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Artículo de método

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

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DOI:

10.3791/52224

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25 de septiembre de 2016

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1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

En este artículo

Resumen

La regulación de nutrientes mediante la alimentación ajustada al crecimiento continuo mejora las tasas de crecimiento de los esferoides de células de mamíferos en comparación con la alimentación intermitente por lotes para cultivos en biorreactores de suspensión agitada. Este estudio demuestra los métodos necesarios para establecer cultivos alimentados con tasa ajustada simple.

Resumen

En esta demostración, se cultivaron esferoides formados a partir de la línea celular de insulinoma β-TC6 como modelo de fabricación de un producto de células de islotes de mamíferos para demostrar cómo la regulación de los niveles de nutrientes puede mejorar el rendimiento celular. En estudios anteriores, los biorreactores facilitaron el aumento de los volúmenes de cultivo en comparación con los cultivos estáticos, pero no se observó un aumento en el rendimiento celular. Las limitaciones en nutrientes clave como la glucosa, que se consumieron entre las alimentaciones por lotes, pueden conducir a limitaciones en la expansión celular. Se observaron grandes fluctuaciones en los niveles de glucosa, a pesar del aumento de las concentraciones de glucosa en los medios. El uso de sistemas de alimentación continua eliminó las fluctuaciones en los niveles de glucosa y mejoró las tasas de crecimiento celular en comparación con los métodos de cultivo estáticos y SSB alimentados por lotes. Se observaron aumentos adicionales en las tasas de crecimiento al ajustar la tasa de alimentación en función del consumo de nutrientes calculado, lo que permitió el mantenimiento de la glucosa fisiológica durante tres semanas en cultivo. Este método también se puede adaptar para otros tipos de células.

Introducción

Con el fin de generar un gran número de células humanas viables y funcionales para el trasplante, la regulación de las condiciones de cultivo es imprescindible. El agotamiento de nutrientes, junto con la acumulación de residuos metabólicos son los principales contribuyentes a los cambios de senescencia y metabólicos que reducen la calidad del producto de células 1-3. Este procedimiento demuestra un método para células de mamíferos de cultivo en esferoides utilizando un biorreactor agitado en combinación con un sistema de alimentación de perfusión tasa ajustada para regular la glucosa en un rango fisiológico 4 durante toda la duración del cultivo. Para los fines de estos estudios, el intervalo fisiológico se definió como entre 100 y 200 mg / dl. Los mismos métodos se pueden utilizar para regular otros nutrientes y residuos metabólicos, tales como lactato.

cultivos estáticos en pequeños volúmenes (1 - 30 ml) se utilizan normalmente en el entorno de laboratorio para mantener y diferenciar líneas celulares para EXPERIMENTAL propósitos. pases de células se lleva a cabo con los cambios de medio completo, según sea necesario, a intervalos regulares. La mayor parte de medio de cultivo "convencional" tiene una alta concentración de glucosa (450 mg / dl en DMEM utilizado en estos estudios) para permitir cambios de medio de menos frecuentes, sin el riesgo de limitaciones de nutrientes. Sin embargo, este método por lotes de alimentación de aún requiere una manipulación frecuente, introduce variabilidad en el medio ambiente celular, y aumenta el riesgo de contaminación 5-9. Biorreactores suspensión agitada (SSB) proporcionan una mejor mezcla y la disminución de gastos de envío de 3,10 - 20, pero al igual que cultivos estáticos, requieren cambios manuales medianas que contribuyen a las fluctuaciones en los niveles potencialmente dañinos de productos de nutrientes y desechos. alimentación de la perfusión de las culturas SSB reduce estos problemas mediante la infusión continua y la eliminación del medio, pero los grandes cambios en los niveles de nutrientes debido al crecimiento de las células siguen siendo un problema. El uso de un RA de alimentación ajustadate de los cálculos de utilización de nutrientes sobre la base de los requisitos de células estimado puede proporcionar el entorno celular estable requerido para optimizar la viabilidad celular y la función 21 - 24.

