Desarrollo de una In vitro Sistema modelo para estudiar la interacción de Equus Caballus IgE con su receptor de alta afinidad Fc RI

Summary

El presente estudio describe el desarrollo y las aplicaciones de un sistema de ensayo de ingeniería genética basado en la transfección de células de leucemia basófila de rata con el gen equino FcεRIα. Las células transfectadas expresan un receptor funcional donde la liberación de mediadores de la respuesta alérgica puede ser activada por IgE y antígeno.

Abstract

La interacción de IgE con su receptor Fc de alta afinidad (FcεRI) seguida de un desafío antigénico es la vía principal en las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Como consecuencia de la alta afinidad de unión entre IgE y FcεRI, junto con la producción continua de IgE por parte de los linfocitos B, las alergias suelen persistir durante toda la vida, sin que actualmente se disponga de una cura permanente. Los caballos, especialmente los caballos de carreras, que son comúnmente endogámicos, son una especie de mamíferos que son muy propensos al desarrollo de respuestas de hipersensibilidad, lo que puede afectar seriamente su rendimiento. Las respuestas fisiológicas a la sensibilización alérgica en caballos son similares a las observadas en humanos y perros. En este trabajo describimos el desarrollo de un sistema de ensayo in situ para la evaluación cuantitativa de la liberación de mediadores de la respuesta alérgica perteneciente al sistema equino. Con este fin, el gen que codifica el equino FcεRIα se transfectó y se expresó en la superficie de las células parentales de leucemia basófila de rata (RBL-2H3.1). El producto génico de la cadena α equina transfectada formó un complejo receptor funcional con las cadenas endógenas β y γ de rata ¹. El sistema de ensayo resultante facilitó la evaluación de la cantidad de mediador secretado por las células RBL-2H3.1 transfectadas con FcεRIα equino tras la sensibilización con IgE equina y la provocación antigénica utilizando la liberación de β-hexosaminidasa como lectura ^{2, 3}. La liberación del mediador alcanzó un máximo del 36,68% ± del 4,88% con 100 ng ^ml-1 de antígeno. Este ensayo fue modificado de los ensayos anteriores utilizados para estudiar las respuestas alérgicas humanas y caninas ^{4, 5}. También hemos demostrado que este tipo de sistema de ensayo tiene múltiples aplicaciones para el desarrollo de herramientas diagnósticas y la evaluación de la seguridad de posibles estrategias de intervención terapéutica en la enfermedad alérgica ^{6, 2, 3}.

Introduction

Alergia se conoce desde hace milenios. Un tratamiento del asma se describe en el texto médico egipcio antiguo conocido como el Papiro de Ebers (~ 1550 aC) y discutió los remedios herbales para tratarla ^7.

Hoy en día la alergia se clasifica como una respuesta de hipersensibilidad de tipo I, donde el tipo de células T helper 2 (TH ₂₎ el brazo del sistema inmunitario dirige la producción de inmunoglobulina E (IgE) anticuerpos en respuesta a antígenos ambientales llamadas alérgenos. Estos son diversas sustancias que comúnmente interactúan con las células del sistema inmunológico y estimulan la síntesis y secreción de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo la interleucina-4 e interleucina-13 ^{8, 9} como lo hacen las partículas en partículas de humo del cigarrillo o de escape diesel que potencian la síntesis de IgE ^10.

El aumento de las manifestaciones alérgicas en los países industrializados en los últimos 50 años se ha atribuido a una combinación del efecto decontaminantes del medio ambiente y una tendencia a un ambiente más saneado, que se combinan para cambiar la respuesta inmune hacia un perfil predominado por Th ₂ citoquinas, tal como propone la "hipótesis de la higiene" ^11.

