Abstract
O mouse é agora o animal primário usado para modelar uma variedade de doenças pulmonares. Para estudar os mecanismos que estão por trás dessas patologias, são necessários métodos fenotípicos que podem quantificar as alterações patológicas. Além disso, para proporcionar relevância translacional para os modelos de ratinho, tais medições devem ser testes que podem ser facilmente feitos em ambos os seres humanos e ratinhos. Infelizmente, no presente literatura algumas medições fenotípicas da função do pulmão têm aplicação directa em seres humanos. Uma exceção é a capacidade de difusão do monóxido de carbono, que é uma medida que é feito rotineiramente em seres humanos. No presente relatório, nós descrevemos um meio para medir rapidamente e simplesmente esta capacidade de difusão em camundongos. O procedimento envolve a inflação pulmonar breve com gases marcadores num rato anestesiado, seguido por um 1 min de tempo de análise de gás. Nós testamos a capacidade deste método para detectar várias patologias pulmonares, incluindo enfisema, fibrose, lesão pulmonar aguda e gripe einfecções pulmonares fúngicas, bem como a maturação pulmonar monitoramento em filhotes jovens. Os resultados mostram uma diminuição significativa em todas as patologias pulmonares, bem como um aumento da capacidade de difusão com a maturação pulmonar. Esta medida da capacidade de difusão pulmonar, portanto, fornece um teste de função pulmonar, que tem ampla aplicação com a sua capacidade de detectar mudanças estruturais fenotípicas com a maioria dos modelos de pulmão patológicas existentes.
Introduction
O mouse é agora o animal primário usado para modelar uma variedade de doenças pulmonares. Para estudar os mecanismos que underly tais patologias, são necessários métodos fenotípicos que podem quantificar a que as alterações patológicas. Embora existam muitos estudos com ratos, onde ventilação mecânica são medidos, essas medidas são geralmente relacionado com as avaliações padrão da função pulmonar normalmente feitos em seres humanos. Isso é lamentável, uma vez que a capacidade de executar as medidas equivalentes em camundongos e seres humanos podem facilitar a tradução dos resultados em modelos de ratos para doenças humanas.
Uma das medidas mais comuns e facilmente feitas em seres humanos é a capacidade de difusão do monóxido de carbono (DLCO) 1,2, mas esta medida só foi raramente feito em modelos de ratos. Nesses estudos, onde foi relatado 3-7, não houve estudos de acompanhamento, em parte porque os procedimentos são frequentemente onerosos ou pode reqùire equipamentos complexos. Outra abordagem é a utilização de um método de CO reinalatório em um sistema de estado estacionário, o que tem a vantagem de ser capaz de medir a difusão de CO em ratos conscientes. No entanto, este método é muito complicado, e os resultados podem variar de acordo com o nível de ventilação do rato bem como de O 2 e CO 2 concentrações de 8,9. Essas dificuldades parecem ter impedido o uso rotineiro de capacidade de detectar patologias pulmonares em ratos difusão, apesar de suas várias vantagens.
Para contornar os problemas com a medição da capacidade de difusão em camundongos, os detalhes de um meio simples para medi-lo em camundongos têm sido relatados recentemente 10. O procedimento elimina o difícil problema de amostragem de gás alveolar não contaminada por amostragem rapidamente um volume igual a todo o gás inspirado. Este procedimento resulta em uma medida muito reprodutível, o denominado factor de difusão para o monóxido de carbono (Dfco), que é sensível a uma série de pathologic alterações no fenótipo pulmonar. O Dfco é portanto calculada como 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), onde a e c 9 subscritos referem-se a concentrações de gases de calibração injectados e os gases eliminados após um tempo de 9 s apneia, respectivamente. Dfco é uma variável adimensional, o qual varia entre 0 e 1, com 1 reflectindo a absorção completa de todo o CO, e 0 reflectindo qualquer absorção de CO.
Nesta apresentação, mostram como fazer a medição da capacidade de difusão, e como ela pode ser usada para documentar as alterações em quase todos os modelos existentes doença do pulmão do rato, incluindo enfisema, fibrose, lesão pulmonar aguda, e infecções virais e fúngicas.
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Protocol
NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê Universidade Animal Care and Use a Johns Hopkins.
1. Preparação de animais
- Prepare ratos 6 C57BL / 6 de controle para a medição Dfco, anestesiando-los com cetamina e xilazina, conforme descrito no passo 2.3 abaixo.
