Los macrófagos son las células clave implicadas en la patogenicidad del huésped. Los macrófagos muestran una diversidad fenotípica y funcional que puede ser analizada y detectada mediante análisis proteómico. Este artículo describe cómo realizar electroforesis 2D de cultivos primarios de macrófagos humanos diferenciados en fenotipo M1 o M2.
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Artículo de método
Proteómico de perfiles de los macrófagos por electroforesis 2D
En este artículo
Resumen
Resumen
El objetivo del protocolo de electroforesis bidimensional (2D) descrito aquí es mostrar cómo analizar el fenotipo de macrófagos humanos cultivados. Se ha demostrado el papel clave de los macrófagos en diversos trastornos patológicos como enfermedades inflamatorias, inmunológicas e infecciosas. En este protocolo, utilizamos cultivos primarios de macrófagos derivados de monocitos humanos que se pueden diferenciar en el fenotipo M1 (proinflamatorio) o M2 (antiinflamatorio). Este modelo in vitro es fiable para estudiar las actividades biológicas de los macrófagos M1 y M2 y también para un enfoque proteómico. Las técnicas proteómicas son útiles para comparar el fenotipo y el comportamiento de los macrófagos M1 y M2 durante la patogenicidad del huésped. La electroforesis en gel 2D es una potente técnica proteómica para mapear un gran número de proteínas o polipéptidos simultáneamente. Describimos el protocolo de electroforesis 2D mediante colorantes fluorescentes, denominado Electroforesis en Gel Diferencial 2D (DIGE). Las proteínas de los macrófagos M1 y M2 se marcan con colorantes de cianina antes de su separación por enfoque isoeléctrico, de acuerdo con su punto isoeléctrico en la primera dimensión, y su masa molecular, en la segunda dimensión. A continuación, se utilizan puntos polipeptídicos o de proteínas separados para detectar diferencias en los niveles de expresión de proteínas o polipéptidos. Los enfoques proteómicos descritos aquí permiten la investigación de los cambios en las proteínas de los macrófagos asociados con diversos trastornos como la patogenicidad del huésped o las toxinas microbianas.
Introducción
Los macrófagos son células heterogéneas y de plástico que son capaces de adquirir fenotipos funcionales distintos. In vivo, estas células responden a una gran variedad de signalssuch ambiental micro como productos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, el fenotipo pro-inflamatoria (M1) de macrófagos puede ser inducida por lipopolisacárido (LPS) y el fenotipo anti-inflamatoria (M2) por algunas citoquinas tales como la interleuquina-4 (IL-4). Además, los macrófagos pueden cambiar de un M1 a M2 fenotipo activado, y por el contrario, de las señales específicas 2.
Dependiendo del fenotipo, m....
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Protocolo
El protocolo sigue las directrices de nuestro comité de instituciones de ética de la investigación humana. Capa de donantes humanos sanos Buffy se obtuvieron de la Transfusión de Sangre del Centro Regional (Lille, Francia). Las muestras obtenidas de las capas leucocitarias se declaran como una colección Inserm (n ° DC2010-1209).
1. Material y Cultura Preparación de Medios
- Diluir 10 veces de tampón fosfato salino (PBS) en agua destilada estéril para obtener PBS 1x.
- Hacer RPMI 1640 suplementado con gentamicina (40 mg / ml) y L-glutamina (2 mM), con y sin 10% de suero humano agrupado.
2. ....
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Resultados
Para realizar el análisis proteómico diferencial apropiado, el procesamiento de las muestras para ser analizadas debe ser verificada.
En el ejemplo presentado, la calidad de cultivo celular de los macrófagos se requiere para los aspectos morfológicos y moleculares según lo publicado previamente 5. La diferenciación de los monocitos en macrófagos y la homogeneidad de la cultura fue seguido por microscopía de fase. Figura 1 mostró un ejemplo de cultivos primarios de.......
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Discusión
El protocolo se describe en el presente documento detalla un método para analizar el impacto de diversos estímulos de los dos subtipos de macrófagos, M1 (pro-inflamatoria) y M2 (anti-inflamatorio). Los cultivos primarios de macrófagos M1 y M2 se obtuvieron de la diferenciación de los monocitos según lo publicado previamente 7.
El procedimiento de la electroforesis en gel 2D DIGE requiere materiales y equipos especializados, tales como células IEF para placas isoelectroenfoque, baj.......
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Divulgaciones
No hay conflicto de intereses declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por Inserm. Marion Bouvet es miembro del Ministerio de Investigación y Tecnología de Francia. Annie Turkieh es becaria del FP7 HOMAGE (305507) de la Unión Europea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-glutamina-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| gentamicina 10 mg/ml | Invitrogen | 15710-049 | |
| suero humano | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1.077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| placa de 6 pocillos PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| lipopolisacárido | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Investigación Orgánica | 3.00E+01 | |
| Filtro 0.22 y micro; m | Millipore | SCGPTORE | |
| Cilindro de 100 ml | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| Bradford reactivo | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-colorante reactivo | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| Tira IPG 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean Célula IEF | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Agarosa de bajo punto de fusión | Invitrogen | 15517-014 | |
| Sistema Ettan-Daltsix | GE Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Escáner de imágenes | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot Dinámica | no lineal | ||
| Tubos de 50 ml | cualquier proveedor | n/a | |
| Tubos de 15 ml | cualquier proveedor | n/a | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| sué e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| TDT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Acrilamida 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| Limpieza 2D GE | Healthcare | 80-6454-51 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Oscuro; tilformamida | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| mechas de electrodo | Bio-Rad | 165-4071 |
Referencias
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al.
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Reimpresiones y permisos
