Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Resumen

Este estudio describe una plataforma experimental para caracterizar rápidamente células madre modificadas y sus comportamientos antes de su aplicación en estudios de trasplante in vivo a largo plazo para el rescate y reparación del sistema nervioso.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSCs) derivadas de la médula ósea son un poderoso recurso celular y se han utilizado en numerosos estudios como posibles candidatas para desarrollar estrategias para el tratamiento de una variedad de enfermedades. El propósito de este estudio fue desarrollar y caracterizar las MSCs como vehículos celulares diseñados para la administración de factores terapéuticos como parte de una estrategia neuroprotectora para rescatar el sistema nervioso dañado o enfermo. En este estudio utilizamos MSCs de ratón modificadas genéticamente utilizando vectores lentivirales, que codificaron el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) o el factor neurotrófico derivado de las células gliales (GDNF), junto con la proteína fluorescente verde (GFP).

Antes de proceder con los estudios de trasplante in vivo, era importante caracterizar las células modificadas para determinar si la modificación genética alteraba o no aspectos del comportamiento normal de las células. Se examinaron diferentes sustratos de cultivo para determinar su capacidad para apoyar la adhesión, proliferación, supervivencia y migración celular de las cuatro subpoblaciones de MSC modificadas. Se realizó un cribado de alto contenido (HCS) y un análisis de imágenes.

Los sustratos examinados incluyeron: poli-L-lisina, fibronectina, colágeno tipo I, laminina, entactina-colágeno IV-laminina (ECL). El inmunomarcaje Ki67 se utilizó para investigar la proliferación celular y la tinción con yoduro de propidio para investigar la viabilidad celular. Las imágenes de lapso de tiempo se llevaron a cabo utilizando un sistema de cámara de luz transmitida/ambiental en el sistema de detección de alto contenido.

Nuestros resultados demostraron que las diferentes subpoblaciones de las MSCs modificadas genéticamente mostraron comportamientos similares que eran, en general, comparables a los de las MSCs originales no modificadas. La influencia de los diferentes sustratos de cultivo en el crecimiento celular y la migración celular no fue drásticamente diferente entre los grupos que compararon los diferentes subtipos de MSC, así como los sustratos de cultivo.

Este estudio proporciona una estrategia experimental para caracterizar rápidamente las células madre modificadas y sus comportamientos antes de su aplicación en estudios de trasplante in vivo a largo plazo para el rescate y la reparación del sistema nervioso.

Introducción

Un problema importante con la implementación de terapias útiles para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso se encuentra en el desarrollo de métodos eficaces que previenen la degeneración y también facilitan la recuperación de la función. Una estrategia innovadora es la modificación genética de células madre ingeniero ex vivo, para la producción de factores neuroprotectores, antes de su trasplante. Esta combinación de terapia basada en células, junto con un tipo de terapia de genes, proporciona un método potente para el tratamiento de la enfermedad o la muerte neuronal inducida por la lesión en el sistema nervioso.

Los factores neurotróficos son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de las neuronas en desarrollo, así como el mantenimiento y la plasticidad de las neuronas maduras. Un número de estudios han demostrado papeles significativos de factores neurotróficos en la promoción de crecimiento inicial y la diferenciación de las neuronas en el sistema nervioso central y periférico (SNC y SNP) y también puede estimular la regeneración in vitro y en unaNimal modelos de lesión neural ^1. Cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) es altamente expresado en el sistema nervioso central y desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo neural, la plasticidad sináptica y la reparación ^2. Derivado de la línea celular glial factor neurotrófico (GDNF) promueve la supervivencia de muchos tipos de neuronas incluyendo neuronas motoras dopaminérgicas y ^3. Por lo tanto, una estrategia importante para la reparación neural es proporcionar fuentes exógenas de factores neurotróficos a las regiones lesionadas o enfermas del sistema nervioso.