Hay una gran cantidad de literatura que describe métodos para cultivos escalables SSB de células de mamíferos específicamente para el cultivo y expansión de células pluripotentes 25 - 32, con otros se centraron en las células de los islotes 17,33,34 (beta), o la producción de productos biológicos 24, 35-38. Muchos de estos tipos de células investigadas pueden crecer en cultivos de esferoides, y procedimientos específicos para el tipo de célula que se utiliza debe ser optimizado antes de implementar un sistema de alimentación continua. En esta demostración, se utilizó un método de alimentación de perfusión para expandir una línea de células beta crecido como esferoides en un biorreactor agitado 39-43. El método descrito en este documento proporciona unala aplicación directa de la alimentación de los ajustes del tipo basado en las mediciones de glucosa fuera de línea para lograr condiciones de cultivo específicas. Ajuste de la velocidad de alimentación con este método para mantener un nivel de glucosa fisiológica se muestra a los rendimientos celulares aumenta. Las células de mamíferos son dependientes de un nutriente clave, glucosa, para la producción de energía, por lo que el uso de esta línea celular representa un modelo para muchas células de mamífero en cultivo 44. Además, esta línea es un ejemplo de la mayor complejidad de las células beta, que son sensibles a los niveles crónicos elevados de glucosa 45. Para este estudio, se dejó que las células ß-TC6 para formar esferoides en cultivo para aproximar el tamaño medio de los islotes de Langerhans in vivo. El sistema de biorreactor de perfusión 17 - 19,21,46 con una velocidad de alimentación ajustada a la glucosa consumo, se tradujo en el mantenimiento de condiciones fisiológicas y los rendimientos celulares más altas sin cambios en la viabilidad.

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Protocolo

1. Línea celular y el mantenimiento

  1. Obtener células ß-TC6 (u otra línea celular de mamíferos adherentes deseada). En preparación para el estudio, la cultura, el paso, y criopreservar las células de acuerdo con las instrucciones del proveedor.

2. Montar el sistema de alimentación continua

NOTA: El diseño del sistema de alimentación continua en el método a continuación se basa en sistemas similares se describen en la literatura 17 - 19,21,47 - 49. Asamblea del sistema utilizado aquí se describe en detalle en una publicación anterior 3.

