Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro

Resumen

La luz de xenón no coherente se hizo pasar a través de filtros de interferencia de banda estrecha y densidad neutra para entregar luz de longitud de onda e intensidad variables a las células cultivadas. Este protocolo se utilizó para evaluar los efectos de la terapia con luz roja/infrarrojo cercano sobre la producción de especies reactivas in vitro: no se observaron efectos utilizando los parámetros probados.

Resumen

/ Terapia Red de infrarrojo cercano luz (R / NIR-LT), entregado por láser o diodo emisor de luz (LED), mejora los resultados funcionales y morfológicos en una gama de lesiones del sistema nervioso central in vivo, posiblemente mediante la reducción del estrés oxidativo. Sin embargo, se han mostrado efectos de R / NIR-LT sobre el estrés oxidativo a variar dependiendo de la longitud de onda o la intensidad de la irradiación. Los estudios que compararon los parámetros de tratamiento se carece, debido a la ausencia de dispositivos disponibles en el mercado que ofrecen múltiples longitudes de onda o intensidades, apto para alta rendimiento de procesamiento en los estudios de optimización vitro. Este protocolo describe una técnica para la entrega de la luz en una gama de longitudes de onda e intensidades para optimizar las dosis terapéuticas requeridas para un modelo de lesión dado. La hipótesis de que un método de entrega de la luz, en el que los parámetros de longitud de onda e intensidad podría modificarse fácilmente, podría facilitar la determinación de una dosis óptima de R / NIR-LT para la reducción de especies reactivas de oxígeno(ROS) in vitro.

Luz no coherente Xenon se filtró a través de filtros de interferencia de banda estrecha para proporcionar longitudes de onda diferentes (longitudes de onda centrales de 440, 550, 670 y 810 nm) y flujos de energía (8,5 x 10 ^-3 a 3,8 x 10 ^-1 J / cm ²⁾ de la luz a las células cultivadas. La salida de luz del aparato se calibró para emitir dosis cuantales terapéuticamente relevantes, iguales de luz en cada longitud de onda. Se detectaron especies reactivas en glutamato destacó las células tratadas con la luz, utilizando DCFH-DA y H ₂ O ₂ tintes fluorescentes sensibles.

Nos éxito librados luz en una gama de longitudes de onda fisiológica y terapéuticamente e intensidades pertinentes, a las células cultivadas expuestas a glutamato como un modelo de lesión del SNC. Mientras que las fluencias de R / NIR-LT utilizados en el estudio actual no ejercer un efecto sobre ROS generado por las células cultivadas, el método de suministro de luz es aplicable a otros Systems incluyendo mitocondrias o más fisiológicamente modelos de cultivo rebanada organotípicos pertinentes aislado, y podría utilizarse para evaluar los efectos sobre una serie de medidas de resultado del metabolismo oxidativo.

Introducción

Se requieren especies reactivas de oxígeno (ROS) para una serie de vías de transducción de señales y reacciones normales del metabolismo celular, incluidos los de neuroprotección ^1. Sin embargo, cuando el mecanismo antioxidante endógeno no son capaces de controlar la producción de ROS, las células pueden sucumbir a estrés oxidativo ^2,3. Después de una lesión en el SNC, se cree que los aumentos asociados en la presencia de ROS y el estrés oxidativo a desempeñar un papel importante en la progresión del daño ^4,5. A pesar de la extensa serie de estrategias para atenuar el estrés oxidativo que se han evaluado, actualmente no existen estrat....

Protocolo

1. Calibración óptica: Medición de luz de salida

1. Para preparar el aparato de suministro de luz, conectar una fuente de luz de banda ancha (por ejemplo, xenón o lámpara de tungsteno) a una fuente de alimentación adecuada. Colocar una lente de colimación en frente de la fuente de luz para producir un haz de luz colimado. Pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz. Dependiendo de la aplicación, enfocar el haz colimado a la abertura de entrada de una guía de luz líquida, que proporciona para la entrega más flexible de la luz (por ejemplo., En una incubadora).
2. En el otro ....