Las células derivadas de la médula ósea Multipotentes madre mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial para la entrega de proteínas terapéuticas para tratar el sistema nervioso dañado o enfermo. El trasplante de MSCs ha atraído considerable atención en los esfuerzos para desarrollar terapias basadas en células compatibles paciente, ya que tienen un número de ventajas incluyendo, 1) relativa facilidad de aislamiento y mantenimiento, 2) capacidad multipotenciales, 3) pequeñas preocupaciones éticas, 4) Capacidad de sobrevivir y migrar después del trasplante y 5) el potencial para el trasplante autólogo de ^4,5. Resultados prometedores se han reportado con el uso de MSC no tratados previamente y de ingeniería genética en modelos animales para un número de diferentes condiciones neurodegenerativas, incluyendo la lesión de la médula espinal ^{6,7, 8,9} accidente cerebrovascular, la deficiencia de mielina ^10, y degeneración de la retina ^11-13. El acoplamiento de trasplante de células con la entrega de factores neurotróficos partir de células madre genéticamente modificadas es una importante estrategia de reparación neural novedoso y.

Un paso esencial en el desarrollo de sistemas de administración de factor terapéutico a base de células es determinar la salud normal de las células manipuladas. Como tal, el objetivo principal de este estudio fue evaluar los parámetros de crecimiento general de las células madre adultas genéticamente modificados. Un enfoque importante para evaluar rápidamente múltiples parámetros de la celda es emplear celular de alta a través screenin basado en imágenesg (HTS), se refirió a los procedimientos de tan alta de detección de contenido (HCS) ¹⁴ veces. Esta tecnología permite la adquisición de imágenes y análisis automatizado y este enfoque es especialmente adecuado para aplicaciones de investigación de células madre. En este proyecto hemos desarrollado una plataforma de perfiles que permite la caracterización rápida y optimización de las preferencias de sustrato celular y funciones celulares con células madre adultas de ingeniería genética que emplea un sistema de HCS.

Protocolo

1. Preparación del soporte para placas de 96 pocillos

1. Crear un mapa de la placa de 96 pocillos delineando los diferentes sustratos y tipos de células para ser examinado (Figura 1).
2. Obtener las soluciones madre de diferentes sustratos [poli-L-lisina, fibronectina, colágeno tipo I, laminina y colágeno IV-entactina-laminina (ECL)], una placa de 96 pocillos de pocillos múltiples y preparo una estación de trabajo en un cultivo celular estéril capucha.
3. Preparar sustratos individuales por dilución de valores en salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a una concentración final de 5 mg / ml (esta concentración se determinó previamente sobre la base de un ensayo dependiente de la concentración de sustrato para el crecimiento y la proliferación de las células). Mezclar utilizando un vórtice antes de verter en un depósito estéril.
4. Añadir 100 l de solución de sustrato en cada pocillo de acuerdo con el mapa de 96 pocillos (Figura 1) (una micropipeta de 12 o de 8 canales es conveniente para micropipeteado en una placa de 96 pocillos). Sellar la tapa a la placa de 96 pocillos usando una tira de Parafilm y almacenar durante la noche a 4 ° C.

2. célula de recubrimiento y Time-lapse de imágenes

NOTA: Mouse MSCs fueron aisladas de la médula ósea de adultos C57BL / 6 ratones y se mantiene como una línea de células adherentes. MSCs se infectaron usando vectores lentivirales para diseñar ellos para secretar-cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF; cDNA humano) y derivado de células gliales factor neurotrófico (GDNF; ADNc humano) usando la codificación BDNF (LV-BDNF de vector lentiviral; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), y la proteína verde fluorescente (GFP, LV-GFP; CMV-GFP).
NOTA: Los medios de cultivo para las células madre mesenquimales de ratón (MSC) es medio de Dulbecco modificado de Iscove que contiene 10% de suero de hibridoma cualificado fetal bovino, 10% de suero equino, 2 mM L-glutamina, y 10.000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina . Los cinco tipos diferentes de MSC de ratón (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC y BDNF GDNF-GFP-MSC) se sembraron a alrededor del 30% de confluencia en frascos de cultivo celular T75 /.