  1. Recoge los componentes necesarios para el sistema de alimentación que consta de cinco componentes principales: un contenedor de medios, la bomba peristáltica, de biorreactor agitado, depósito de residuos, y el conjunto de tubos / de muestreo de diseño personalizado.
    1. Establecer el depósito medio utilizando una botella de vidrio de 1 litro, el depósito de residuos utilizando una botella de vidrio de 2 litros, y el stirred biorreactor utilizando un reactor de vidrio de 250 ml de volumen (de la versión de la plataforma).
    2. Use una bomba peristáltica digital o bomba similar con un cabezal de la bomba de 8 canales para controlar el intercambio de soporte.
    3. Fabricación del depósito y tapas de biorreactor modificados de plástico duro y esterilizar en autoclave con tubo de acero inoxidable de paso a través de los puertos para proporcionar ventilación a través de filtros estériles, y permitir la transferencia de medio entre depósitos y biorreactores. Como alternativa, la compra de tapas especializadas con puertos de flujo de diferentes proveedores.
      NOTA: La tapa biorreactor puede contener puertos de paso a través adicionales para la instrumentación opcional y las sondas de monitoreo (por ejemplo, monitores de oxígeno).
    4. Adjuntar un tubo de salida (OT) fabricado a partir de tubos de aireación de vidrio poroso con un intervalo de tamaño medio de poro de 40 micras a 60 micras, y una densidad de poros de 40% a la tapa SSB modificado. Alternativamente, elegir otro tubo de salida sobre la base de los requisitos específicos de la cultura.
      NOTA: Elija elTamaño de poro OT para extirpar únicamente medio y los desechos celulares, dejando los agregados de células en cultivo (como se describe en la sección 6 y publicación 3 para más detalles).
  2. Montar juegos de tubos de perfusión en autoclave de fluoruro de polivinilideno (PVDF) conectores de tubo y tubería de la bomba peristáltica duradera. La longitud de la sección depende de la distancia entre los diferentes componentes.
    NOTA: Tenga especial cuidado al seleccionar la variedad de tubos para garantizar la durabilidad y fiabilidad para los experimentos a largo plazo.
  3. Montar el juego de tubos de tres partes: una línea de alimentación, una línea de residuos, y una línea de muestra.
    1. Montar la tubería de alimentación utilizando dos diámetros de tubería (L / S 14 y L / S 13). Utilice la L / S 14 para el tubo primario que cubrir la distancia desde el biorreactor al depósito de medio, e insertar una longitud corta de L / S 13 en el medio de la longitud de la tubería para la sección de la bomba utilizando los adaptadores de PVDF adecuadas.
    2. Use Standard PVDF Tubi manguera de púasadaptadores de NG para unir dos piezas de L S 14 tubos / a cada lado de la sección de la bomba más corto (S 13 / L) tubo.
      NOTA: Como alternativa, toda la longitud del tubo podría ser de menor diámetro L / S 13 tubos, y toda la longitud de la tubería podría ser reemplazada cuando la integridad de sección de la bomba está en cuestión.
  4. Montar la segunda sección de tubo para la eliminación de residuos mediante tubos de mayor diámetro (L / S 16) e insertar una sección corta de la L S 14 tubos / en el medio de la sección de bombeo. Esto se hace de la misma manera que la línea de alimentación de montaje usando adaptadores de manguera de púas-PVDF, o alternativamente usando una longitud continua del tamaño de la tubería de la bomba deseada, y la sustitución según sea necesario.
