Aislamiento de Miofibroblastos de Mouse y Esófago Humano

Resumen

Presentamos un protocolo para generar cultivos primarios de células estromales murinas y humanas con un fenotipo de miofibroblastos. Las células cultivadas tienen morfología fusiforme, expresan α-SMA y vimentina, y carecen de marcadores de superficie celular epiteliales, hematopoyéticos y endoteliales. Las células estromales caracterizadas se pueden utilizar en estudios funcionales de las interacciones epitelio-estromales.

Resumen

Murinos y de esófago humano miofibroblastos se generan a través de la digestión enzimática. Neonato (8-12 días de edad) esófago murino se cosecha, picada, se lavó, y se sometió a digestión enzimática con colagenasa y dispasa durante 25 min. Muestras de resección esofágica Humanos son despojados de muscular propia y adventicia y la mucosa restante se pica y se sometieron a digestión enzimática con colagenasa y dispasa durante un máximo de 6 horas. Las células cultivadas expresan α-SMA y vimentina y desmina expresa débilmente o no en absoluto. Las condiciones de cultivo no son propicias para el crecimiento de origen epitelial, hematopoyético o células endoteliales. La pureza del cultivo se ve confirmado por citometría de flujo de evaluación de la superficie celular marcador expresión del potencial contaminante hematopoyéticas y las células endoteliales. La técnica descrita es sencillo y resulta en la generación consistente de no hematopoieitc, las células estromales no endoteliales. Limitaciones de esta técnica son inherentes a la utilización decultivos primarios en los estudios de biología molecular, es decir, la variabilidad inevitable encuentran entre las culturas establecidas a través de diferentes ratones o seres humanos. Los cultivos primarios sin embargo, son un reflejo más representativo del estado in vivo en comparación con las líneas celulares. Estos métodos también proporcionan los investigadores la capacidad para aislar y cultivar células estromales de diferentes condiciones clínicas y experimentales, lo que permite comparaciones entre grupos. Células estromales esofágicas caracterizados también se pueden utilizar en estudios funcionales que investigan las interacciones epitelio del estroma en los trastornos esofágicos.

Introducción

Interacciones epitelio-estroma están involucrados en la regulación de una variedad de funciones del tracto gastrointestinal incluyendo la regeneración de la mucosa, la reparación, la fibrosis y la carcinogénesis ^1,2. Estas interacciones han sido mejor estudiado en el intestino delgado y el colon y pueden jugar un papel similar en los trastornos de la mucosa del esófago ^3. Una subpoblación de células del estroma miofibroblastos intestinales y colónicas denominados se ha demostrado para participar en la mediación de la lesión tisular, inflamación y reparación de ^4,5. En el tracto GI distal, estas células en forma de huso se encuentran adyacentes a la membrana basal en la interfaz entre el epitelio y la lámina propia y se definen como α-SMA y vimentina positivo, pan-citoqueratina negativa, y débilmente positivo o negativo ⁵ desmina.

El estroma de esófago no ha sido rigurosamente caracterizado a nivel celular o molecular. Nuestro trabajo en el esófago murino ha desdemostra- α-SMA células y vimentina en el estroma de esófago, de vez en cuando subyacentes al epitelio escamoso ^6. Interacciones epitelio del estroma se han implicado en trastornos de la mucosa del esófago tales como lesión mediada ⁶ gastro-esofágica y esofagitis eosinofílica ^3. Estenosis fibróticas también son una complicación conocida de las células del estroma y de lesiones esofágicas han sido implicados en la patogénesis de la fibrosis gastrointestinal. El aislamiento de estas células le ayudará a lograr los estudios necesarios para investigar vías de señalización trastornados.

Esta presentación ofrece las técnicas necesarias para establecer cultivos primarios de α-SMA, miofibroblastos positivas vimentina positivos tales que las lagunas existentes en el conocimiento sobre las vías de señalización que median estas interacciones se pueden abordar. La técnica descrita ha sido utilizado con éxito por los autores para establecer miofibroblastos de colon primarios murinos ⁷ y further adaptado para el establecimiento de murino ⁶ y las células del estroma de esófago parecidas a miofibroblastos humanos.