1. Célula de recubrimiento
   1. Al día siguiente, eliminar las soluciones de sustrato por aspiración y enjuagar cada pocillo con aproximadamente 200 l de PBS estéril, dos veces. Añadir medio de cultivo celular (200 l / pocillo) a cada pocillo después del enjuague final PBS. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular fijado en 37 ° C y 5% de CO ₂ para el equilibrado.
   2. Mientras que la placa de 96 pocillos se equilibradores en la incubadora, recoger las células (MSCs en matraces T75 deben ser aproximadamente 70% confluentes en el momento de la cosecha / chapado) mediante la recopilación de los medios de crecimiento (se hace referencia a medios de comunicación como condicionada) del matraz T75 y almacenar en un tubo cónico de 15 ml en condiciones estériles (este medio acondicionado se utilizará en el paso 2.1.4 a continuación).
   3. Añadir 8 ml de PBS estéril al matraz y agitar suavemente y luego la pipeta de la PBS y añadir 1 ml de tripsina al 0,05% y 0,01%Solución de EDTA para separar las células de la superficie de cultivo del matraz T75. Monitorear el desprendimiento de células mediante la visualización del matraz usando un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase.
   4. Cuando las células han individual, añadir inmediatamente 8 ml de medio condicionado (recogidos en el paso 2.1.2) al matraz. Recoger la suspensión celular y transferir a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml y centrifugar durante 4 min a 450 xg para sedimentar las células.
   5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 200 l de fresco y calentado (37 ° C) medios de cultivo celular.
   6. Determinar el número de células en la suspensión celular mediante la realización de un recuento de células viables azul de tripano usando un hemocitómetro. Placa de las células a una densidad de aproximadamente 300 células / pocillo en los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos.
   7. Repita estos pasos para cada población de células.
2. Time-lapse
   1. Una vez que todos los MSCs se han plateado, lugarla placa de 96 pocillos en una incubadora durante 2 horas para permitir que las MSC para unir al sustrato.
   2. Inicie el sistema HCS y esperar 2 horas para que el sistema se equilibre. Ajuste el controlador ambiental a 37 ° C y conectar un cilindro de gas mixto que contiene 5% de _CO2 en aire para el sistema de cámara ambiental HCS el suministro de una fuente de aire constante.
   3. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora después del periodo de equilibración 2 hr y colocar directamente en la cámara de crecimiento celular del sistema de HCS. Permita 30 minutos para el equilibrio para dar cuenta de cualquier expansión relacionadas con el calor de la placa y luego iniciar la adquisición y análisis de imágenes de software para configurar los ajustes de la placa.
   4. Seleccionar el objetivo 20X para formación de imágenes. Seleccione dos pozos por condición [es decir, las buenas prácticas agrarias-MSC en fibronectina etc. (6 sustratos x 5 subtipos MSC para un total de 30 condiciones x 2 repeticiones = 60 pozos en total)] para la creación de time-lapse. Elija dos sitios para la formación de imágenes conen cada pocillo.
   5. Elija las longitudes de onda de luz correctas para imágenes.
      NOTA: Hay dos longitudes de onda diferentes (contraste de fase y fluorescencia GFP) fueron seleccionados para time-lapse.
   6. Enfoque en el fondo del pozo con el autofoco láser y tomar imágenes de prueba para múltiples sitios y múltiples pozos para encontrar un plano focal optimizado.
   7. Una vez que el enfoque se ha establecido, comenzar a capturar imágenes cada 5 minutos durante 48 horas para todos los 60 pozos (120 sitios).
   8. Alimentar a las células cada 24 horas mediante la eliminación de la placa de 96 pozos del sistema de HCS. Retire 75 l de los medios de comunicación de cada pocillo y añadir 100 l de medio fresco a cada pocillo (equilibrar este medio fresco a 37 ° C y 5% de CO _2).
   9. Al final del experimento de lapso de tiempo, retire la placa de 96 pozos del sistema de HCS. En condiciones estériles, recoger las muestras de medio condicionado de cada pocillo y transferir estas muestras a otra placa de 96 pocillos.
      NOTA: Estas muestras pueden ser utilizados para más analyses mediante la realización de ELISA para los factores neurotróficos.
   10. Preparar la placa de 96 pocillos con MSCs cultivadas para ensayos adicionales, tales como ensayo de proliferación celular Ki67 o yoduro de propidio ensayo de tinción en vivo / muerto (ver detalles a continuación).
   11. Realizar análisis de time-lapse de células de seguimiento migración / celular como se describe en la sección 5.