- Preparar todos os outros ratinhos com os diferentes patologias pulmonares mostrados na Tabela 1, utilizando o mesmo procedimento que para os controlos. Detalhes específicos necessários para estabelecer cada um destes modelos são encontrados nas referências relevantes. Os ratos de controlo e os dos outros grupos patológicos são todos 6-12 semanas de idade.
2. Medição do Fator de Difusão de monóxido de carbono (Dfco)
- Configure o módulo cromatógrafo a gás fornecido com o equipamento para medir os picos de nitrogênio, oxigênio, néon, e monóxido de carbono. Para este uso aplicação apenas os dados de néon e CO.
NOTA: Este instrumento utiliza um s molecularescoluna IEVE com hélio como gás de transporte, com 12,00 mm filme, 320,00 mm ID e 10 m de comprimento. A coluna de cromatografia tem um volume de 0,8 ml, mas utilizou-se 2 ml para assegurar adequada compensação da tubagem de ligação com a amostra. - No início de cada dia experimental, antes de se efectuarem as medições das amostras a partir dos ratinhos, tomar uma amostra de 2 ml directamente a partir de um saco de mistura de gás que contém cerca de 0,5% Ne, 0,5% de CO, e equilibrar ar, e usar esta amostra para calibrar o cromatógrafo a gás.
- Anestesiar ratos com cetamina (90 mg / kg) e xilazina (15 mg / kg), e confirmar a anestesia pela ausência do reflexo do movimento. Aplicar pomada veterinária sobre os olhos para evitar o ressecamento. Tracheostomize os ratos com uma cânula de agulha stub (18 g em adultos ou 20 G em muito jovem ratos).
NOTA: O Dfco é completada em menos de 10 minutos após a anestesia e antes de qualquer ventilação mecânica ou outros procedimentos. - Em ratinhos superiores a 6 semanas de idade, usar uma seringa de 3 ml to retirar 0,8 ml de gás a partir do saco de mistura de gás. Ligar a seringa para a cânula traqueal e rapidamente inflar o pulmão. Usando um metrônomo, conte 9 seg, e então rapidamente retirar os 0,8 ml (no ar expirado).
- Diluir esta retirados 0,8 ml ar exalado para 2 ml com ar ambiente, deixe-a descansar por pelo menos 15 segundos. Em seguida, injetar toda a amostra no cromatógrafo a gás para análise.
- Ao analisar esta primeira amostra Dfco, inflar o pulmão do rato com um segundo de 0,8 ml do saco de mistura de gases, e, em seguida, processar esta amostra idêntica à primeira amostra. Calcular a média das duas medidas Dfco.
NOTA: Para medições em ratos jovens como de 2 semanas de idade, usar um volume de 0,4 ml, 0,8 ml é desde um volume demasiado importante para fazer medições em pulmões de ratos muito jovens. É preferível utilizar o volume de 0,8 ml para os ratinhos mais velhos de 6 semanas, e que, se o volume de 0,4 ml é necessária para alguns ratinhos, que deve ser utilizado de forma consistente para todos os ratinhos no grupo a ser estudados. - Calcule Dfcocomo 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), onde C e 9 subscritos referem-se as concentrações dos gases de calibração injetados e os gases removidos após um 9 seg tempo apneia, respectivamente.
- Analisar e comparar as diferenças com um one-way ANOVA e avaliar o nível de significância com correção de Tukey para comparações múltiplas em todos os ratos de coorte. Considere p <0,05 como significativo.
NOTA: Todos os ratos usados aqui foram parte de estudos experimentais envolvendo várias medições posteriores de ventilação pulmonar, mecânica, lavagem pulmonar, ou histologia, que não são aqui relatados. Além disso, uma vez que o método é o mesmo em todos os modelos experimentais como foi feito acima nos ratinhos de controlo, somente os resultados de vários modelos patológicos são apresentados. Informação adicional sobre estes modelos é apresentada na tabela suplementar. - Eutanásia os animais por anestesia profundasobredosagem tic seguido por deslocamento cervical ou decapitação. Sempre que necessário, remover as células e / ou tecidos do pulmão dos ratos mortos para mais biológico ou processamento histológico e análise.
