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Artículo de método

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

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DOI:

10.3791/52214

⸱

8 de marzo de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

En este artículo

Resumen

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Resumen

No se ha descubierto una cura para la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de pérdida de visión en personas mayores de 55 años. La DMAE es una enfermedad multifactorial compleja de etiología desconocida, aunque se cree que se produce en gran medida debido a la muerte o disfunción del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células que subyace a la retina y proporciona un apoyo fundamental a los fotorreceptores. Las estrategias de reemplazo de células EPR pueden ser muy prometedoras para proporcionar alivio terapéutico a un gran subconjunto de pacientes con DMAE, y las células EPR que se parecen mucho a las células humanas primarias (eRPE) se han generado en varios laboratorios independientes, incluido el nuestro. Además, los usos de iPS-RPE no se limitan a las terapias basadas en células, sino que también se han utilizado para modelar enfermedades de RPE. Este tipo de estudios no solo pueden dilucidar las bases moleculares de las enfermedades, sino que también pueden servir como herramientas invaluables para desarrollar y probar nuevos medicamentos. Presentamos aquí un protocolo optimizado para la diferenciación dirigida de EPR a partir de células madre. La adición de nicotinamida y activina A o IDE-1, una pequeña molécula que imita sus efectos, en puntos de tiempo específicos, mejora en gran medida el rendimiento de las células EPR. Con esta técnica podemos derivar un gran número de EPR de paso bajo en tan solo tres meses.

Introducción

Los diversos tipos de células que ocupan la retina están organizados en una arquitectura funcional. Los fotorreceptores en la parte posterior de la retina se encargan de convertir la luz en impulsos eléctricos a través de la fototransducción. Sin embargo, la fototransducción no puede ocurrir sin los esfuerzos coordinados de otros tipos de células vecinas, incluidas las células de la glía de Mueller y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Una monocapa de células EPR separa la retina sensorial de la coriocapilar, el principal suministro de sangre para los fotorreceptores, y están idealmente situadas para controlar múltiples funciones importantes para la homeostasis de los fotorreceptores. De hecho, el EPR y los fotorreceptores son tan codependientes que se considera ampliamente como una sola unidad funcional. (Para una revisión de todas las diversas funciones del EPR, véase Strauss, 2005:1). La muerte o disfunción de las células del epitelio pigmentario de la retina puede inducir degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de pérdida permanente de la visión en los países industrializados2-4.

AMD es una enfermedad multifactorial del EPR, los fotorreceptores y la vasculatura coroidea; los factores de riesgo son diversos e incluyen combinaciones de influencias ambientales y genéticas5,6. Los tratamientos para la DMAE son muy limitados, pero una terapia potencial prometedora es el reemplazo de células EPR7,8. Si bien los resultados han sido mixtos, el trasplante de células EPR en pacientes con DMAE (y en otros pacientes con degeneración de la retina) y también en modelos de degeneración de la retina en roedores, tiene el potencial de prevenir transitoriamente la atrofia significativa de los fotorreceptores9-23. (El modelo animal comúnmente utilizado para estos estudios son ratas del Royal College of Surgeons (RCS), que albergan una mutación en el gen MerTK. Esta mutación hace que las células EPR sean incapaces de fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores y promueve ladegeneración de la retina. Si bien las tasas de supervivencia reportadas del EPR implantado en el espacio subretiniano de ratas y ratones RCS varían enormemente, existe la posibilidad de que sobrevivan durante varios meses o años9,10,12,20.

Las células RPE pueden obtenerse en cantidades suficientes para el trasplante derivarlas de células madre pluripotentes9-14,25-28. Varios grupos independientes han demostrado que estas células funcionan de manera similar a sus contrapartes somáticas, y los estudios a largo plazo sugieren que son seguras tras su implantación en modelos de enfermedad de ratas y ratones9,10,12,14,19,20,25,29-32. El uso de células madre pluripotentes inducidas en lugar de células madre embrionarias puede ser ventajoso, ya que se pueden obviar las cuestiones éticas y los desafíos inmunológicos asociados con el EPR alogénico33,34. Otra aplicación interesante de la tecnología iPS es el modelado de enfermedades35. La capacidad de interrogar a un gran número de células EPR derivadas de pacientes con enfermedades EPR podría ser invaluable para comprender sus bases moleculares. Este tipo de estudio se ha realizado recientemente con el paciente con la enfermedad Best RPE y podría allanar el camino para estudios similares de maculopatías hereditarias36.

