Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D

Resumen

Los macrófagos son las células clave implicadas en la patogenicidad del huésped. Los macrófagos muestran una diversidad fenotípica y funcional que puede ser analizada y detectada mediante análisis proteómico. Este artículo describe cómo realizar electroforesis 2D de cultivos primarios de macrófagos humanos diferenciados en fenotipo M1 o M2.

Resumen

El objetivo del protocolo de electroforesis bidimensional (2D) descrito aquí es mostrar cómo analizar el fenotipo de macrófagos humanos cultivados. Se ha demostrado el papel clave de los macrófagos en diversos trastornos patológicos como enfermedades inflamatorias, inmunológicas e infecciosas. En este protocolo, utilizamos cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos humanos que se pueden diferenciar en el fenotipo M1 (proinflamatorio) o M2 (antiinflamatorio). Este modelo in vitro es fiable para estudiar las actividades biológicas de los macrófagos M1 y M2 y también para un enfoque proteómico. Las técnicas proteómicas son útiles para comparar el fenotipo y el comportamiento de los macrófagos M1 y M2 durante la patogenicidad del huésped. La electroforesis en gel 2D es una potente técnica proteómica para mapear un gran número de proteínas o polipéptidos simultáneamente. Describimos el protocolo de electroforesis 2D mediante colorantes fluorescentes, denominado Electroforesis en Gel Diferencial 2D (DIGE). Las proteínas de los macrófagos M1 y M2 se marcan con colorantes de cianina antes de su separación por enfoque isoeléctrico, de acuerdo con su punto isoeléctrico en la primera dimensión, y su masa molecular, en la segunda dimensión. A continuación, se utilizan puntos polipeptídicos o de proteínas separados para detectar diferencias en los niveles de expresión de proteínas o polipéptidos. Los enfoques proteómicos descritos aquí permiten la investigación de los cambios en las proteínas de los macrófagos asociados con diversos trastornos como la patogenicidad del huésped o las toxinas microbianas.

Introducción

Los macrófagos son células heterogéneas y de plástico que son capaces de adquirir fenotipos funcionales distintos. In vivo, estas células responden a una gran variedad de signalssuch ambiental micro como productos microbianos, citoquinas, etc. ^1. In vitro, el fenotipo pro-inflamatoria (M1) de macrófagos puede ser inducida por lipopolisacárido (LPS) y el fenotipo anti-inflamatoria (M2) por algunas citoquinas tales como la interleuquina-4 (IL-4). Además, los macrófagos pueden cambiar de un M1 a M2 fenotipo activado, y por el contrario, de las señales específicas ^2.

Dependiendo del fenotipo, macrófagos tendrán diferentes funciones. Macrófagos M1 son células que producen citoquinas pro-inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), para matar microorganismos o células tumorales ^3. En contraste, los macrófagos M2 prevenir estas respuesta inflamatoria como en la curación de heridas y la fibrosis mediante la producción de anti-inflammatorY factores tales como TGF-β ^3,4.

Células mononucleares de sangre periférica humanos de donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad Ficoll como se describió anteriormente ⁵ utilizando una técnica adaptada de Boyum ^6. Los macrófagos en cultivo pueden diferenciarse en M1 o M2 fenotipo después de 6 días de cultivo primaria ^7.

Análisis de la expresión de proteínas o cambios en las proteínas entre los dos subtipos de macrófagos en virtud de diversos estímulos controlados, tales como la patogenicidad de host o toxinas microbianas, será útil para descifrar la funcionalidad de la pro- y anti-macrófagos inflamatorios.

Proteómica son herramientas únicas para la supervisión directa de las proteínas que son específicamente altura o hacia abajo-regulada en los macrófagos humanos cultivados bajo diferentes estímulos. Los tintes fluorescentes han resuelto algunas de las limitaciones de la electroforesis en gel de 2D, tales como una baja sensibilidad y análisis de imagen ^{8 <} / Sup>. Los colorantes que reaccionan con residuos de cisteína han aumentado la sensibilidad de detección en comparación con los reaccionar con residuos de lisina ^9. En un estudio anterior, hemos demostrado la utilidad del etiquetado saturación DIGE para el análisis de los escasos ¹⁰ muestras en comparación con el teñido de plata clásica electroforesis 2D ^11. Esta tecnología es útil para analizar rápidamente modificaciones de la proteína entre los dos subtipos de macrófagos o entre los macrófagos no tratados y tratados del mismo subtipo.