3. Ki67 Proliferación Celular y yoduro de propidio Live / Dead Ensayo

1. Ensayo de proliferación Ki67 celular (inmunocitoquímica)
   1. Enjuagar los cultivos de células con 0,1 M de fosfato (PO ₄₎ tampón durante un minuto dos veces. Fijar el cultivo con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar los pocillos con PBS durante siete minutos, tres veces.
   2. Después del enjuague final, añadir 100 l de solución bloqueante (tampón fosfato salino, 5% de suero normal de burro, 0,4% de suero de albúmina bovina, y 0,2% de Triton X-100) a cada pocillo de unand incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Preparar el anticuerpo primario, conejo anti-Ki67, mediante la dilución en solución bloqueante en una relación de trabajo de 1: 200.
   3. Eliminar la solución y aplicar bloqueador 100 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo. Cubrir la placa de 96 pocillos e incubar las muestras a 4 ° C durante la noche.
   4. Al día siguiente, eliminar la solución de anticuerpo y enjuagar con PBS durante 7 min, 3 veces.
   5. Preparar el anticuerpo secundario, burro anti-conejo Cy3 en solución de bloqueo a una relación de trabajo de 1: 500. Añadir tinción nuclear DAPI a la solución de anticuerpo secundario a una dilución de 1: 100. Después de la eliminación del último aclarado PBS, aplicar 100 l de la solución de anticuerpo / DAPI secundario a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min.
   6. Eliminar la solución de anticuerpo / DAPI secundaria y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen.
2. Propidium yoduro Live / Dead Ensayo
   1. Medir la muerte celular por yoduro de propidio (PI) ensayo de exclusión como se describe a continuación.
   2. Preparar la solución de tinción de yoduro de propidio a una concentración de 1,5 mM en medio de cultivo.
   3. Añadir 100 l de etanol al 70% a un pocillo de la MSCs durante 2 min con la intención de matar a esas células. Esto bien sirve como un control positivo para la tinción PI. La mayoría de las MSC será PI-manchado que indica la muerte celular. Eliminar la solución de etanol.
   4. Añadir 100 l de solución de tinción de yoduro de propidio a cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C en un incubador de _CO2 5%.
   5. Enjuagar las células con tampón fosfato 0,1 M durante 1 min, 2 veces. Fijar las células con PFA al 4% en tampón 0,1 M P0 ₄ durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar con PBS tres veces durante 7 minutos.
   6. Incubar con una solución de DAPI (01:50) diluido en solución bloqueante durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague todos los pozos conPBS durante 7 min, 3 veces.
   7. Eliminar la solución de DAPI y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen.

Análisis 4. Automatización de Imágenes y Multiwavelength Scoring

1. Cargue una placa de 96 pocillos (previamente procesada para immunolabeling Ki67 o yoduro de propidio manchadas) en el sistema de HCS y permita que la placa se equilibre durante 20 min Abra la adquisición y análisis de imagen sistema de software HCS.
2. Seleccione los valores de adquisición para el objetivo de 10X usando la cámara se va a agrupar en 1 y un ajuste de ganancia de 2. Busque el Z-plano en el que residen las células mediante la utilización de la función de exposición automática y calcular el desplazamiento para cada longitud de onda de interés. Para este análisis, imágenes de la captura de DAPI (W1), Cy3 (W2) y FITC (W3). Elija el nivel de intensidad máxima a la que los pocillos de control negativo no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Confirmar este ajuste es apropiado para la pospozos sitivos.
3. Adquirir plato. Captura imágenes y almacenarlas en la adquisición de imágenes y base de datos de software de análisis.
4. Una vez que las imágenes han sido adquiridas, imagen abierta adquisición y análisis de software fuera de línea y placa revisión de los datos de las imágenes adquiridas anteriormente.
5. Seleccione el análisis de puntuación Multi-longitud de onda. Configurar la intensidad mínima y máxima para cada longitud de onda.
   NOTA: detección DAPI debe marcar la coloración alrededor de cada núcleo visible. Cy3 debe detectar las células Ki67 positivas con inmunorreactividad (IR) y no debería detectar IR bajo los controles negativos. Para Cy3 Ki67 IR, el ancho mínimo aproximado fue de 7 m, ancho máximo aproximado fue de 30 m, la intensidad por encima del fondo local era 150 niveles de gris, y la zona manchada mínimo era de 50 m ^2.
6. Ejecutar análisis para todas las posiciones. Exportar los datos para ver en hoja de cálculo.