La derivación de EPR a partir de células madre es un proceso relativamente simple y se puede realizar completamente en condiciones libres de xeno. La estrategia más simple es derivar monocapas de células EPR de forma espontánea, sin embargo, el rendimiento se puede mejorar significativamente utilizando técnicas de diferenciación dirigida. Pero estas técnicas implican el uso de factores proteicos exógenos que pueden ser costosos y a menudo generados en bacterias u otras fuentes no humanas10,12,37. En nuestros estudios seguimos un protocolo establecido10 que utiliza nicotinamida y Activina A, un factor de señalización que ha demostrado ser suficiente para la especificación del EPR38. Aquí demostraremos que la pequeña molécula IDE-1 puede reemplazar adecuadamente a la Activina A, reduciendo así los costos y aliviando las preocupaciones asociadas con el uso de proteínas recombinantes39. Además, utilizamos el reemplazo de suero libre de xeno y cultivamos las células RPE diferenciadoras en un sustrato sintético libre de xeno. Se ha demostrado previamente que las células EPR se diferencian de manera muy efectiva utilizando este enfoque40.

Cuando se diferencian como una monocapa, visualizamos colonias pigmentadas que contienen células EPR después de tan solo cinco semanas12. Una vez que alcanzan el tamaño suficiente, se pueden extirpar manualmente y transferir a otro plato para su expansión. Las células EPR son conocidas por desdiferenciarse con cada pasaje, y se debe evitar el uso de cualquier cosa que tenga más de cinco pasajes (encontramos que se puede generar fácilmente un número suficiente de células para la caracterización y el trasplante en modelos animales después de dos o tres pasajes). Una vez completamente diferenciadas, empleamos múltiples técnicas para caracterizar las células anatómica y funcionalmente para asegurarnos de que servirán como reemplazos adecuados para el EPR enfermo. La descripción de estas técnicas y el protocolo para implantar el iPS-RPE en el espacio subretiniano de roedores, están fuera del alcance de este trabajo de métodos y han sido publicados previamente12,32,41.

Si bien el desarrollo de protocolos estandarizados para la derivación efectiva de iPS-RPE es claramente importante para las clínicas, también queda mucho trabajo preclínico por hacer en modelos animales. Existen preocupaciones con respecto a la inmunogenicidad de las células derivadas de iPS, y se están explorando múltiples técnicas de implantación diferentes, incluida la implantación de células en sustratos artificiales42,43. Por estas razones, creemos que la publicación de protocolos estandarizados es beneficiosa para facilitar los estudios tanto clínicos como preclínicos. Especialmente si se van a hacer comparaciones directas de células iPS-RPE derivadas en diferentes laboratorios por diferentes grupos de investigación.

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Protocolo

1. diferenciación dirigida de Stem Cell-RPE derivados

NOTA: Todos los pasos de la incubación se realizó a 37 ° C en el 5% de CO 2

  1. Mantener el SUH o ​​caderas líneas (alimentar diariamente) en medio de mantenimiento (MM, Tabla 1). Una vez que las líneas han llegado a las normas suficientes de control de calidad, mantenerlos en una capa de células alimentadoras de ratón embrionario (MEFs) sembradas a una densidad de 250.000 / pocillo de una placa de seis pocillos. Culturas-Xeno libre también pueden ser generados siguiendo el protocolo establecido por Tucker et al. 40.
  2. Permita que las colonias de células madre para llegar a la confluencia.
  3. Cambie a medio de diferenciación con nicotinamida (DM / NIC, Tabla 1); alimentar a diario.
  4. Después de tres semanas en cultivo, cambiar a medio de diferenciación con nicotinamida y, o bien activina-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1, Tabla 1) para mejorar la diferenciación RPE.
  5. Después de cinco semanas en cultivo, volver a DM / NIC. Alimentación diaria ya no son necesarios una vez que los indicadores de pH en la parada de los medios de comunicación se tornan amarillas el día después de la alimentación.
  6. Espere a islotes de células pigmentadas en aparecer que son lo suficientemente grandes como para ser corta y se retira (Ver Figuras 2D-F y 3A).

2. Aislamiento pigmentadas Islotes

  1. Cubra los pocillos de una placa de 24 pocillos con una matriz que imita el entorno natural de la célula (es preferible-xeno gratis).
    NOTA: cuchillas de córnea y afilados, pinzas de punta fina son muy útiles para el picking. Toda la hoja de células diferenciadas puede separar al recoger. Evitar esto trabajando cuidadosamente y recogiendo inicialmente colonias en el centro del plato.
  2. Rellene tantos pocillos de la placa de 24 pocillos con medio de diferenciación (DM; Tabla 1), según sea necesario. Esta decisión dependerá de la cantidad de colonias pigmentadasrecogido.
  3. En una campana de cultivo de células con un microscopio de disección, corte manualmente islotes pigmentadas. Picar cada islote en la parte inferior de la placa original utilizando un bisturí en unos 2-6 piezas y agarrar las partes pigmentadas con pinzas cortantes.
  4. Transferencia 1-2 piezas pigmentadas en cada uno de 24 pocillos.
  5. No cambie los medios de comunicación durante 3-5 días hasta que las células se adhieran, a continuación, empezar a cambiar los medios de comunicación, tres veces por semana. (Si no se adhieren después de este tiempo, la probabilidad es bueno que ellos nunca lo hará).
  6. Expandir las células durante 3-4 semanas en medio de diferenciación (DM; Tabla 1) - Una imagen de un cultivo típico se muestra en la Figura 3B. Las células todavía no pueden llenar todo el bien pero espera más largo no parece ayudar. Alimentar a las células tres veces por semana.
  7. Después de 3 semanas, retire manualmente grupos de células blancas en grupos si es necesario con pinzas cortantes. No hacer este paso a menos que sea necesario - es fácil de introducir contaminantes. Es ideal paratratar de obtener poblaciones puras de RPE de las colonias pigmentadas originales en el paso 1.6.