Como se mencionó anteriormente, los seres humanos no son los únicos mamíferos afectados por la alergia. Cabe destacar que los caballos y los perros también pueden desarrollar respuestas alérgicas clásicas y un estudio de ¹² ha demostrado que, al igual que en los seres humanos, la alergia equina se atribuye a factores genéticos y ambientales. Como consecuencia, estos animales presentan buenos modelos para el estudio de la interacción entre las causas genéticas y ambientales de la alergia, su progresión desde la sensibilización a la enfermedad, y las posibles estrategias de intervención una vez que las manifestaciones clínicas se han fijado en

En 1887, Stömmer fue la primera persona en describir la similitud entre el ser humano y el asma equina ^13, el efecto de la histamina sobre el sistema cardiovascular equina esmuy similar a la de los seres humanos ^14. Los caballos son también la piedra angular de la industria de las carreras de caballos, que vale US $ 72 mil millones con un volumen de apuestas de US $ 115 mil millones al año ^15.

La mayoría de los caballos de carreras contemporáneos son descendientes del pequeño número de caballos árabes criados por Lady Anne Blunt a partir de 1878 en adelante. Caballos de carreras modernos están endogámicas comúnmente para seleccionar para capacidades de rendimiento. Son propensos a trastornos genéticos, uno de los cuales es su susceptibilidad a montar respuestas alérgicas. También tienen 1.000 veces más altos niveles de IgE en suero que incluso los seres humanos más gravemente alérgica ^16. Caballos en las respuestas alérgicas se manifiestan generalmente como hipersensibilidad a la picadura de insectos (IBH) ^{17, 18.} Resultados de IBH en la dermatitis debido a las picaduras de insectos forman en el género Culicoides. Otra forma de enfermedad alérgica de las vías respiratorias equina es obstrucciones recurrentes (RAO), esto se manifiesta en los pulmones y las vías respiratorias. Se caracteriza por sibilancias y laboratoriorespiración ORed. RAO ocurre comúnmente en respuesta a las esporas de moho, y los altos niveles de IgE alergeno-específica se han registrado en los caballos que sufren de RAO en un estudio ^{de 19} aunque otra investigación no ha confirmado ^20.

Estudios sobre la alergia equina giraban alrededor del intento de seguimiento y la neutralización de IgE equina mediante el desarrollo de anticuerpos monoclonales anti-IgE equina (mAbs) ^{21, 22.} Además, el estudio de ²³ discute la producción de los dominios extracelulares de α equino de alta afinidad Fc de receptor cadena (FcεRIα) receptor en un intento de detectar y cuantificar suero equino IgE. Un estudio relacionado por Ledin ²⁴ discute un nuevo enfoque destinado a neutralizar la IgE sérica cebando el sistema inmune utilizando un inmunógeno sí / no-yo. Todos estos estudios, sin embargo, carecían de un ensayo eficaz para probar la seguridad y eficacia de sus protocolos. En este artículo, presentamos ahora una sys tales ensayotem aplicable al estudio de las estrategias de diagnóstico y terapéuticas relevantes para el sistema equino, donde la liberación β-hexosaminidasa, como un indicador de la desgranulación de mediador celular, se evaluó en células RBL-2H3.1 que expresan equina FcεRIα. Este protocolo se basa en publicaciones anteriores ^{25, 4, 5, 2, 3} que describen la ingeniería de células RBL transfectadas con el gen que codifica el dominio de unión a IgE del receptor de alta afinidad para IgE de diferentes especies. El protocolo explica cómo realizar un ensayo de liberación de β-hexosaminidasa, cuyos resultados se presentan como la media ± desviación estándar de tres experimentos.

El ensayo de liberación se desarrolló por primera vez por Siraganian y el gancho ²⁵ para estudiar la alergia humana. El grupo de laboratorio dirigido por el Dr. Rubén Siraganian también desarrolló la línea celular RBL. Estas células RBL se desarrollaron para expresar la FcεRIα humana y el protocolo se publicó por ^4. La pieza finalel ensayo de vino con el desarrollo del plásmido pSV en el documento de Neuberger ²⁶ que describe la producción de un anticuerpos IgE mediante la clonación de su gen de la cadena pesada aguas abajo de un gen de ratón para una región variable de IgE que se dirige el hapteno 4-hidroxi-3 nitro-fenacetilo (NP), el anticuerpo quimérico resultante era completamente funcional. La capacidad para desarrollar cualquier IgE focalización el mismo hapteno, mientras que también la clonación de su receptor en la superficie de las células RBL dado lugar a la normalización del ensayo de lo que es un protocolo útil para medir la desgranulación de basófilos.