Seguimiento 5. celular

1. Acquisitio Abrir imagenn y el programa de análisis y haga clic en "Revisión de la placa de datos [DB] ...", la selección de la placa de interés.
2. Ver los datos como "Tiempo vs. Bueno".
3. Elija uno de los sitios de la sección "Sitios" haciendo clic izquierdo en la selección deseada. Seleccione "Transmitido ..." en el capítulo "Las longitudes de onda:". Haga clic derecho sobre la meta bien en la plantilla de la placa de 96 pocillos y haga clic en "Cargar imágenes".
4. Seguimiento de las células haciendo clic en "Aplicaciones" y luego en "Objetos de pista".
5. Utilice "intercambio dinámico de datos (DDE)" para elegir el formato para exportar los datos, por ejemplo, Microsoft Excel.
6. Elija los datos de seguimiento a la exportación, por ejemplo, el tiempo transcurrido, el número de objetos, la distancia, el intervalo de tiempo, velocidad, ángulo absoluto, distancia al origen, delta X y delta y.
7. Tag cada célula de interés con "Ctrl + clic izquierdo" en las células diana.
8. Células de pista. Si es necesario, detener / cambiar seguimiento inadecuado de las células con la tecla "Esc" y luego ajustar la configuración.
9. Después de rastreo celular es completa, guardar los datos con "Registro de datos".

Resultados

Los parámetros de crecimiento de MSC fueron examinados por el cultivo de las diferentes poblaciones de MSC sobre diferentes sustratos. Las cinco poblaciones diferentes de subtipos MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, y BDNF / GDNF-GFP-MSC) se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos pre-revestidas con el diferente sustratos como se ilustra en la Figura 1. Después de cuatro días de cultivo, las placas se fijaron y immunolabeled y / o teñidas con los reactivos apropiados y luego examinadas utilizando el sistema de HCS y análisis realizados con la adquisición de la imagen y el programa de software de análisis.

Figura 1:. Plantilla de la placa de 96 pocillos para el diseño experimental placas de 96 pocillos se recubrieron con varios sustratos y los pocillos se sembró con células madre Engineered como se muestra en la plantilla. Como un ejemplo, sólo wells en filas BF se utilizaron en este experimento. Filas A, G y H se quedaron vacíos. Abreviaciones - MSC: células madre mesenquimales; GFP-MSC: verde fluorescentes MSC que expresan la proteína; BDNF-GFP-MSC: derivado del cerebro MSC factor que expresan GFP neurotróficos; GDNF-GFP-MSC; Derivado de células gliales MSC factor que expresan GFP neurotróficos; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF y GDNF MSC expresan GFP; ECL: entactina-colágeno IV-laminina).

Immunolabeling anti-Ki67, seguido de contratinción DAPI, se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados proliferación de las diferentes poblaciones de MSCs de ingeniería (Figura 2a). Expresión del antígeno Ki67 se produce preferentemente durante las fases finales de G _1, S, G ₂ y M del ciclo celular, y no se detecta en las células en la fase de reposo (G _0), y por lo tanto es útil como un marcador para la proliferación celular ¹⁵ . 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es un nu comúnmente utilizadocounterstain clara y el cromosoma que emite fluorescencia azul tras la unión a AT regiones de ADN ^16. El número total de células en un campo puede determinarse contando el número de núcleos teñidos con DAPI. Como se ilustra en la Figura 2B, aunque hubo una variación en los porcentajes de MSCs en proliferación, todos los sustratos, sin embargo, el apoyo considerable proliferación celular para cada uno de los subtipos de MSC.

Figura 2: ensayo de proliferación celular Ki67. (A) Fusionada, imagen doble fluorescente de Ki67 immunolabeling (rojo) y DAPI (azul) tinción nuclear. Muchos de los MSCs se immunolabeled con el anticuerpo Ki67 (rojo). Barra de escala = 50 m. (B) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de Ki67 immunolabeled subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágenoTipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Yoduro (PI) tinción de propidio se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados supervivencia celular (Figura 3). El yoduro de propidio es un contratinción nuclear y el cromosoma-rojo fluorescente de uso común. El yoduro de propidio es impermeable a la membrana y generalmente excluido de células viables, y por lo tanto es útil para detectar las células muertas en una población. La proporción de células muertas dentro de una condición dada se puede determinar cuando se combina con una etiqueta nuclear general tal como DAPI para identificar todas las células dentro de un campo. El porcentaje de células PI-positivo era bajo en todos los sustratos examinados (La Figura 3). Como control positivo para el reactivo de PI, a unos pocillos que contienen MSCs se incubaron en 70% de etanol, una condición conocida para matar la mayoría de las células, lo que resulta en un alto porcentaje de células PI-etiquetados como se ilustra en la Figura 3B y 3C (etanol tratada positivo control).