3. pases de células madre derivadas de RPE

  1. Separar las células con 200 l con una solución de disociación celular (preferiblemente no tripsina-un reactivo que puede ser inactivado mediante dilución es preferible) durante 5-8 min a 37 ° C, e inactivar por dilución con DM. Usar una pipeta de 200 l para lavar todas las células y resuspender ellos (Si el pozo seleccionado contiene sólo unas pocas células, considere la agrupación de las células a partir de dos 24-pozos).
  2. Se centrifuga (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 3 ml de medio DM.
  3. Células Re-placa de uno (o dos) 24-pozos en una sola matriz recubierta de 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 5 de expansión).
  4. Expandir durante 1-2 semanas hasta que las células son ~ 90% de confluencia; una imagen de cultivo puro totalmente diferenciada se muestra en la Figura 3C.
  5. Separe las células con 1 ml de células dissociation solución durante aproximadamente 5-8 min a 37 ° C, inactivar por dilución con DM, utilice 1.000 l pipeta para lavar todas las células, y resuspender ellos.
  6. Centrifugar (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 18 ml de medio DM.
  7. Re células de placa de un 6 pocillos cada uno en seis matriz recubierta 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 6 de expansión) o uno-recubierto 75cm 2 matraz (1: 7,5 de expansión).
  8. Repita los pasos 3.4 a 3.8, según sea necesario hasta que se obtengan suficientes células.
    NOTA: Trata de recoger la mayor cantidad de colonias como sea posible para la expansión en lugar de planificar para amplificar las culturas a través de pases ya que cada paso induce RPE desdiferenciación.

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Resultados

Los pasos descritos en este manuscrito, como se representa en la Figura 1, pueden ser utilizados para generar fácilmente RPE partir de células madre como se informó anteriormente 10,12. Después de mantener las líneas iPS para varias semanas, las colonias pigmentadas comienzan a aparecer en las colonias después de 5-7 semanas (7 semanas viejas culturas se muestran en la Figura 2A-C). Estas colonias pueden continuar creciendo durante semanas mientras se mantienen las culturas. ...

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Discusión

En este manuscrito resumimos los pasos para generar eficientemente un gran número de culturas iPS-EPR puros. Hemos demostrado anteriormente utilizando este protocolo diferenciación dirigida con activina A que podemos generar iPS-EPR que se asemejan fuertemente hRPE basado en la transcriptómica, proteómica, metabolómica y funcionalidad, y que retardar la degeneración de la retina cuando se implanta en ratas RCS 12,31,32 . El proceso de generación de iPS-RPE es mucho tiempo, pero no laboriosa (Figura 1)...

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Divulgaciones

Ninguno de los autores tiene divulgaciones comerciales que declarar.

Agradecimientos

Deseamos agradecer a las siguientes personas: Dres. Tim Krohne y Eyal Banin (junto con la Dra. Mandy Lehmann y David Friedlander) por su generosa ayuda en el desarrollo de los protocolos de diferenciación. La Dra. Felicitas Bucher brindó asistencia para diferenciar las células EPR utilizadas en este estudio. También agradecemos al Instituto Nacional del Ojo (subvenciones del NEI EY11254 y EY021416), al Instituto de Medicina Regenerativa de California (subvención CIRM TR1-01219) y al Instituto de Investigación Médica Lowy (LMRI) por su generosa financiación para este proyecto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cuchillo de córnea Cuchillo SurgiproSPOI-070x
1 DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032500 ml x 4 
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, 1X sin Ca o mgVWR45000-434500 ml x 6
Suero fetal bovino, regular (inactivado por calor)VWR45000-736500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Proteína humana recombinanteLife TechnologiesPHG0021100 y micro; g x 1
IDE-1Vástago04-00262 mg x 1
Knockout DMEMLife Technologies10829-018500 ml x 1 
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028500 ml x 1
L-Glutamina 200 mM Life Technologies25030-081100 ml x 1
MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales 100X Life Technologies11140-050100 ml x 1
NicotinamidaSigma-AldrichN0636-100G100 g x 1
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/ml)Life Technologies15140-14820 ml x 1
Activina Recombinante Humana/Murina/Rata A PeproTech120-14E10 y micro; g x 2
Synthemax-T Superficie 6 Placas de PocillosCorning3877Caja(12) x 1
Enzima TrypLE-Express (1X), sin rojo fenol Life Technologies12604-021500 ml x 1 
Filtro de vacío/sistema de botella de almacenamiento, 0.1µ m poro, 500ml Estuchede 431475Corning(12) x 1 

Referencias

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