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Representative Results
A Figura 1 mostra as medições Dfco dos ratos adultos em grupos A, B, C, D, E e F. Houve uma redução significante com ambas as infecções por Aspergillus e da gripe, bem como diminuições significativas na fibrótica, enfisema, e aguda modelos de lesão do pulmão. A Figura 2 mostra as alterações do Grupo G de desenvolvimento em Dfco ao longo do tempo como a idade ratinhos 2-6 semanas. Houve um ligeiro mas significativo aumento no desenvolvimento pulmonar ao longo deste curso de tempo. O efeito de utilizar um volume menor de inflação foi também bastante aparente no ponto de tempo de 6 semanas. Houve uma tendência para as fêmeas têm uma Dfco ligeiramente superior, mas isto foi apenas significativo no ponto de tempo de 5 semanas.
| Grupo | Patologia ou condição | Comentários |
| A | C57BL / 6 controlos (8-10 semanas), n = 6 | Já os ratos saudáveis </ Td> |
| B | Ratinhos C57BL / 6 dada 25 TCID50 de vírus da gripe A (PR8) por via intranasal, n = 10 | Modelo de Influenza, estudou 6 e 8 dias após a infecção |
| C | Murganhos C57BL / 6 5,4 L dado por via intratraqueal elastase pancreática, n = 6 | Modelo de enfisema 10,13 estudaram 21 dias após o desafio elastase |
| D | Ratinhos C57BL / 6 dada 0,05 U de bleomicina por via intratraqueal, n = 6 | Modelo de fibrose 14 estudaram 14 dias após o desafio bleomicina |
| E | CFTR controles nulos e os infectados com inalação de aerossóis de Aspergillus fumigatus (AF293 estirpe), n = 6 | Modelo de infecção fúngica 11,17 estudaram 12 dias após a infecção fúngica |
| F | Ratinhos C57BL / 6 dados 3 ug de LPS / g BW (Escherichia coli) por via intratraqueal, n = 6 | Acute Lung Injury (ALI) modelo de 15 estudadanos dias 1 e 4 após o insulto LPS |
| G | Murganhos C57BL / 6 do sexo masculino com 2 a 6 semanas de idade, n = 5 em cada idade | Modelo de desenvolvimento Lung |
Tabela 1: Lista dos diferentes modelos de ratos, onde o Dfco foi medido.
Figura 1:. Medição de Dfco no controlo de murganhos C57BL / 6 (grupo A) e em cada um dos 5 diferentes modelos patológicos São mostrados resultados 6 e 8 dias após a gripe PR8 (Grupo B), 21 dias após a elastase intratraqueal (Grupo C), 14 dias após a bleomicina intratraqueal (Grupo D), 12 dias após a infecção por Aspergillus em ratinhos nulos CFTR (Grupo E), e 1 e 4 dias após a instilação de LPS (Grupo F). O * indica P <0,01 vs. controlo, indica a # P <0,01 entre a 6 e8 ratinhos influenza dia e os ratos dia LPS 1 e 4, e os + indica P <0,05 vs. controle.
Figura 2: Medição de Dfco macho em ratinhos C57BL / 6 a partir de 2 a 6 semanas de idade (Grupo G) As medições foram feitas em todos os ratinhos com um volume de inflação de 0,4 ml, e em 6 semanas de idade murganhos uma segunda medição foi. feita com 0,8 ml. Com o volume de 0,4 ml, houve aumentos significativos em Dfco entre o macho duas semanas e aqueles em 4, 5 e 6 semanas (P <0,05).
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Discussion
No presente trabalho, definimos uma nova métrica para quantificar a capacidade trocas gasosas do pulmão do rato. Esta métrica é análoga à capacidade de difusão, uma medida clínica comum que mede a função primária do pulmão, isto é, a sua capacidade para a troca de gás. A capacidade de difusão é a única medida funcional do pulmão que podem ser facilmente e rapidamente feito em ambos os ratos e os seres humanos. Para a detecção da doença de pulmão em camundongos, um objectivo importante é quantificar alterações na função pulmonar entre o controle e coortes experimentais. Para atingir este objetivo, temos definido e utilizado o Dfco para demonstrar a sua capacidade de quanitfying alterações fenotípicas na maioria dos modelos mais comuns da doença de pulmão em camundongos, incluindo alterações funcionais, com o desenvolvimento dos pulmões.