Figura 3: ensayo de la muerte celular yoduro de propidio. (A) Fusionada, doble imagen fluorescente de yoduro de propidio (rojo) y DAPI (azul) tinción. Aunque los núcleos de todas las células viables se tiñeron con DAPI (azul), no se detectó tinción con yoduro de propidio en el MSC. (B) Prácticamente todos los MSCs se tiñeron con yoduro de propidio después de la exposición a etanol al 70%. Las barras de escala en A y B = 100 m. (C) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de yoduro de propidio (PI) manchada subtipo MSCs crecido en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). Control de etanol: Esta condición sirvió como control positivo para el reactivo de tinción PI. La mayoría de las células sometidas a tinción PI tras el tratamiento de etanol están muertos y por lo tanto manchadas positivamente para el reactivo PI. N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para investigar la posible influencia de los diferentes sustratos en el comportamiento de las MSC de ingeniería, la migración celular se analizó mediante microscopía digital en tiempo transcurrido y el sistema de transmisión de luz / ambiental cámara en el sistema HCS (ver Suplementario Video 1). Múltiples sitios / pocillo fueron imágenes de lapso de tiempoy se utiliza para calcular las tasas de migración celular para las diferentes subpoblaciones de MSC que crecen en los diferentes sustratos utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. En general, como se muestra en la Figura 4C, todos los subtipos de MSC mostraron la tasa de migración más rápida en las superficies de la matriz extracelular (fibronectina recubiertos, colágeno, laminina y ECL) y el más lento en las superficies no revestidas de poliestireno.

Figura 4:. De seguimiento de la célula y la migración MSC rastreados con adquisición de imágenes y software de análisis. Imágenes superpuestas de luz y fluorescencia de transmisión de imágenes (A) el inicio de time-lapse y (B) en 29 horas más tarde al final de la sesión de time-lapse (ver Suplementario Video 1). Pistas de migración celular se indican con el li colornes. Barra de escala:. 50 micras gráfico (C) de barras que ilustra las tasas de migración media (expresada como m / h) para los subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, o entactina-colágeno IV-laminina (ECL) sustratos para 2 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa la media de al menos 10 células fotografiados de 2 pozos para cada condición. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan evidencia preliminar de que estas subpoblaciones de MSCs genéticamente modificados presentan propiedades de crecimiento similares. Estos resultados proporcionan evidencia convincente de que la lentiviral mediada modificaciones genéticas de estos MSC inducidos sin efectos deletéreos detectables dramáticos sobre los parámetros de crecimiento investigados utilizando esta plataforma de cribado.

Suplementario vídeo 1. Time-lapse vídeo digital de MSC seguimiento utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. La ruta de migración es para dos MSC [indicadas como 1 (línea de rastreo verde) y 2 (línea de rastreo azul)] se ilustran. Vídeo capturado durante un período de 29 horas. Las imágenes fueron capturadas cada 5 min. Las imágenes de fluorescencia de MSC que expresan GFP se utilizó para time-lapse en la elaboración del video. La barra de calibración = 50 micras. Este tipo de análisis es útil para la investigación de comportamientos celulares, incluyendo la migración celular y la división celular.