El ensayo tiene pros y contras. Los pros del ensayo es su adaptabilidad para ser utilizado en cualquier sistema de mamífero, nuestro laboratorio así lo ha utilizado para probar la degranulación en los sistemas humanos, caninos y equinos, y esto se puede lograr simplemente mediante la síntesis de IgE del organismo y la clonación de su receptor sobre la superficie de las células RBL.

Por otra parte,los contras del ensayo es que las células RBL son muy sensibles a los cambios térmicos, mecánicos y de pH, lo que les dan una variación de los niveles de desgranulación dentro del mismo ensayo. Por tanto, se recomienda encarecidamente que los ensayos siempre se repiten por triplicado y luego se toma una media de ellos. Además, las células RBL tienden a cambiar hacia un fenotipo no liberar si se dejan en cultivo de tejidos durante tiempos prolongados (> 10 semanas) ^27, por lo que su mantenimiento engorroso. También son propensos a las infecciones por bacterias de micoplasma, que no son visibles desde un microscopio de luz y no cambian la morfología de la célula, sino que cambiar drásticamente sus niveles de desgranulación. Por lo tanto se necesitan pruebas de micoplasma regulares.

Protocol

1) Preparación de la línea celular:

1. El desarrollo de la línea de células RBL-2H3.1 expresar equinos α Fc RI:
   1. El uso de las técnicas básicas de cultivo de tejidos para las líneas celulares en monocapa, transfectar células RBL-2H3.1 parentales utilizando el plásmido pEE6, que lleva el gen equino FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. Añadir 2 g l ^-1 del ADN del plásmido a 0,8 ml de células a una densidad de 1,2 x10 ⁷ células ml ^-1. Electroporar las células a 250 V 960 mF usando un electrocuvette 0,4 cm luego incubar inmediatamente en hielo durante 10 min.
   2. Seleccione las células transformadas utilizando medios que contienen 0,4 g de sulfato de geneticina G418, a continuación, ordenar las células vivas restantes mediante FACS etiquetándolos con un anticuerpo IgE fluorescente. Utilice la RBL-2H3.1 resultante expresar equina línea celular FcεRIα para la investigación ^{2, 3.}
2. Pre-ensayo de sensibilización de anticuerpos:
   1. -1 5 células.
   2. Añadir la IgE de interés para las células suspendidas a una concentración final de 1 ng ml ^-1, a continuación, la placa 100 l de células en una placa de 96 pocillos en las columnas 1-6 y se incuba a 37 ° C + 5% de CO ₂ + 90% de humedad relativa durante 16 horas. Después del tiempo de incubación, y antes de realizar el ensayo de liberación, compruebe los pozos bajo un microscopio para confluencia bien y la adhesión celular.

2) Ensayo de lanzamiento:

1. Lavar las células:
   1. Tampón de liberación de calentamiento (tubos de 25 mM, cloruro de sodio 120 mM, cloruro de potasio 5 mM, 0,04 mM de cloruro de magnesio y cloruro de calcio 1 mM) a 37 ° C para permitir el lavado de células suave.
   2. Lavar las células con un movimiento rápido de la placa para eliminar los medios de comunicación de células y añadiendo 100 l tibia, 37 ° C, tampón de liberación. Repita dos veces.
2. Desafío Antígeno:
   1. Preparar una serie de dilución de antígeno (NIP-HSA o DNP-HSA) de 0 ng ml ^-1, 0,1 ng ml ^-1, 1 ng ml ^-1, 10 ng ml ^-1, 100 ng ml ^-1, 1.000 ng ml ^-1, 10.000 ng ml ^-1 en tampón de liberación y caliente a 37 ° C.
   2. Después del segundo lavado celular, descartar los medios de comunicación y reemplazado con 100 l de las soluciones de antígeno. Asegúrese de que los pozos en la misma fila (A1-6 por ejemplo) tienen la misma concentración de antígeno añadido a ellos.
   3. Establecer un control negativo en la fila A, añadiendo 0 ng antígeno ^-1 ml. Añadir aumento de la concentración de antígeno por las filas (BG), seguido de triton-x tampón (5% de Triton X-100) en células H fila para lisar las células para ser utilizado como un control positivo. Se incuba a 37 ° C durante 20 minutos para permitir que las células liberen sus mediadores.
3. Configuración de los controles individuales así:
   1. Después de la incubación, transferir 50 l de sobrenadante celular a la otra mitad de la placa (pozos A1-6 a A7-12 pozos, etc.). Desechar los 50 l restantes de sobrenadante y reemplazar con 50 l de tampón de Triton-X para permitir la medición de la cantidad de mediadores liberados en cada pocillo en las columnas 7-12 como un porcentaje del total de los mediadores dentro de las células en la columna de 1-6 .
4. Sustrato de la enzima:
5. Añadir 50 l de sustrato β-hexosaminidasa (50 mM 4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida preparado en DMSO diluido a 2 mM mediante la adición a tampón citrato 0,2 M de ácido cítrico y acetato de sodio 0,2 M, pH 4,5) a todos los pocillos a facilitado la conversión del sustrato a 4-nitrofenol por la enzima β-hexosaminidasa. Las placas se incuban a 37 ° C durante 2 horas.