Um pressuposto inerente na abordagem que simplifica a medição Dfco em ratinhos é de que o efeito do gás inspirado sem mistura, no espaço morto anatómico e equipamento é ignORed. No entanto, como anteriormente descrito 10, a utilização do volume de inflação 0,8 ml introduz um erro pequeno mas consistente em todas as medições. A magnitude desse erro é uma função dos tamanhos relativos da inflação e volumes de espaço morto. Na presente abordagem, este erro é minimizado eliminando o espaço morto em torneiras ou conectores em T, e como mostrado no vídeo, simplesmente utiliza uma ponta do dedo para selar a seringa e facilitar a transferência de gás. Este procedimento resulta em uma alta repetibilidade entre as medidas. O efeito do volume de inflação necessária menor em ratinhos jovens é claro nos ratinhos seis semanas de idade mostrado na Figura 2, em que o teste inicial de 0,4 ml foi imediatamente seguido por um ensaio de 0,8 ml em cada ratinho. Com 0,8 ml do valor Dfco em estava na gama de ratinhos C57BL / 6 nos outros grupos, mas a medição com 0,4 ml é consistentemente menor. Esta é uma manifestação directa do facto de que, com o volume mais pequeno, o recovered 9 seg amostra tem uma maior fracção do ar de espaço morto, que consiste de apenas as concentrações de gases de controlo. Este facto manifesta-se como uma alteração menor fraccionada na concentração de CO que o aproxima da variação na concentração do Ne. Com um aumento da proporção de CO / Ne, o Dfco calculado (1 - este ratio) é, portanto, menor.
Em muitos modelos de patologia pulmonar mostrados na Figura 1, havia uma redução significativa observada em Dfco. No entanto, existem várias razões pelas quais o Dfco reduções nesses modelos diferentes. Na fibrose causada por uma dose única de bleomicina, há inflamação e um espessamento da barreira de difusão que leva a uma redução na capacidade de difusão 16. No enfisema, há uma perda de área de superfície actua directamente para diminuir tanto a área de superfície para a difusão e o volume de sangue nos capilares que tinham sido destruídos nas paredes. Nenhuma relação dose-resposta com os elastase estão aqui apresentados, mas os dados não publicados mostra uma boa correlação da Dfco com o nível de danos de enfisema. Com a infecção da gripe, há uma redução na capacidade provavelmente como resultado de tanto um espessamento da barreira de difusão e um aumento em regiões não ventilados consolidadas de difusão do pulmão. No modelo influenza PR8 usado aqui, isto agrava ao longo do tempo (como reflectido na diminuição adicional significativa em Dfco no dia 8), e os ratinhos morrem geralmente por volta do dia 10. Nos ratinhos nulos CFTR, houve um Dfco menor no início do estudo , mas estes ratos são feitas em um fundo genético misturado 17, portanto, pode haver diferenças estruturais com os controles C57BL6. No entanto, a infecção por Aspergillus causou uma diminuição significativa mais substancial em Dfco, e as razões para este declínio com a infecção fúngica é provável semelhantes aos com a influenza. Os resultados LPS na inflamação aguda, que provoca uma redução significativa do Dfco, susceptível de espessamento edematoso do dibarreira ffusion e regiões sem ventilação do pulmão cheio de fluido. Com a dose de LPS utilizada, a diminuição da Dfco é maior no dia 4 ou 5 e, em seguida, recupera de volta para o controlo no dia 10 (dados não mostrados).
Para a análise das mudanças no Dfco com o crescimento do pulmão nos ratos jovens, o volume de inflação de 0,4 ml claramente permitiu medições reprodutíveis, e foi capaz de mostrar um aumento lento da capacidade como a maturidade adulta pulmão atingido (Figura 2) difusão. O efeito da utilização de um menor volume de 0,4 ml de inflação na diminuição da Dfco calculado é também o que era esperado, mas o maior volume de 0,8 ml não podem ser utilizados nos ratinhos menores. Mas as mudanças com o desenvolvimento ou a patologia ainda deve ser reprodutível detectável mesmo com o volume de 0,4 ml.
Em conclusão, este vídeo e manuscrito em anexo mostra como obter uma medição funcional em ratos que é similar ao que pode ser medido em seres humanos. A métrica reflecte a umabilidade do pulmão para a troca de gás com uma variedade de alterações estruturais pulmonares causadas por patologias mais comumente estudadas. Este fator de difusão do monóxido de carbono (Dfco) é altamente reprodutível e sensível o suficiente para detectar alterações funcionais e estruturais com patologias induzidas mais experimentalmente em camundongos jovens ou velhos. O facto de que é directamente análoga às medições efectuadas em seres humanos para avaliar a doença pulmonar, faz com que seja uma forma simples de se obter uma métrica muito relevante para phenytype patologias pulmonares do rato.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse, e nada a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
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