Aquí se describe las condiciones necesarias para establecer y caracterizar estas culturas establecidas de ratón o el esófago humano antes de su uso en futuros estudios funcionales. Las culturas pueden ser cultivadas y utilizadas para un máximo de 15 pasajes. El aislamiento y el establecimiento de cultivos primarios a través de los métodos descritos a continuación genera células estromales con un fenotipo myofibroblast; α-SMA, vimentina positivo, y débilmente positivo o negativo para desmina, y citoqueratina negativa. Este fenotipo es distinto del fenotipo de los fibroblastos de esófago que es predominantemente positiva vimentina, α-SMA negativo ³ o la α-SMA positivos, vimentina fenotipo negativo de la muscular de la mucosa ^6.

Protocolo

El protocolo para llevar a cabo experimentos con animales, la razón de ser y objetivos de la investigación, fueron presentado y aprobado por la Universidad del Sur de California Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

El protocolo para el establecimiento de cultivos primarios de desidentificados especímenes esofagectomía humanos fue aprobado por la Universidad de California Junta de Revisión Institucional del Sur.

1. Obtener el ratón o el esófago humano

1. Obtener ratón Esófago:
   1. La eutanasia del ratón viejo 8-12 días con 2% sobredosis de isoflurano inhalante seguido por dislocación cervical.
   2. Pin al animal con el vientre hacia arriba y humedecer la superficie ventral con etanol al 70%. Con unas pinzas, agarrar y levantar la parte anterior de la piel a la abertura de la uretra con fórceps. Utilice tijeras quirúrgicas rectas estándar para cortar a lo largo de la línea media ventral desde la abertura uretral a la barbilla. Tenga cuidado de cortar sólo la piel.
   3. Hacer una incisión desde la abertura hacia abajo a la rodilla en ambos lados del animal uretral, formando un revés "Y". Hacer otra incisión en ambos lados del animal a lo largo de la caja torácica.
   4. Retire con cuidado la piel en ambos lados, fuera del peritoneo subyacente y de la caja torácica, y sentar a los lados. Examinar la caja torácica que recubre la cavidad torácica y el peritoneo que recubre la cavidad abdominal.
      1. Levantar el peritoneo con una pinza y cortar a través de él hasta el diafragma y la caja torácica, apuntando hacia arriba tijeras para evitar daños a contenido abdominal. Levante ligeramente el lóbulo izquierdo del hígado, exponer el estómago subyacente, la unión esófago-gástrica y la porción abdominal del esófago.
   5. Con unas tijeras quirúrgicas en autoclave para cortar a través del esternón y la caja torácica a lo largo de la línea media hasta la cintura cervical. Tijeras Point hacia arriba para evitar daños a los contenidos torácicos. Exponer completamente el contenido de lacavidad torácica tirando de la caja torácica hacia los lados.
   6. Retire suavemente el corazón y ambos lóbulos de los pulmones. Absorbe el exceso de sangre con Q-tips. El esófago torácico es un estrecho tubo flexible de tumbado posterior, a la tráquea y anterior a la vértebra torácica.
      NOTA: El esófago puede ser difícil de identificar en los recién nacidos murinos. La localización de la unión esófago-gástrica hace que la identificación de esófago sencillo.
   7. Siga cuidadosamente el esófago del estómago, la disección de la vasculatura circundante, la grasa y el mesenterio todo el camino hasta el origen de esófago en la cavidad cervical. Tijeras quirúrgicas con punta roma funcionan mejor para este propósito.
   8. Resección de toda la longitud del esófago y el lugar en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) para su posterior procesamiento se describe a continuación. Quitar una parte del estómago para fines de orientación si se desea.
      NOTA: Debido al pequeño tamaño de los tejidos, la separación de la muscular propia del musculosoes mucosa no es alcanzable en el esófago neonato murino y todo el esófago es sometido al tratamiento se describe a continuación.
2. Obtener Esófago humana:
   1. Lávese las muestras de resección esofágica (típicamente 5 cm o menos) con HBSS y eliminar cualquier adjunto del tejido conectivo, grasa o vasculatura.
   2. Resección de una porción de la muestra y colocar en formalina para el examen histológico futuro si se desea.
   3. Separar los mucosa restantes de muscular propia subyacente por disección aguda.
   4. Cortar mucosa en fragmentos centímetro sub y sujeto con el protocolo descrito a continuación.
      NOTA: resecciones esófago Humanos se puede almacenar en PBS durante hasta 6 horas antes de la elaboración se describe a continuación. Fuente de especímenes esofagectomía dictará tamaño de la muestra y dependerá de laboratorio.