    NOTA: Si la misma bomba y la cabeza de la bomba se utilizan para el circuito de alimentación y el circuito de residuos, la sección de la bomba de las líneas de tubería de eliminación de desechos debe ser un diámetro mayor que la sección de la bomba de la línea de alimentación. Esto asegura que la velocidad de la bomba de eliminación es más rápida que la velocidad de alimentación, y evitará la potenteIal para grandes cambios en el volumen de cultivo, y reducir el riesgo de desbordamiento.
  5. Montar el componente final del conjunto de tubos: un conjunto de recogida de muestras.
    1. Este procedimiento describe una costumbre montado muestreo sistema portuario; alternativamente, un puerto de muestreo estéril se puede adquirir de varios fabricantes.
    2. Construir el conjunto de tres cortos (~ 6 cm) L S 14 longitudes / tubos conectados entre sí con un conector de PVDF de tipo T, y dos pequeñas abrazaderas de manguera en dos de las longitudes de los tubos.
    3. Adjuntar un filtro de gas estéril para el venteo de gas a una de las longitudes sujetos al suelo y el otro se utiliza para la conexión a una jeringuilla de muestreo estéril (filtros de gas estériles pueden necesitar ser añadido en una cabina de seguridad biológica después de la esterilización como muchos filtros estériles no están autoclavable).
    4. Conectar el tercero extremo a un conector de muestra de acero inoxidable adjunta en la tapa del biorreactor.
    5. Autoclave el conjunto de muestreo mientras está conectado al biorreactor antes de comenzarel experimento (ver paso 3).
    6. Utilice esta asamblea para recoger muestras estériles del biorreactor según sea necesario sin perturbar el proceso de alimentación continua.

3. Autoclave Todos los Materiales

  1. Preparar todos los componentes de biorreactores para la esterilización en autoclave.
  2. Recoger los componentes individuales para la esterilización. Medianas y residuos depósitos de agua (reunidos desde el paso 2.1.1), matraz de agitación de 250 ml (montado a partir de 2.1.1), necesarios tapas modificados (ensambladas a partir de 2.1.3), tubo de salida (descrito en 2.1.4), tres juegos de tubos ( montado en las secciones 2.2 through2.5), tubo de salida (según sea necesario para la alimentación continua).
    1. Montar matraz de agitación con todos los componentes y asegúrese de que el tubo de salida se une firmemente dentro del matraz de agitación (que se describe en la sección 2.1.4), y conecte el puerto personalizado montado muestreo (sección 2.5), u otro puerto de muestreo para la parte superior de la tapa .
    2. Envolver todo el conjunto matraz de agitación con automaterial de envoltura clave, y que indica autoclave cinta. Asegúrese de que el envoltorio hermético. NOTA: El papel de aluminio o material similar se pueden utilizar para cubrir los extremos individuales de cada puerto de acceso en la tapa del biorreactor para preservar la esterilidad del conector / termina cuando desenvolver y cuando no conectado a los juegos de tubos dentro de la incubadora.
    3. Montar las tapas modificadas de los embalses medianos y residuos y luego adjuntar a las respectivas botellas de vidrio. Cubrirlas usando papel de aluminio y autoclave indicando cinta.
    4. Individualmente envolver los juegos de tubos (sección 2.2 - 2.5) Factor con una envoltura de cinta de autoclave y para ayudar en el montaje final. El papel de aluminio o material similar se pueden utilizar para envolver los extremos individuales de cada juego de tubos para preservar la esterilidad del conector / termina cuando desenvolver.
    5. Autoclave todos los artículos envueltos utilizando un ciclo estándar de autoclave seco (por ejemplo, "Gravity" ajuste con ~ 15 psi a 121 ° C durante 30 minutos o más).
      NOTA: No conecte estérilfiltros antes de la esterilización en autoclave a menos que se confirma que es segura autoclave.

