Humana/Murina/Rata A PeproTech120-14E10 y micro; g x 2
Synthemax-T Superficie 6 Placas de PocillosCorning3877Caja(12) x 1
Enzima TrypLE-Express (1X), sin rojo fenol Life Technologies12604-021500 ml x 1 
Filtro de vacío/sistema de botella de almacenamiento, 0.1µ m poro, 500ml Estuchede 431475Corning(12) x 1 

Referencias

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  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
  3. Friedman, D. S.

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Etiquetas

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