Artículo de método

Citometría de Flujo Protocolos de superficie y intracelular de antígenos Los análisis de los tipos de células neuronales

DOI:

10.3791/52241

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18 de diciembre de 2014

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1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

En este artículo

Resumen

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Proporcionamos una descripción detallada de un protocolo para el análisis de citometría de flujo de antígenos de superficie y/o antígenos intracelulares en tipos de células neuronales. Se explican los aspectos críticos de la planificación experimental, los procedimientos metodológicos paso a paso y los principios fundamentales de la citometría de flujo para permitir a los neurobiólogos explotar esta poderosa tecnología.

Resumen

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La citometría de flujo se ha utilizado ampliamente para definir poblaciones celulares en inmunología, hematología y oncología. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los protocolos para el análisis citométrico de flujo del grupo de antígenos de superficie de diferenciación (CD) y antígenos intracelulares en tipos de células neuronales. Nuestra descripción paso a paso de los procedimientos metodológicos incluye: la recolección de cultivos neuronales in vitro, un paso opcional de marcaje con éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE), seguido de la tinción de antígenos de superficie con anticuerpos CD conjugados (p. ej., CD24, CD54), y la posterior detección de antígenos intrasótanos a través de anticuerpos primarios/secundarios o fragmentos Fab marcados con fluorescencia (marcaje Zenon). El video muestra los pasos más críticos. Además, se explican brevemente los principios de la planificación experimental, la inclusión de controles críticos y los fundamentos del análisis de citometría de flujo (identificación de la población objetivo y exclusión de residuos; estrategia de compuertas; compensación de la superposición espectral) para permitir a los neurobiólogos con conocimientos previos limitados o formación específica en citometría de flujo evaluar su utilidad y explotar mejor esta poderosa metodología.

Introducción

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La citometría de flujo se ha explotado ampliamente en la inmunología, hematología y oncología para definir poblaciones de células a través de las propiedades intrínsecas de dispersión, antígeno de superficie de la célula de expresión, y otros parámetros de fluorescencia 1-3. Nuestros conocimientos sobre el desarrollo linaje de sangre y la enfermedad son el resultado de un grado significativo de el refinamiento continuo de esta metodología después de su aplicación inicial de 4,5. Una mayor conciencia del potencial analítico cuantitativo y global de citometría de flujo ha animado recientemente su uso más generalizado en la investigación con célula....

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Protocolo

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1. Neural cosecha celular

  1. Evaluación por microscopio:
    1. Antes de iniciar un experimento, comprobar el estado de la cultura con la de campo claro o microscopía de contraste de fase.
      NOTA: Mientras que el tejido neural primaria obtenida de disecciones es, en principio, igualmente susceptibles de análisis de citometría de flujo 14,28, por favor, tenga en cuenta que el enfoque del protocolo está en las células obtenidas de los sistemas de células neurales in vitro.
  2. Recolección de las células 7:
    1. Lave suavemente el plato / recipiente con células adherentes con Mg 2 + / Ca 2+<....

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Resultados

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El protocolo que aquí se presenta permite enfoques versátil experimentales (Figura 2). En su versión más corta (pasos 1, 3 y 6), que puede considerarse una guía para la tinción simple de los antígenos de superficie. En su forma más compleja, una serie de paradigmas co-etiquetado con una gama de antígenos intracelulares puede ser perseguido (pasos opcionales 2 y / o 4 a 5). Por otra parte, el paso CFSE e.......

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Discusión

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El protocolo presentado aquí está bien establecido para los cultivos de células neurales derivadas de células madre humanas, pero se puede aplicar igualmente a otras fuentes de células neuronales incluyendo tejido primario o líneas celulares neuronales. Además de las fuentes embrionarias, las células madre o progenitoras neurales pueden ser extraídos de las regiones neurogénicas de cerebro adulto de 27. Además, la citometría de flujo FACS y se pueden explotar para cuantificar, analizar y aislar diversas pobla.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener posibles conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Nuestro programa de investigación está financiado a través del Programa Emmy Noether de la Fundación Alemana de Investigación (DFG), subvención PR1132/3-1. Se agradece el apoyo adicional de la Fundación Müller-Fahnenberg de la Universidad de Friburgo. Este estudio fue apoyado en parte por la Iniciativa de Excelencia de la Fundación Alemana de Investigación (GSC-4, Spemann Graduate School).