Las ventajas de esta técnica proteómica están teniendo acceso a la información de tamaño de la proteína y las modificaciones posteriores a la traducción mediante el análisis del gel 2D ^12. Debe tenerse en cuenta que esta no es una técnica de alto rendimiento, lo que limita el número de muestras que se pueden analizar. El desarrollo de ensayos de alto rendimiento basados ​​en espectrometría de masas como revisado recientemente ¹³ puede mejorar esto.

_content "> Aquí presentamos cómo realizar análisis DIGE 2D a partir de la extracción de proteínas de los macrófagos en cultivo a través de los procesos de electroforesis, isoelectroenfoque y SDS-PAGE, así como información sobre la utilidad de software 2D adecuada.

Protocolo

El protocolo sigue las directrices de nuestro comité de instituciones de ética de la investigación humana. Capa de donantes humanos sanos Buffy se obtuvieron de la Transfusión de Sangre del Centro Regional (Lille, Francia). Las muestras obtenidas de las capas leucocitarias se declaran como una colección Inserm (n ° DC2010-1209).

1. Material y Cultura Preparación de Medios

1. Diluir 10 veces de tampón fosfato salino (PBS) en agua destilada estéril para obtener PBS 1x.
2. Hacer RPMI 1640 suplementado con gentamicina (40 mg / ml) y L-glutamina (2 mM), con y sin 10% de suero humano agrupado.

2. Los cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos (MDM)

1. Diluir buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Coloque con cuidado en un / tubo Leucosep Ficoll y se centrifuga a 1600 xg durante 20 min, a temperatura ambiente.
2. Recoge los monocitos en la interfaz en un nuevo tubo. Lavar 3 veces con 10 ml de PBS 1X que contiene 0,1% etilendiaminotetraacéticoácido acético (EDTA) por centrifugaciones sucesivas a 1000 xg, 370 xg y 160 xg durante 10 min cada uno, y luego una vez en 1X PBS solo a 160 xg durante 10 min.
3. Resuspender el sedimento celular en 5 ml de medio RPMI-1640 sin suero y sembrar las células en placas de 35 mm a una densidad de 1 x 10 ⁶ células por plato.
4. Después de la sedimentación durante 90 min en la incubadora, descartar el sobrenadante que contiene las células no adherentes. Lavar las células adherentes, que consiste en monocitos, 3x con 1 ml de PBS; a continuación, añadir 1 ml de medio fresco que contiene 10% (v / v) de suero humano a las células previamente libres de suero.
5. Después de 6 días de cultivo, para producir los macrófagos diferenciados alternativos (M2), añadir recombinante humano IL-4 (15 ng / ml) y mantener durante 6 días. A continuación, tratar macrófagos diferenciados con lipopolisacárido (100 ng / ml) en el día 12 durante 4 horas para obtener los macrófagos M1.

3. Extracción de M1 y M2 macrófagos Proteínas de electroforesis 2D

1. Lave macrophedades tres veces con 25 mM Tris, pH 7,4, y desechos en tampón que contenía 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato (CHAPS), 2 M tiourea y 7 M urea.
2. Lyse células utilizando un mezclador adecuado para tubos de 1,5 ml de microcentrífuga durante 5 min en hielo y se almacena a -20 ° C.
3. Determinar la concentración de proteína usando un reactivo de Bradford comercial. Almacenar 100 ml de alícuotas de las proteínas a -20 ° C hasta su uso.

4. isoelectroenfoque

NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de etiquetado en la oscuridad.