Discusión

Células madre adultas mesenquimales (MSCs) son un tipo de célula atractivo para el desarrollo de una estrategia experimental que combina una terapia basada en la entrega celular y génica. MSCs son multipotentes, capaces de diferenciarse en células de linaje mesodérmico, y muestran considerable plasticidad, diferenciando / transdifferentiating en linajes neuronales y gliales con la inducción apropiada paradigmas ^17,18. Además, las MSC se han trasplantado y demostrado su eficacia en estudios preclínicos para una serie de trastornos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas ^19. La eficacia terapéutica de MSCs es bien conocido debido a sus anti-proliferativos beneficioso, actividades anti-inflamatorias y anti-apoptóticos ^20. MSCs son también conocidos para producir y secretar diversos factores neurotróficos y de crecimiento, que probablemente contribuye a las cualidades neuroprotectoras asociados con MSCs ingenuos después del trasplante en los sitios de lesión o enfermedad ^21. Importantly, MSCs se pueden modificar genéticamente para la entrega sostenida de factores neurotróficos para aplicaciones de terapias de gen celular y combinados y se han utilizado en un número de modelos animales de lesión o la enfermedad del CNS ^11,19,22.

En el desarrollo de una estrategia basada en la terapia celular y génica combinada, es importante que la salud de las células se evalúa cuidadosamente antes de su uso extensivo en vitro, y especialmente en aplicaciones in vivo. Como una prueba de concepto, que investigó múltiples poblaciones de líneas de ingeniería y MSC de control con el fin de estudiar las consecuencias de las modificaciones genéticas en la salud celular y fitness utilizando un enfoque de alto contenido de screening (HCS). En general, HCS se refiere a la selección de alto rendimiento basado en imágenes celular ^14. Este enfoque de detección permite una evaluación cuantitativa de fenotipos celulares en múltiples niveles de espacial (celulares para subcelular) y temporales (milisegundos al día) resolución a través de diversas condiciones experimentales. Usando este enfoque accedimos posibles diferencias en la preferencia de sustrato sobre los siguientes parámetros: proliferación celular, la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP), la muerte celular, la motilidad celular y / migración. Los experimentos fueron diseñados en formato de 96 pocillos placa de cultivo celular. Dentro de una sola placa se determinó rutinariamente posibles diferencias relacionadas con el sustrato con respecto a cada parámetro para las diferentes poblaciones de células MSC lentiviral transducidas y se compararon los MSCs de ingeniería con el original, MSC no transducidas. Esto proporcionó un medio para comparar directamente los resultados para los diferentes subtipos de MSC con una batería de ensayos in vitro tales como la proliferación celular utilizando immunolabeling Ki67, ensayo de viabilidad de células vivas / muertas mediante la tinción de yoduro de propidio, y el comportamiento celular mediante la realización de imágenes digitales en tiempo lapso . Como una extensión de esta HCS también se puede llevar a cabo pruebas ELISA en muestras de medios condicionados recogidos de individuo wells para determinar cuantitativamente la secreción de factores neurotróficos. El medio condicionado a partir de diferentes subtipos MSC también se puede utilizar en bioensayos in vitro para determinar la actividad biológica de factores secretados ^11,23. Este tipo de plataforma de HCS también se puede utilizar para mediciones in vitro del crecimiento de neuritas a partir de cultivos neuronales primarios y líneas de células madre neurales ^24. En general, nuestros resultados demostraron que las subpoblaciones de las MSCs genéticamente modificados muestran comportamientos similares en comparación con los MSCs no modificados. La influencia de diversos sustratos de cultivo sobre el crecimiento celular y la migración celular no fue dramáticamente diferente entre los subtipos de MSC, así como sustratos de cultivo. Como tal, los sustratos de matriz extracelular probados no parecen jugar un papel crítico en la modulación de estos aspectos de comportamiento de las células para estas diferentes MSCs de ingeniería.

Este estudio demuestra el uso de un sistema de HCS para analizar different aspectos del comportamiento celular. Sin embargo, no es raro encontrar limitaciones asociadas con análisis de imagen. En ocasiones, al analizar las imágenes de fluorescencia, que era un poco difícil determinar el valor umbral por encima del cual correcta immunolabeled o células teñidas se contarían como positivamente marcado / manchado. Por lo tanto, para minimizar el sesgo subjetiva, la determinación de los valores umbral era dependiente de una comparación con los controles (controles negativos para imágenes de fluorescencia se llevaron a cabo en paralelo durante todo el procesamiento por la omisión de los anticuerpos primarios o secundarios). Se encontró Otra limitación durante el análisis de la migración celular utilizando la imagen digital de lapsos de tiempo. En algunos casos, el software de imagen no era capaz de diferenciar entre el movimiento browniano aleatorio de una célula frente a la migración de una célula en realidad sólo una distancia muy corta. Las limitaciones adicionales fueron evidentes en situaciones donde el software de análisis no era capaz de distinguir la presencia de multipcélulas LE en una proximidad muy cercana a uno-otro. Para superar esta limitación se requiere la selección manual de células durante el análisis en lugar de un análisis totalmente automatizado. Densidad de placas de la célula también puede resultar en sesgando los datos de migración celular entre poblaciones de células que muestran mayor preferencia para crecer en grupos frente a las células que crecen en aislados unos de otros. Estos tipos de diferencias son, en parte, probablemente un reflejo de la célula-sustrato frente a las preferencias de célula-célula.