2. Aislar murinos y humanos esofágica células estromales

1. Aislar células estromales de esófago fmurino ROM y tejidos humanos mediante una combinación de digestión mecánica y enzimática.
   1. Digerir Mecánicamente picando el tejido con tijeras y múltiples lavados con HBSS. Digerir enzimáticamente por incubación del tejido con 300 U / ml de colagenasa XI y 0,1 mg / ml de dispasa durante 25 min (tejido murino) o durante un máximo de 6 hr (tejido humano). Asegúrese de que los instrumentos utilizados para picar carne se han tratado en autoclave y esterilizado.
      NOTA: Las colagenasas son enzimas que descomponen el colágeno, una proteína de la matriz extracelular responsable de la celebración de los tejidos animales juntos. La colagenasa XI tiene una alta actividad de la colagenasa y ha visto el éxito en este protocolo de aislamiento. Dispasa es una enzima bacteriana con una actividad de disociación proteolítica suave que preserva la actividad de la membrana celular y se utiliza en combinación con colagenasa como una enzima secundario.
   2. Coloque fragmentos de mucosa obtenidos de ratón o tejido humano en 1,7 ml de microcentrífuga o tubos de 5 ml, respectivamente, que contienen HBSS. Tejido Pique másen 2-3 trozos mm utilizando tijeras con una anchura de la punta abierta que se ajuste a los tubos respectivos. Permitir el tiempo suficiente para permitir fragmentos de la mucosa del esófago al sedimento al fondo del tubo.
   3. Lentamente decantar HBSS, teniendo cuidado de no descartar inadvertidamente el tejido. Reemplazar con frescos HBSS siguiente por agitación suave. Alternativamente, retire HBSS con una pipeta de 1 ml.
   4. Lavar el tejido de esta manera un total de 8 veces con agitación suave en cada lavado dejando tiempo para fragmentos esofágico para sedimentan entre cada lavado.
      NOTA: El tejido humano requerirá más pelos en la que el tejido neonato ratón.
2. Incubar el tejido murino con 300 U / ml de colagenasa XI y 0,1 mg / ml de dispasa durante 25 min en un agitador de balanceo establecido a una velocidad lenta a temperatura ambiente.
   1. Incubar el tejido humano con 300 U / ml de colagenasa XI y 0,1 mg / ml de dispasa durante un máximo de 6 horas, en un agitador de balanceo establecido a una velocidad lenta a temperatura ambiente.
      NOTA: La disponibilidad de esopha humanagus es variable. Mucosa esofágica Humano incubó con enzimas para hasta 6 resultados hr en generación exitosa de cultivos primarios.
3. Después de la digestión enzimática, el tejido de carne picada más con tijeras y se centrifuga a 200 xg durante 10 min.
4. Eliminar el sobrenadante. Transferir el pellet, que consiste en una suspensión celular mixta a un tubo de 5 ml y lavar 5 veces en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de sorbitol para eliminar las células no viables y escombros.
5. Sembrar las células en placas de 6 pocillos y la cultura en DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS), 10 mg / ml de insulina, 10 mg / ml de transferrina, 10 mg / ml de gentamicina y 2 ng del factor de crecimiento epidérmico / ml (FEAG) . Filtro de vacío (0,22 m) todos los componentes excepto EGF que se pueden añadir después de la filtración. Distribuir células obtenidas de muestras de resección humanos entre múltiples placas de 6 pocillos, dependiendo del tamaño de la resección.
6. Una vez que los pozos son 80% de confluencia, las células adherentes de paso a T25 nos matracesing 0,05% de tripsina / ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Neutralizar con medios de comunicación y de centrifugado a 400 x g.
   1. Para un pasaje 6 bien a un matraz T25, células de paso en una relación 1: 1. Matraces confluentes T25 pueden ser pasados ​​a una proporción de 1: 3: 2 ó 1. Para pasaje de un matraz T25 a un matraz T75, utilizar una proporción de 1: 1. Cambio de medio cada 2-3 días, independientemente de la embarcación.
   2. Se cultivan las células a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO ₂ y la cultura en los medios de comunicación myofibroblast descritos anteriormente.
      NOTA: Las células epiteliales no sobreviven bajo estas condiciones de cultivo o de paso. Las células utilizadas para la caracterización y en los estudios descritos a continuación son entre los pasajes 5 y 15.
   3. Cryo-preservar las células en N líquido ₂ mediante la adición de 10% de sulfóxido de dimetilo a los medios de miofibroblastos.