1. Reducir 5 g de cada muestra (M1 y M2 macrófagos) ajustado a 9 l con tampón de lisis con 2 mM de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) durante 1 hora a 37 ° C.
2. Añadir cianina 3 (Cy3) para extraer M1 y el extracto de colorante reactivo sulfhidrilo M2 a una concentración de 0,8 de proteína / g nM. Añadir cianina 5 (Cy5) para M1 y M2 extrae a una concentración de 0,8 nM de proteína / g e incubardurante 30 min a 37 ° C.
3. Detener la reacción con la adición de un volumen igual de tampón de muestra que contiene 7 M urea, 2 M tiourea, 4% de CHAPS, ditiotreitol 130 mM (DTT) y 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3-etiquetados muestras M1 M2 con muestras marcadas con Cy5 en una mano y Cy3-etiquetados muestras M2 con muestras M1 etiquetados con Cy5 en otra parte.
5. Rehidratar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) tira (240 mM, pH 3-10 gradiente lineal) con 450 l de muestras mezcladas marcadas en tampón que contenía 7 M urea, 2 M de tiourea y 4% de CHAPS en un sistema de células de enfoque isoeléctrico (IEF) durante 24 horas sin aplicar ninguna corriente.
6. Realizar el enfoque a 300 voltios (V) durante 3 horas, y luego en un gradiente a 1000 V durante 6 horas, en un gradiente a 8000 V durante 3 horas y finalmente a 8000 V durante 3 horas.

5. segunda dimensión

NOTA: Lleve a cabo todos los procedimientos de electroforesis en la oscuridad.

1. Incubar las tiras IPG en tampón de equilibrio contienening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 30% (v / v) de glicerol durante 10 min.
2. Transferencia de las tiras IPG equilibradas para la segunda dimensión (electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE)) en 12,5% en geles de PAGE y sellar con bajo punto de fusión de agarosa.
3. Llevar a cabo la electroforesis a 20 ° C utilizando un sistema Ettan-Daltsix a un voltaje constante de 70 V durante la noche seguido por 300 V hasta que el azul de bromofenol frontal alcanza la parte inferior del gel.

Análisis Adquisición y bioinformático 6. Imagen

1. Geles de exploración emitidos entre las dos placas de vidrio de baja fluorescencia con un escáner DIGE Imager en longitudes de onda de excitación / emisión de 532/580 nm para Cy3 y 633/670 nm para Cy5 para producir imágenes con un tamaño de píxel de 100 micras.
2. Realizar análisis de imágenes con software comercial como se detalla anteriormente ^12.
3. Calcular y normalizar los volúmenes puntuales en cada imagen. Asigne un volumen normalizado lugar como apoyoortion del valor total de cada mancha detectada en el gel.
4. Analizar las diferencias de volúmenes disponibles para cada tipo de proteína de los macrófagos mediante la comparación del valor de volumen normalizado punto entre los dos grupos (M1 y M2). Tenga en cuenta la diferencia entre los volúmenes disponibles para ser significativo si el cambio es de 1,5 veces (p <0,05, de un solo sentido el análisis de ANOVA).

Resultados

Para realizar el análisis proteómico diferencial apropiado, el procesamiento de las muestras para ser analizadas debe ser verificada.

En el ejemplo presentado, la calidad de cultivo celular de los macrófagos se requiere para los aspectos morfológicos y moleculares según lo publicado previamente ^5. La diferenciación de los monocitos en macrófagos y la homogeneidad de la cultura fue seguido por microscopía de fase. Figura 1 mostró un ejemplo de cultivos primarios de...

Discusión

El protocolo se describe en el presente documento detalla un método para analizar el impacto de diversos estímulos de los dos subtipos de macrófagos, M1 (pro-inflamatoria) y M2 (anti-inflamatorio). Los cultivos primarios de macrófagos M1 y M2 se obtuvieron de la diferenciación de los monocitos según lo publicado previamente ^7.

El procedimiento de la electroforesis en gel 2D DIGE requiere materiales y equipos especializados, tales como células IEF para placas isoelectroenfoque, baj...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutamina-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamicina 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
suero humano	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1.077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
placa de 6 pocillos PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolisacárido	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Investigación Orgánica	3.00E+01
Filtro 0.22 y micro; m	Millipore	SCGPTORE
Cilindro de 100 ml	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reactivo	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-colorante reactivo	GE Healthcare	25-8009-83
Tira IPG 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean Célula IEF	Bio-Rad	165-4000
Agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen	15517-014
Sistema Ettan-Daltsix	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Escáner de imágenes	GE Healthcare
Progenesis Samespot Dinámica			no lineal
Tubos de 50 ml	cualquier proveedor	n/a
Tubos de 15 ml	cualquier proveedor	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
sué e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
TDT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	114391
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Acrilamida 40%	Bio-Rad	161-0148
Limpieza 2D GE	Healthcare	80-6454-51
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Oscuro; tilformamida	Sigma-Aldrich	22705-6
mechas de electrodo	Bio-Rad	165-4071