4. formación de esferoides

NOTA: Esta técnica es similar a los descritos en la literatura 17 - 19,21,50 - 52 para otros cultivos de células de mamíferos. Todos los procedimientos siguientes esterilización deben realizarse en una campana de flujo laminar y el uso de guantes estériles para mantener condiciones estériles para el cultivo de células.

  1. Para todas las condiciones, la cultura y expandir las células β-TC6 en cultivos adherentes estándar (descrito por el vendedor) hasta cantidades suficientes de células se obtienen a sembrar el número deseado de biorreactores.
    1. Montar el biorreactor alimentación continua con el tubo de flujo de salida como se muestra en la Figura 1 y descrito en la sección 2, y conectar el puerto de muestreo a la tapa de muestreo. NOTA: El tubo de salida y el muestreo de conjunto de puerto, debe añadirse a la bioreacto para la alimentación continua antes de la formación de esferoides, y debe ser levantado fuera del medio de cultivo hasta que se inicia la alimentación continua.
    2. Esterilizar el conjunto de SSB modificados por autoclave (descrito en la sección 3).
    3. Coloque rejillas de ventilación estériles (0,22 micras o más pequeñas filtros estériles) a las ubicaciones correspondientes de las tapas del matraz de agitación, y vasos medianos y residuos.
      NOTA: Esto es importante para evitar el bloqueo de vapor, y para permitir el intercambio de gases entre la incubadora (2 CO 5%) medio ambiente y el biorreactor. El intercambio de gases es necesaria para mantener el pH correcto cuando el uso de medios de bicarbonato tamponada.
  2. Recoger las células por tripsinización suave usando 0,25% (v w /) solución de tripsina EDTA 0,53 mM, a temperatura ambiente con la ayuda de agitación mecánica durante 2 - 3 minutos, y semilla en biorreactores a una densidad de aproximadamente 1,3 x 10 6 células / ml en 200 ml de medio de cultivo.
    1. Mueva frascos designados de la incubadora yen un gabinete de bioseguridad.
      Nota: Todos los cultivos celulares y manipulaciones deben realizarse en una cabina de Bio-seguridad utilizando una técnica estéril apropiada.
    2. Retire el medio de cultivo de los matraces mediante la aspiración.
    3. Lavar las células pipeteando 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (sin Ca ++ o Mg ++), en un matraz, y el aclarado a través de las células en la superficie, y luego aspirar el PBS.
    4. Añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA a cada matraz que será recogida (normalmente alrededor de 10x 175 cm 2 frascos T).
    5. Permiten que las células cosechadas incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 minutos en el gabinete de seguridad biológica.
    6. Agitar suavemente con la mano para aflojar las células de la superficie del matraz, y recoger las células mediante la adición de 6 ml de medio de cultivo (con suero) al matraz, y transferir las células a un tubo de 50 ml. Cuando uno 50 ml tubo está lleno, utilizar otro tubo de 50 ml hasta que todas las células necesarias se han recogido (aproximadamente será necesario un tubo de 50 ml por cada 5 matraces T-175recogido).
    7. Suavemente de centrífuga (aproximadamente 50 x gravedad) las suspensiones celulares recogidas para sedimentar las células.
    8. Aspirar el medio restante dejando intacto el pellet.
    9. Recoge todas las células en un único tubo de re-suspensión los gránulos en medio de cultivo (que contiene suero) usando una pipeta, y la transferencia de todas las pastillas en el mismo tubo.
    10. Contar la densidad de células usando un hemocitómetro estándar con tinción de azul de tripán como se ha descrito en la literatura 53.
    11. Añadir número deseado de células totales de SSB estéril para cada condición (1.3 x 10 6 células / ml fueron las densidades de células de partida específicas para esta demostración).
    12. Añadir medio (con la concentración de glucosa se desea, en este caso se utilizó los niveles de glucosa del medio dentro del intervalo fisiológico) para BLU utilizando una pipeta para alcanzar el volumen de cultivo total deseado (se utilizó 200 ml de volumen de cultivo para estos estudios).
      NOTA: Para estos alimentado continua SSB estudia el cu ltures se sembraron utilizando un "bajo en glucosa" versión modificada del medio de cultivo (100 mg / dl). Esto permitió que las culturas que comienzan a partir de la concentración de glucosa objetivo deseado en lugar de comenzar con una "alta glucosa" medio y esperar a que el consumo de glucosa para llevar los niveles de glucosa hacia abajo en el rango fisiológico para iniciar la alimentación. Todo otro medio para la alimentación en estos estudios utiliza el estándar de "alto-glucosa" medio (500 mg / dl).
    13. Mueva SSB con las células a una placa de agitación dentro de una incubadora de cultivo celular.
  3. Células de cultivo en los biorreactores sin alimentación durante 3 días a 37 ° C, con un 5% de CO 2, el 100% de humedad relativa, y una velocidad de agitación de 70 rpm para permitir que se formen esferoides.
    NOTA: No proliferación significativa debe ser observada durante el período de formación de esferoides de tres días.
  4. Después de la formación de esferoides, esferoides dividir entre biorreactores con condiciones de cultivo deseadas.
Le "> 5. Cultura alimentación continua y ajustado Velocidad de alimentación