3. Caracterizar murinos y humanos esofágica células estromales

1. Examine la morfología de las células con un microscopio invertido. Observar la forma de husomorfología de las células adherentes (Figura 1).
2. Caracterizar las células cultivadas mediante la evaluación de los siguientes marcadores: citoesqueleto α-SMA, vimentina, desmina, y citoqueratina. Las células estromales con un fenotipo-myofibroblast como expresan marcadores myofibroblast citoesqueleto α-SMA y vimentina (Figura 2).
   1. Para distinguir además células estromales cultivadas a partir de células musculares, la inmunotinción para desmina. Para realizar la inmunotinción en las células cultivadas, la placa de 1,5 x 10 ⁴ células en portaobjetos de cámara de 4 pocillos y crecer en medios miofibroblastos durante 24 horas. Las células estromales con un fenotipo-myofibroblast como tendrán débil o ausente expresión desmina. Las células estromales carecen de la expresión del marcador epitelial pan-citoqueratina (datos no mostrados).
      NOTA: Evaluación de las culturas incluye la evaluación de los marcadores del citoesqueleto por inmunocitoquímica y marcadores de superficie celular por citometría de flujo. La inmunocitoquímica se utiliza como el método primario de la caracterización como exPerfil de compresión de las proteínas del citoesqueleto es único para los fibroblastos, miofibroblastos o célula muscular. La citometría de flujo establece la pureza del cultivo mediante la evaluación de la expresión de la superficie celular de células epiteliales, endoteliales, y marcadores de células hematopoyéticas. CD90 es útil como un método complementario de la identificación de las células estromales humanos tal como se expresa en ambos fibroblastos humanos y miofibroblastos. CD90 no es útil en la caracterización de las células del estroma murino, ya que también expresado por las células T murinas.
3. Después células alcanzan el 60% de confluencia, enjuague diapositivas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fijar con metanol. Se incuban las células en metanol durante 10 min a -20 ° C, a continuación, almacenar en PBS a 4 ° C hasta su uso.
4. Siga el protocolo de inmunotinción estándar.
5. Brevemente, antes de aplicar el anticuerpo primario, bloquear las células fijadas con 5% goatserum en PBS. Diluir anticuerpos primarios y secundarios en el 5% de suero de cabra también.
   1. Para la detección de α-SMA y vimentina, utilice elsiguientes anticuerpos y concentraciones: Mouse mAb a α-SMA en dilución 1: 250 y conejo pAB para vimentina en dilución 1: 500.
   2. Incubar con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante la noche a 4 ° C, enjuagar 3 veces con PBS y añadir anticuerpos secundarios rodamina conjugado de cabra anti ratón a una dilución de 1: 200 y Cy2 conjugado de cabra anti conejo a una dilución de 1: 1000 durante 1 hora a temperatura ambiente.
   3. Núcleos Contratinción con 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) a una concentración de 1 mg / ml durante 1 minuto y luego lavar con PBS. Analizar portaobjetos con un microscopio invertido.
6. Establecer pureza de los cultivos mediante el examen de las células esofágicas murinos y humanos para hematopoyéticas (CD45) y endoteliales (CD31) marcadores de superficie celular por citometría de flujo (Figura 3). Caracterizar las células humanas aún más por la expresión de la célula estromal marcador de superficie CD90.
   NOTA: CD90 no se puede utilizar para identificar las células estromales murinas como murino T cells también expresan CD90.
   1. Separar cultivadas las células del estroma de esófago de ratón de los frascos de cultivo mediante tratamiento con células no solución de disociación enzimática a 37 ° C durante 10 min, se lavaron con tampón FACS dos veces, se contaron y se tiñeron con FITC-CD45 y CD31-APC con controles de isotipo pertinentes, de acuerdo a procedimientos de tinción estándar.
   2. Recoger las células utilizando FACS Calibur y analizar datos con el software FlowJo. Antes de la tinción de las células, optimizar anticuerpos y titular concentraciones utilizando controles de isotipo, el bazo de ratón normal, y las células de la médula ósea.