Resultados

La salida de la luz entregada a una longitud de onda de 670 nm fue calibrado usando filtros de densidad neutra con el fin de irradiar las células con una gama de fluencias que abarcan una dosis de luz de 670 nm previamente demostrado ser beneficioso en vivo (0,3 J / cm ^{2) 20.} Como el número de filtros de densidad neutra en frente de la fuente de luz aumenta, la intensidad (W / m ²⁾ disminuyó, lo que permite menos luz para pasar a la zona objetivo. La Tabla 1 presenta los datos de calibraci.......

Discusión

Hemos adaptado con éxito un sistema de suministro de luz precisa y calibrado para proporcionar un mecanismo para el estudio de optimización de R / NIR-LT in vitro. Longitud de onda y la intensidad de los parámetros de R / NIR-LT son capaces de ser manipulado con precisión y eficacia el uso de este sistema. Hemos establecido que el tratamiento de luz de las células no dio lugar a la muerte celular, aunque ROS no se reduce a las longitudes de onda y las dosis entregadas, de los tipos celulares de la prueba. Las i.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo de ROS intracelular OxiSelect (fluorescencia verde)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reactivo	Sondas moleculares	A36006
Lámpara de arco de xenón de 300 vatios	Newport Corporation	6258	Fuente de luz muy intensa, no mire directamente a la lámpara. Asegúrese de que haya suficiente enfriamiento para la lámpara mientras está encendida
USB4000-FL Espectrómetro de fluorescencia	Ocean Optics
CC-3-UV Corrector de coseno para la recolección de emisiones	Ocean Optics
200μ Fibra óptica de cuarzo de diámetro m	Ocean Optics
SpectraSuite Plataforma de espectroscopía Ocean	Optics
2300 EnSpire Lector de placas multimodo	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Toxicidad aguda, use guantes cuando manipule.
Ácido L-glutámico hidrato de sal monosódica	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhidro)
Feocromocitoma Células de médula suprarrenal de rata (PC12)	Colección de cultivos tipo americano	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Medios de comunicación	Gibco	11875-119
Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen estadounidense	Gibco	10082-147	Cálido hasta 37 ° C en baño de agua antes de usar
Suero de caballo, origen neozelandés	Gibco	16050-122	Cálido a 37 ° C en baño de agua antes de usar
GlutaMAX Suplemento	Gibco	35050-061	Caliente hasta 37 ° C en baño de agua antes de usar
100 mM Piruvato de sodio	Gibco	11360-070	Caliente a 37 ° C en baño de agua antes de usar
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Caliente a 37 ° C en baño de agua antes
de usar 100X MEM Solución de aminoácidos no esenciales	Gibco	11140-050	Tibia a 37 & grados; C en baño de agua antes de usar
Células Retinal Muller (rMC1)	Universidad de California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Cálido a 37 ° C en baño maría antes de usar
75 cm2 Frascos	BD Biosciences	B4-BE-353136
Hidrobromuro de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Alícuota y almacenar a -20 ° C
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Gibco	14025-134	Tibia hasta 37 ° C en baño de agua antes
de usar solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010-049	Caliente a 37 & grados; C en baño maría antes de usar
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot y almacenar a -20 ° C
1X Medio Neurobasal	Gibco	21103-049	Cálido a 37 ° C en baño de agua antes de usar
Solución de Azul de Tripán, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cisteína	Sigma-Aldrich	W326305
Corning Placas de 96 pocillos, fondo transparente, negro	Corning	CLS3603-48EA
Costar Poliestireno transparente Placas de 96 pocillos sin tratar; Forma del pozo: Redondo; Estéril.	Costar	07-200-103
Balancín Balancín	Centrífuga
	de laboratorio
Papel de filtro de densidad neutra (0.3)	THORLABS Filtro de paso de banda de
442 nm	THORLABS	FL441.6-10
Filtro de paso de banda de 550 nm	THORLABS	FB550-10
Filtro de paso de banda de 670 nm	THORLABS	FB670-10
Filtro de paso de banda de 810 nm	THORLABS	FB810-10e
Desmontado y Oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,1)	THORLABS	NE01B
desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,2)	THORLABS	NE02B
desmontados y oblicuos; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,3)	THORLABS	NE03B
desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,5)	THORLABS	NE05B
desmontados y oslash; Filtros de densidad neutra absorbentes de 25 mm (0,6)	THORLABS	NE06B
desmontados y oslash; Filtros Absortivos de Densidad Neutra de 25 mm (1.0)	THORLABS	NE10B