  1. Autoclave ni esterilizar el gas todos los componentes, y reunir en una cabina de seguridad biológica usando técnicas estériles (los pasos 2 - 4).
  2. Después de la formación de esferoides, retire el SSB de la incubadora y ensamblar los componentes para el sistema de alimentación continua en una cabina de seguridad biológica.
    1. En primer lugar llenar el depósito de medio fresco con el medio de cultivo deseada, y luego conectarse a un lado de la línea de alimentación. También asegúrese de que el depósito de medio fresco tiene una ventilación adecuada con un filtro estéril.
    2. Conectar un lado de la línea de alimentación al puerto de entrada de la alimentación en el biorreactor de una manera estéril. Un filtro estéril debe ser instalado entre la línea de alimentación y el puerto de entrada biorreactor para filtrar el medio antes de que entre en el biorreactor.
    3. Conectar la línea de desechos al tubo de salida del biorreactor y el depósito de residuos medio, y asegúrese de que el depósito de residuos tiene una ventilación adecuada con un sterilfiltro e.
  3. Mover el conjunto fuera de la cabina de seguridad biológica (esto probablemente requerirá dos personas para llevar a todos los vasos y tubos), y poner todos los componentes fuera para el cultivo a largo plazo.
    1. Ponga la SSB en la placa de agitación en el interior de la incubadora con los mismos parámetros de cultivo para la formación de esferoides (37 ° C, 5% de CO 2, 100% de humedad y 70 rpm). NOTA: Puede ser necesario desconectar temporalmente los segmentos de tubo de la bioreactor si las líneas tienen que correr a través de agujeros en el lado de la incubadora en lugar de a través de la junta en la puerta. Esto se puede hacer de una manera aséptica envolviendo los extremos de los juegos de tubos con papel de aluminio antes de la esterilización en autoclave (paso 3), y esperando para unir el lado biorreactor de las secciones de alimentación y del tubo de residuos hasta que el biorreactor está dentro de la incubadora. Las líneas de tubo se pueden poner en su lugar, y la lámina de aluminio se pueden retirar dentro de la incubadora y rápidamente se adjuntan al biorreactor.
    2. Ejecutar extremos restantes de juegos de tubos (los que no están conectados a la tapa biorreactor) a través del puerto de acceso incubadora (pass-through), o por medio de una muesca en la junta de la puerta de la incubadora.
    3. Fuera de la incubadora (en una cabina de bioseguridad cerca si es posible), conectar rápidamente la línea de alimentación al depósito de medio fresco, y la línea de los residuos al depósito de residuos medio, y asegúrese de que el depósito de residuos tiene una ventilación adecuada con un filtro estéril. NOTA: Para hacer esto de una manera aséptica, retire el papel de aluminio a partir de los conectores de tubos y de los vasos y se conectan a los vasos respectivos tan pronto como sea posible (especialmente si esta conexión hay que hacer fuera de la cabina de bioseguridad).
    4. Ponga depósito de medio fresco (lleno de medio de alimentación deseada) en el interior cerca del mini-refrigerador. Compruebe que las líneas de alimentación y de desecho son capaces de salir de la incubadora y entrar en el refrigerador sin impedir las puertas de cada cierre. También es fundamental que la alimentación lines no queden atrapados por las puertas cerradas de el refrigerador o la incubadora.
      NOTA: El medio utilizado para estos estudios fue el medio de cultivo de alto estándar de glucosa (500 mg / dl) recomendado por el proveedor para este tipo de células. Cualquier medio-alto de glucosa podría ser utilizado en función de las necesidades específicas del tipo de célula que se está cultivando. La concentración de glucosa del medio de alimentación debe ser razonablemente alta (2x o más) que la concentración deseada en el cultivo como el sistema de alimentación se basa en el aumento de la velocidad de alimentación de medio de alto contenido de glucosa para mantener niveles adecuados de glucosa en los cultivos mientras se mantiene velocidades de alimentación razonables .
    5. A continuación, el contenedor de medios de residuos se puede poner en la mesa de trabajo fuera de la incubadora en un lugar conveniente.
    6. A continuación, coloque la "sección de la bomba" de las líneas de alimentación y de residuos en el cabezal de la bomba garantizar la orientación adecuada para que las líneas de alimentación bombearán medio desde el depósito de medio fresco en el SSB, y las líneas de residuosbombeará medio de la SSB y al depósito de medio de residuos.
  4. Encienda la bomba a la velocidad de avance deseada.
    1. Calcular la velocidad de alimentación utilizando la ecuación de velocidad de alimentación ajustada descrito en la literatura 3 y en la sección de resultados representativos se proporciona a continuación.
    2. Utilice la información más reciente recuento de células (procedimiento descrito en el paso 5), junto con la predicción de crecimiento, y las mediciones de glucosa del medio para estimar la velocidad de alimentación necesaria para mantener la concentración de glucosa en la cultura deseada.
      NOTA: Las velocidades de crecimiento celular y las tasas de consumo de glucosa tendrán que ser obtenido antes de hacer estos procedimientos.
    3. Ajuste la velocidad de la bomba en base a la velocidad de avance calculada.
  5. Repetir el cálculo de la tasa de alimentación y ajustar la velocidad de la bomba para cada punto de muestreo (cada tres días por el método descrito).