5. Terminación de la reacción:
   1. Detener la reacción por la adición de 150 l de tampón Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a cada pocillo como el alto pH del tampón se detiene la reacción y se convierte en la 4-nitrofenol en un color amarillo.
6. La lectura y el análisis de los resultados:
   1. Leer la placa usando un espectrofotómetro de placas a 405 nm para medir la absorbancia del color amarillo. Calculó el porcentaje de β-hexosaminidasa liberada usando la siguiente fórmula:

2. Aplicar esta fórmula para cada pozo, después de lo cual se toma un promedio para cada fila. A1 y A7 representan la ubicación de los pozos de la placa de 96 pocillos. Trazar la curva de porcentaje de liberación β-hexosaminidasa (que corresponde a la liberación total de mediador) against antígeno concentración ^{2, 3.}

Results

Los parentales células RBL-2H3.1 y las transfectadas con el gen del receptor FcεRIα equina fueron sensibilizados primero con IgE de ratón anti- DNP-HSA y desafiados con el antígeno DNP-HSA. IgE de ratón se une al receptor endógeno de rata en ambas líneas celulares y por lo tanto actúa como un control para comprobar la viabilidad liberación de ambas líneas celulares para liberar mediadores (Figura 1 A). Este es un control importante y debe llevarse a cabo desde rutinariamente sobre extendido (> 10 sem...

Discussion

En resumen, los resultados de esta investigación mostraron que cuando las células RBL-2H3.1 expresan FcεRIα equinos están sensibilizados con IgE equina y desafiados por un antígeno, que dan una liberación pico mediador de 36.68% ± 4.88% de la cantidad total de mediador dentro de la células, en comparación con el RBL-2H3.1 células parentales no expresan equina FcεRIα.

Así, este ensayo proporciona una herramienta útil para la investigación y el estudio de las respuestas alérgicas equinos i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expresando Fc&épsilon equino; RI&alfa;	-	-	Producido en el laboratorio
IgE equina anti NIP-HSA	-	-	Producido en el laboratorio
Placa de 96 pocillos	Sigma	CLS3595-Pipeta
multicanal Anachem		-	-
Incubadora	Galaxy R	-	-
4Hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacético	ácido Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH se conjugó con albúmina sérica humana para hacer NIP-HSA en el laboratorio
Dinitrofenilo conjugado con albúmina sérica humana	Sigma	A6661	DNP-HSA abreviado
	Anthos Labtec HT2	-	-
Tubos	Sigma	P1851-Cloruro
de sodio	Sigma	S7653-Cloruro
de potasio	Sigma	P9333-Cloruro
de magnesio	Sigma	M2670-Cloruro
de calcio	Sigma	C1016-Triton
x100	Sigma	X100-4-nitrofenil
N-acetil-β-D-glucosaminida	Sigma	N9376	La solución madre llamada sustrato β-hexosaminidasa fue preparada 50 mM en DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650-Ácido
Cítrico	Sigma		251275-Acetato de
Sodio	Sigma	S7670-Tris
	Sigma	T5941	-