Resultados

Células estromales esofágicas aislados utilizando digestión mecánica y enzimática se sembraron inicialmente y se cultivaron en placas de 6 pocillos. El examen de las células con un microscopio invertido dentro de horas de chapado demuestra una suspensión de células mixtas débilmente adherente a la placa de fondo (Figura 1A). Durante el próximo 24 h, las células fusiformes firmemente adheridas a la placa inferior se observan disparar desde la suspensión de células mixtas (Figura 1B) .Est...

Discusión

Las técnicas para la generación de cultivo primario son generalmente similares cuando se utiliza el tejido murino o humano con tiempos de digestión de picar carne y adaptados para el tamaño del tejido. Nuestra experiencia con el tejido murino sugiere que el uso de los métodos descritos anteriormente constantemente como resultado éxito del establecimiento de cultivos primarios. Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen la esterilización de material quirúrgico y siguiendo técnicas estériles estándar de cultivo de t...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivos
para cultivo de tejidos HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispasa	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Colagenasa XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrina	Roche	10-652-202-001
tripsina/EDTA	Corning	25-052-Cl
Factor de crecimiento epidérmico	Sigma-Aldrich	E9644
Reactivos para inmunotinción Suero de
cabra	Sigma Aldrich	G9023
MAB de ratón a α-SMA	abcam	ab7817
Conejo pAB a vimentina	abcam	ab45939
Cy2 conjugado Cabra anti Conejo	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 conjugado a eFluor 450	eBioscience	48-0319-41
CD90 conjugado a APC	eBioscience	17-0909-41
Anexina V y 7AAD	BD Pharmigen	559763
Bloque Fc de ratón para CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Equipo
Tubo de 5 ml	Microscopio invertido Eppendorf	30108310
	Motic	AE31
Cabina de bioseguridad e incubadoras	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4 portaobjetos
	Eppendorf	5810R
Olympus Sistema de filtro accionado por vacío	Genesee Scientific	25-227
Microscopio fluorescente	Nikon	Eclipse TE300
Placas de 6 pocillos	Corning	3516
T25 Frascos	TRP	90026
T75 Matraces	Corning	43064
Tijeras
disección Pinzas
Q-Tips de una sola punta	Kendall	540500
Software
Metamorph software (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience

Centrífuga refrigerada Thermo Scientific 177437 de de disección