6. recuento de células, viabilidad, y Medidas de concentración de glucosa

  1. Recoger muestras de cada biorreactor cada tres días, o como se desee.
  2. Tomar muestras de cultivo a partir de cultivos de SSB alimentados de forma continua utilizando el puerto de muestreo especializada se ha descrito anteriormente.
    1. Al salir de la SSB alimentada continuamente dentro del biorreactor, conecte una jeringa estéril (una jeringa de 5 ml de volumen se utilizó para estos estudios) para la conexión no-filtrada del puerto de muestreo.
    2. Mueva el tubo de muestreo hacia abajo en el medio de cultivo.
    3. Desembridar la sección del tubo que va a la jeringa, y extraer el volumen total de la muestra deseada.
    4. Mover el tubo de muestreo de modo que ya no se sumerge en la cultura, y continuar a retirar la jeringa hasta que se elimine el aire.
    5. Sujetar el tubo que alimenta la jeringa, y separar la jeringa que contiene la muestra, y dejar de lado.
    6. Pre-cargar una segunda jeringa estéril fresco con el aire, y se unen a la parte de filtro estéril del puerto de muestreo.
    7. Abra la pinza del tubo que va hacia el lado jeringa de filtro deel puerto de muestreo, y luego purgar el puerto de muestreo al expulsar suavemente el aire de la jeringa a través del filtro estéril. Esto asegura que el puerto de muestreo esté libre de cualquier medio residual.
    8. Vuelva a sujetar el tubo que va al filtro, desconecte la jeringa estéril y desprenderse de ella.
  3. Tomar la jeringa que contiene la muestra de células a partir del cultivo, y expulsarlo en un tubo de 10 ml. Submuestras de volúmenes conocidos pueden ser tomadas directamente de este tubo.
  4. Para el recuento de células, eliminar un volumen conocido de las células y transferir a un tubo de microcentrífuga, y se centrifuga suavemente durante 1 - 2 min (aproximadamente 50 x gravedad).
  5. Transferir el sobrenadante a un tubo separado para las mediciones de glucosa, y volver a suspender el sedimento con el mismo volumen de solución de tripsina-EDTA (0,25% (v) de tripsina / w, EDTA 0,53 mM), y contar por triplicado utilizando un hemocitómetro estándar con tinción con azul tripán como se ha descrito en la literatura 53.
    1. Añadir medio (con suero) ala muestra para la dilución según sea necesario.
    2. Contar las células y calcular la viabilidad celular mediante el registro de células vivas (no teñidas), y las células muertas (teñido) de forma independiente (viabilidad% = células vivas / células totales).
  6. Medir los niveles de glucosa del medio, por triplicado, utilizando un medidor de glucosa en sangre y de un solo uso tiras reactivas.
    1. Tomar mediciones de glucosa como se describe en las instrucciones del medidor de glucosa en sustitución del medio de cultivo para sangre.
    2. Sumergir la tira reactiva en el medio a ensayar (recogida de muestras de recuento por encima), y repita para el número deseado de repeticiones (se recomiendan tres repeticiones).
    3. Pon a prueba tanto el medio fresco y medio de residuos para las concentraciones de glucosa.
      NOTA: Para algunos metros, mediciones inferiores a 20 mg / dl (umbral detectable del metro), se puede observar como un error en la salida del medidor.

7. Medidas Asentamiento tarifas Esferoide

  1. Para asegurarse de que el cell agrupaciones no están siendo eliminados por el sistema de alimentación continua, medir la velocidad de sedimentación de esferoides ß-TC6 observando su sedimentación en una gran pipeta de plástico de diámetro.
  2. células de cultivo de ß-TC6 en biorreactores SSB para formar esferoides como se describe anteriormente.
  3. Después de 3 días de cultivo, tomar muestras de 30 ml de la suspensión esferoide y colocar en un tubo de 50 ml.
  4. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo utilizando una amplia pipeta de diámetro 25 ml para distribuir uniformemente en suspensión, y luego se detiene de pipeteado con la suspensión a un nivel conocido en la pipeta (por ejemplo, 20 ml marca), y luego registrar el tiempo para todos los esferoides de conformarse con 5 cm.
  5. Repita este procedimiento las veces suficientes para alcanzar confianza estadística (normalmente n> 3).
    NOTA: Para los estudios biológicos, un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa al comparar las mediciones. Se utilizó el error estándar de la media de los errores de información, y los dos de cola de prueba de t de Student no-emparejadose utilizó para comparar las condiciones de los datos presentados.

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Resultados

Niveles de glucosa del medio y las fluctuaciones de restringir la expansión de la célula en la norma SSB culturas

Los niveles de glucosa fluctúan en cultivos estáticos y culturas SSB durante todo el periodo de cultivo de 3. Estas fluctuaciones se intensifican a medida que aumenta el número de células durante el periodo de cultivo de 21 días y fueron casi idénticos en ambos cultivos estáticos y SSB. Estas observaciones se presentan en nuestra publicación anterior <...