El uso de un sistema de HCS para adquirir imágenes y realizar análisis de datos proporciona un medio eficaz y rápidos para evaluar múltiples parámetros de la celda. Además, los vídeos digitales de lapso de tiempo de 30 condiciones diferentes (6 sustratos y 5 subtipos diferentes MSC) fueron adquiridos de forma rutinaria por períodos que van de horas a días (48 horas), mientras que el uso de la cámara ambiental. Posteriormente, estos datos se utilizó para calcular y determinar las diferencias en las tasas de migración celular a través de varias líneas celulares de diferente ECMmoléculas.

En este informe hemos destacado la implementación de una plataforma de filtrado de contenido para evaluar la salud y la función celular. Este tipo de análisis es útil para el desarrollo de estrategias racionales para el diseño de tipos de células, así como sustratos de polímero para facilitar el crecimiento de células dirigida y la regeneración neural. Este es un paso esencial hacia la aplicación de entrega basada en células madre de factores terapéuticos antes de su extensa en los estudios preclínicos in vivo utilizando estrategias de trasplante celular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 96 pocillos	Greiner Bio One	655090	Placas de 96 pocillos seleccionadas para su uso en ImageXpress
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A9647
Anticuerpo anti-Ki67 de conejo	Abcam (Cambridge, MA)	Ab16667	Dilución 1:200
Colágeno tipo I	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	C7661	Colágeno de cola de rata
DAPI	Invitrogen (Carlsbad, CA)	D3571
Burro anti-Conejo Cy3	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	711-165-152	dilución 1:500
ECL (Entactina-Colágeno-Laminina)	Millipore/Chemicon (Temecula, CA)	08-110
Suero fetal bovino (FBS)	Hyclone (Logan, UT)	SH30071.03
Suero equino	Hyclone (Logan, UT)	SH3007403
etanol	(Ames, IA)	12003510	100%, 200 pruebas
de fibronectina	Fisher Scientific (Hampton, NH)	CB-40008
Iscove' s Medio Dulbeccos Modificado (IMDM)	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
KH2PO4	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P285	Para PO4 tampón
K2HPO4	Fisher Scientific (Hampton, NH)	P288	Para tampón PO4
L-Glutamina	Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)	25030-081
Laminina (ratón)	Trevigen (Gaithersburg, MD)	3400-010-01
MSCs de ratón de ratones C57BL/6 adultos	Tulane Cent para terapia génica (Nueva Orleans, LA)		Aislado de la médula ósea
MSCs modificadas genéticamente (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)	Estas células se obtuvieron de nuestro estudio anterior: Ye et. al. (en preparación)
Suero de burro normal (NDS)	Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)	017-000-121
Paraformaldehído (PFA)	Fisher Scientific (Hampton, NH)	O4042	4% PFA en 0,1 M Tampón PO4
Penicilina-Estreptomicina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P0781
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4417
Poly-L-lisina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	P4707
Yoduro de propidio (PI)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	P1304MP
Triton X-100	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	X100
Tripsina 0.05% (EDTA 1x)	Invitrogen (Carlsbad, CA)	25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's	Medium Invitrogen (Carlsbad, CA)	12440– 046
Hibridoma FBS	Hyclone (Logan, UT)	SH30396.03
Hyclone de suero equino	(Logan, UT)	SH3007403
ImageXpress Micro	Dispositivos moleculares (Sunnyvale, CA)	ImageXpress micro	Sistema de cribado de alto contenido
MetaXpress 4.0	Dispositivos moleculares (Sunnyvale, CA)	MetaXpress 4.0	Adquisición y análisis de imágenes software