Aquí se presenta un protocolo para analizar las interacciones RNA / proteína. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se basa en la migración diferencial de los complejos de ARN / proteína y ARN libre durante la electroforesis en gel nativo. Mediante el uso de una sonda de RNA radiomarcada, complejos / proteína de ARN pueden ser visualizados por autorradiografía.
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Artículo de método
La movilidad electroforética cambio de ensayo (EMSA) para el estudio de las interacciones RNA-proteína: El IRE / IRP Ejemplo
En este artículo
Resumen
Resumen
Interacciones RNA / proteína son críticos para las vías de regulación post-transcripcional. Entre las proteínas de unión al ARN citosólicos mejor caracterizados son proteínas reguladoras del hierro, IRP1 y IRP2. Se unen al hierro elementos de respuesta (IRES) dentro de las regiones no traducidas (UTRs) de varios mRNAs objetivo, controlando así la traducción o la estabilidad ARNm. Interacciones IRE / IRP han sido ampliamente estudiados por la EMSA. Aquí se describe el protocolo de EMSA para analizar la actividad de unión a IRE de IRP1 y IRP2, que se puede generalizar para evaluar la actividad de otras proteínas de unión al ARN también. Un lisado de proteína cruda que contiene una proteína de unión al ARN, o una preparación purificada de esta proteína, se incuba con un exceso de 32 sonda de ARN marcado con P, lo que permite la formación de complejos. La heparina se añade para impedir la proteína no específica a la unión de la sonda. Posteriormente, la mezcla se analizó por electroforesis no desnaturalizante en gel de poliacrilamida. La sonda libremigra rápido, mientras que el ARN / proteína exposiciones complejas movilidad retrasados; por lo tanto, el procedimiento se denomina también "retardo en gel" o ensayo "bandshift". Después de la finalización de la electroforesis, el gel se seca y complejos de ARN / proteína, así como sonda libre, se detectan por autorradiografía. El objetivo general del protocolo es detectar y cuantificar IRE / IRP y otras interacciones RNA / proteína. Por otra parte, EMSA también se puede utilizar para determinar la especificidad, afinidad de unión, y la estequiometría de la interacción de ARN / proteína bajo investigación.
Introducción
La EMSA se desarrolló originalmente para estudiar la asociación de las proteínas de unión al ADN con secuencias de ADN diana 1,2. El principio es similar para las interacciones RNA / proteína 3, que es el foco de este artículo. Brevemente, el ARN está cargado negativamente y migrará hacia el ánodo durante la electroforesis no desnaturalizante de poliacrilamida en (o agarosa) geles. La migración dentro del gel depende del tamaño de la ARN, que es proporcional a su carga. La unión específica de una proteína de ARN altera su movilidad, y los complejos migra más lento en comparación con el RNA libre. Esto se debe principalmente a un aumento en la ma....
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Protocolo
Los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill (protocolo 4966).
1. Preparación de extractos de proteínas de las células cultivadas
- Lavar las células cultivadas dos veces con 10 ml de fosfato enfriada con hielo de solución salina tamponada (PBS).
- Raspe células adherentes ya sea con una goma de policía o un raspador de células de plástico en 1 ml de suspensión de PBS, la transferencia enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Girar en una microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS.
- Añadi....
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Resultados
Una sonda IRE radiomarcado se prepara, como se describe en las secciones 3 y 4 del protocolo. La secuencia de la sonda era 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; los nucleótidos en negrita representan un residuo C desapareado y el bucle, que son características críticas de IRE. La radiactividad específica de la sonda fue de 4,5 x 10 9 cpm / g de ARN.
Para evaluar los efectos de las perturbaciones de hierro sobr.......
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Discusión
En este documento, se describe un protocolo que se ha desarrollado para estudiar las actividades IRE-unión de IRP1 y IRP2, y mostramos datos representativos. Mediante el uso de diferentes sondas, este protocolo también se puede ajustar para el estudio de otras proteínas de unión al ARN. Un paso crítico es el tamaño de la sonda. El uso de sondas largas, que es común cuando el sitio de unión exacto es desconocido, puede dar lugar a complejos de ARN / proteína que no migran de manera diferente que el ARN libre. En este cas.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Canadienses para la Investigación en Salud (MOP-86514).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| leupeptina | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Ensayo de proteínas | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 ARN polimerasa | Thermoscientific | EPO111 | |
| Inhibidor de RNasa | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alfa-32P] | Perkin-Elmer | ||
| Líquido de centelleo | Beckman Coulter | 141349 | |
| heparina | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Nombre del equipo | |||
| Ruptor de tejidos | Qiagen | 9001271 | |
| Contador de centelleo | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 peines de pocillos | BIORAD | 165-1868 | 1,5 mm de espesor |
| Espaciadores de 1,5 mm | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Referencias
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
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Reimpresiones y permisos