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Discusión

Generación de productos de células de mamíferos para la producción de agentes biológicos y para las terapias con células requiere la cultura y el seguimiento de las células de mamífero en gran escala 55-58. Además, estas aplicaciones requieren condiciones de cultivo definidas y validadas. Simplemente aumentando el volumen de las células utilizando tecnologías de investigación no va a cumplir con todos estos requisitos. cambios de medio manuales que causan fluctuaciones en nutrientes y la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Michael Garwood y Sam Stein por sus útiles comentarios, y a Kristen M. Maynard por su ayuda con la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
β Células TC-6ATCC, Manassas, VACRL-11506Línea celular de insulinoma de ratón (tipo de célula adherente)
DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CAConsulte a continuación los números de producto 
DMEM Alta glucosa (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM baja glucosa (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note que este medio ya contiene piruvato)
L-glutamineInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=producto-de-búsqueda
Piruvato de sodioInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
Heat Inactivated PorcineSerum Gibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
T-150 Matraces tratados con cultivo de tejidosCorning, Corning, NY430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Ciencias de la vida)
& categoryname=
NuAire Incubadora de cultivos celularesPrinceton, MNUS Autoflow. Se puede utilizar cualquier incubadora de cultivo celular reguladora de CO2 con camisa de agua.
CentrífugaSorvall RT 7 (Se puede utilizar cualquier centrífuga de sobremesa similar)
RefrigeradorSe puede utilizar cualquier refrigerador de laboratorio (se utilizó una versión pequeña de mesa para estos estudios)
1 L Botella de vidrioCorning, Corning, NY1395-1LSe puede utilizar cualquier proveedor. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Ciencias de la vida)
& categoryname=
Botella de vidrio de 2 L Corning, Corning, NY1395-2LCualquier proveedor podría utilizar
250 ml de biorreactores agitados Corning, Corning, NY4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Ciencias de la vida)
& categoryname=
Placa de agitaciónFisher Scientific11-496-104ASe puede utilizar cualquier placa de agitación segura para incubadora, cualquier proveedor
de placas de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetroNunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)1256598 Se puede utilizar cualquier proveedor (pedido a través de Fisher Sci)
FALCON 50 ml Tubos CónicosFalcon, San José, CA1256598Se puede utilizar cualquier proveedor
Delran Plástico utilizado para piezas personalizadasMcMaster CarrVariosSe puede utilizar cualquier material de elección, pero se elige Deran porque es seguro para autoclave, no reactivo y fácil de mecanizar. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Tubo de acero inoxidable para tapas personalizadasMcMaster CarrVariosSe puede utilizar cualquier proveedor. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Tapas de biorreactores Delran modificadas a medida para alimentación continuaHechoNo conozco ningún proveedor que produzca un producto similar
Tapas de botellas de vidrio modificadas a medida para alimentación continuaHechoAlgunos proveedores (e.g., Fischer Sci, Corning) fabrican productos similares en los enlaces a continuación.
Bomba peristáltica digital Masterflex ColeParmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Se puede utilizar cualquier bomba peristáltica de precisión. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
Cartridge_Pump_System_115_230
_VAC/EW-77919-25
Conectores de tubería de PVDF (varios)Cole Parmer, Vernon Hills, ILver enlaceSe puede utilizar cualquier proveedor. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
_Luer_Fittings/55889
Tubería BPT de Pistón L / S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16Se puede utilizar cualquier proveedor. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-16
Tubería BPT de Cáñamo L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Se puede utilizar cualquier proveedor. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/WU-06508-14
Tubería BPT de Pistón Laminado L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Se puede utilizar cualquier proveedor. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
_L_S_13_25/ WU-06508-13
Millipore Millex GP MEMBRANA PES 0.22 µ l filtro de jeringa estéril (utilizado para ventilación y filtración media)Fisher ScientificSLGP033RSSe puede utilizar cualquier proveedor Pipeta
graduada de 25 mlFisher Scientific13-678-11Se puede utilizar cualquier proveedor, y se pueden utilizar varios tamaños
PipetaFisher Scientific13-681-15ESe puede utilizar cualquier proveedor o producto similar
HemocitómetroFisher Scientific02-671-6Se puede utilizar cualquier proveedor, o producto similar
Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061Se puede utilizar cualquier proveedor, o producto similar. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
Microscopio de luz invertidaLeicaSe puede utilizar cualquier proveedor o producto similar
Medidor de glucosa en sangre One Touch Ultra FisherScientific22-029-293Se puede utilizar cualquier proveedor o producto similar (p. ej., Bayer)
One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 Se puede utilizar cualquier proveedor o producto similar (p. ej., Bayer)
a medida a medida

Referencias

  1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
  2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
  3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
  4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
  5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
  6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
  7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
  8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
  9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
  10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
  11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
  12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
  13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
  14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
  15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
  17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
  18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
  19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
  20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
  21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
  22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
  23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
  24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
  25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
  26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
  27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
  28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
  30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
  31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
  33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
  34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
  35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
  36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
  37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
  38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
  39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
  40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
  42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
  43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
  46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
  47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
  48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
  49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
  50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
  51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
  52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
  53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
  54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
  55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
  56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
  57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
  58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
  59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
  60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
  61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
  62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
  63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

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