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Materiales

figure-materials-27 eBioscience 17-0247-42 Dilución de trabajo 1:50 figure-materials-28 eBioscience 12-0549-42 Dilución de trabajo 1:50 Anticuerpo policlonal neuronal de clase III β-tubulina (Tuj1)figure-materials-29 Covance PRB-435P Dilución de trabajo 1:2.000 Alexa Fluor 488 figure-materials-31 Life Technologies Z-25342 Neubauer-Cámara de conteo mejoradafigure-materials-32 Marienfeld 0640010 Vortexfigure-materials-35 Becton Dickinson (BD)653118 Microcentrífuga refrigerada, PerfectSpin 24

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12)figure-materials-1 Life Technologies11330057
DPBS sin Ca2+ Mg2+figure-materials-2 Life Technologies
Suero fetal bovino, calificado, aprobado por la UE, origen de América del Sur (FBS)figure-materials-3 Life Technologies10270-106
MEM Aminoácidos no esenciales (100x)figure-materials-4 Life Technologies11140035
TrypLE Expressfigure-materials-5 Life Technologies12604013
solución de azul de tripano, 0.4%figure-materials-6 Life Technologies15250061
Paraformaldehídofigure-materials-7 Carl Roth335.3
Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción Vfigure-materials-8 Laboratorios PAA, CoelbeK41-001
Tween-20 Detergentefigure-materials-9 Calbiochem655205
Éster succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE)figure-materials-10 eBioscience65-0850-84
DMSOfigure-materials-11 AppliChemA1584
Filtros de tapa de botella express plus 0.22 µ m, 250 mlfigure-materials-12 MilliporeSCGPU02RE
Matraces tratados con cultivo celular (T 25)figure-materials-13 NUNC156367
Matraces tratados con cultivo celular (T 75)figure-materials-14 NUNC
Tubos cónicos (15 ml)figure-materials-15 Greiner Bio-One188271
Tubos cónicos (50 ml)figure-materials-16 Greiner Bio-One227261
Pipeta Pasteur, vidrio (150 mm)figure-materials-17 STEIN Labortechnik, Remchingen
Puntas de pipeta (0,1-10 y micro; l)figure-materials-18 Puntas de pipeta Corning4125
(1-200 µ l)figure-materials-19 Puntas de pipeta Corning4126
(100-1000 µ l)figure-materials-20 Corning4129
Pipetas serológicas, 5 mlfigure-materials-21 Corning4051
Pipetas serológicas, 10 mlfigure-materials-22 Corning4101
Pipetas serológicas, 25 mlfigure-materials-23 Tubos de4251
(0,5 ml)figure-materials-24 Sarstedt72.699
Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)figure-materials-25 Greiner Bio-One616201
Tubos de microcentrífuga (2.0 ml)figure-materials-26 Sarstedt72,695,500
Anticuerpo monoclonal antihumano CD24 APC
Anticuerpo monoclonal antihumano CD54 PE
Burro anti Conejofigure-materials-30 Life TechnologiesA21206Dilución de trabajo 1:2.000
Zenon® Kit de marcaje de fluoresceína IgG para conejos
figure-materials-33 Industrias CientíficasG560E
Thermomixer comfortfigure-materials-34 CitómetrodeEppendorf 5355 000.001
Accuri C6
Rfigure-materials-36 Peqlab91-PSPIN-24R
Agitador orbital, Unimax 1010figure-materials-37 Heidolph543-12310-00
Centrífuga refrigerada, Rotanta 96 RCa href="http://www.hettichlab.com" target="_blank">figure-materials-38 Hettich4480-50
Cabina de seguridad biológica Clase II Safe 2020figure-materials-39 Thermo Scientific51026640
CO2 Incubadora, Heracell 240ifigure-materials-40 Thermo Scientific51026331
Sistema de vacío, Vacusafe comfortfigure-materials-41 Microscopio Integra Biosciences158320
, Axiovert 40 CFLfigure-materials-42 Zeiss451212
Controlador de pipetas, accu-jet profigure-materials-43 Marca26303
Micropipeta, Pipetman neo P20N (2-20 y micro; l)figure-materials-44 GilsonF144563
Micropipeta, Pipetman neo P200N (20-200 µ l)figure-materials-45 GilsonF144565
Micropipeta, Pipetman neo P1000N (100-1000 µ l)figure-materials-46 GilsonF144566
14190169 156499S03710150 microcentrífuga Corning flujo <

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. <....

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Etiquetas

Flow CytometrySurface AntigensIntracellular AntigensNeural Cell TypesCFSE LabelingAntibody StainingCell HarvestingFlow BufferCentrifugationGating Strategy

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