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Artículo de método

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

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DOI:

10.3791/52257

⸱

21 de noviembre de 2014

 , 
1Department of Pathology, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Resumen

El estudio de la biología de los linfocitos T humanos a menudo implica el examen de las respuestas a los ligandos activadores. Las células T reconocen y responden a los antígenos peptídicos procesados presentados por las moléculas MHC (HLA ortólogo humano) a través del receptor de células T (TCR) de una manera altamente sensible y específica. Mientras que la función principal de las células T es mediar las respuestas inmunitarias protectoras a los antígenos extraños presentados por el autoMHC, las células T responden de forma robusta a las diferencias antigénicas en los tejidos alogénicos. Las respuestas de las células T a los aloantígenos pueden describirse como aloreactividad directa o indirecta. En la aloreactividad, la célula T responde a través del reconocimiento altamente específico tanto del péptido presentado como de la molécula MHC. La robusta respuesta oligoclonal de las células T a la estimulación alogénica refleja el gran número de aloantígenos potencialmente estimuladores presentes en los tejidos alogénicos. Si bien la amplitud de las respuestas de los linfocitos T aloreactivos es un factor importante en el inicio y la mediación de la patología asociada con las respuestas aloreactivas biológicamente relevantes, como la enfermedad de injerto contra huésped y el rechazo del aloinjerto, puede impedir el análisis de las respuestas de los linfocitos T a los ligandos alogénicos. Con este fin, este protocolo describe un método para generar células T aloreactivas a partir de leucocitos de sangre periférica humana (PBL) naïve que responden a aloantígenos peptídicos-MHC (pMHC) conocidos. El protocolo aplica el marcaje de multímeros pMHC, el enriquecimiento magnético de perlas y la citometría de flujo a los métodos de cultivo in vitro de una sola célula para la generación de clones de células T específicas de aloantígenos. Esto permite estudiar la bioquímica y la función de las células T que responden a la estimulación alogénica.

Introducción

Los linfocitos T son componentes críticos del sistema inmune adaptativo. Las células T son responsables de mediar no sólo directamente respuestas inmunes protectoras a los agentes patógenos a través de una variedad de mecanismos efectores, sino también mantener activamente la auto-tolerancia inmunológica y dirigir las respuestas de otras células en el sistema inmune. Estas funciones están dirigidas a través de un número de señales integradas, incluyendo receptores de células T (TCR) de la ligación, citocinas y quimiocinas, y los metabolitos 1. De estas señales, el TCR es de particular importancia, ya que proporciona la especificidad característica que define el papel de la célula T en la inmunidad adaptativa. Un TCR interactúa con antígenos peptídicos lineales presentados por MHC (HLA ortólogo humano) moléculas (complejos pMHC) de una manera altamente específica y sensible para proporcionar las señales que inician la función efectora de células T. Los parámetros bioquímicos de las interacciones de TCR con ligandos pMHC proporcionan no sólo la especificidad para Tactivación de las células, sino que también tiene un impacto cualitativo en función de la célula posterior T2. Por lo tanto, el estudio de la función de las células T a menudo requiere el examen de las respuestas de las células T clonales con especificidad antigénica definida.

El compartimiento humana de células T, que contiene aproximadamente 10 12 células T αβ, contiene un estimado de julio 10 a agosto 10 αβTCRs distintas 3-4. Este diverso repertorio ofrece oportunidad para el reconocimiento de la gran variedad de péptidos de patógenos potenciales que requeriría una respuesta de células T para la inmunidad protectora. Se estima que la frecuencia de células T en respuesta a un antígeno extraño dado presentado por auto-MHC es del orden de 10 -4 a 10 -7 en ausencia de respuesta inmune antes de que el antígeno 5. El repertorio de células T naive está determinada por la selección tímica para asegurar la capacidad de reconocer auto-MHC presentación de antígenos peptídicos y límite reaccionanividad contra antígenos auto-péptido, la maximización de la utilidad potencial para mediar la inmunidad protectora 2. Sin embargo, en violación de esta diseñado reactividad, una frecuencia relativamente grande, 10 -3-10 -4, de las células T de individuos inmunológicamente ingenuos responder a la estimulación con células alogénicas, reconociendo tanto las moléculas MHC extranjeros así como los péptidos endógenos que presentan 6. El reconocimiento de ligandos pMHC alogénicos es estructuralmente similar al reconocimiento de antígenos extraños presentados por auto-MHC; el TCR hace interacciones bioquímicas críticos tanto con la molécula MHC alogénico, así como el péptido presentado 7. La naturaleza robusta de la respuesta de las células T alogénicas a resultados de la estimulación de la diversidad de los complejos pMHC presente en la superficie de las células alogénicas 8. Se estima que cada MHC presenta aproximadamente 2 x 10 4 diferentes antígenos peptídicos endógenos 9. Este breadth de la respuesta a la estimulación alogénica es un aspecto significativo de la patología clínicamente relevantes, tales como el rechazo de aloinjerto o enfermedad de injerto contra huésped (EICH), como resultado de alorreactividad de células T.

Estudio de células T respuestas alorreactivas humanos se ha basado tradicionalmente en el examen de las respuestas policlonales de células T vírgenes después de la estimulación con células alogénicas. La estimulación repetida con la misma línea celular alogénico combinado con análisis de dilución limitante es capaz de generar células T clonales con el reconocimiento alogénico HLA definida de 10. Sin embargo, este enfoque es problemático para el examen de las respuestas a ligandos pMHC alogénicos individuales, como el repertorio amplio y diverso de complejos pMHC endógeno presente durante un determinado alogénico HLA estimula un amplio repertorio de células T. Esta estimulación población mayor y la limitación de la dilución enfoque requeriría de cribado de un gran número de clones para aislar células T con la deseada Reactividad contra un único ligando pMHC. Además, la frecuencia de células T que responden a un ligando pMHC alogénico individual es relativamente baja entre las poblaciones de células T ingenuas, que presenta una barrera para la generación eficiente de clones de células T humanos que responden a un antígeno dado.

La identificación y el aislamiento de las células T específicas de antígeno de las poblaciones policlonales se han habilitado por el desarrollo de fluoróforo marcado pMHC multímeros 11. Este enfoque utiliza antígenos peptídicos específicos cargados en moléculas MHC solubles biotiniladas recombinantes, que se etiquetan mediante la unión a un fluoróforo marcado con estreptavidina. La multimerización de pMHC aumenta la avidez, la compensación de la afinidad del TCR intrínsecamente baja (M) para ligandos solubles pMHC. Las células marcadas pueden ser identificados y aislados por citometría de flujo. Sin embargo, este enfoque todavía está limitado por la baja frecuencia de células T específicas de antígeno entre las poblaciones de células T vírgenes, que son típicamenteórdenes de magnitud menor que el límite de la identificación y la cuantificación precisa en la mayoría de los citómetros de flujo. Para abordar esta limitación, un método de etiquetado tetrámero pMHC y posterior enriquecimiento perla magnética para las células tetrámero marcado ha sido desarrollado 12. Este método ha demostrado una detección fiable, enumeración, y el aislamiento de células T específicas de antígeno de baja frecuencia.

Este protocolo describe un protocolo eficaz para la generación de clones humanos de células T que responden específicamente a ligandos pMHC alogénicos individuales. El protocolo se aplica pMHC (HLA) etiquetado multímero y enriquecimiento para el aislamiento de células T humanas-aloantígeno específico con citometría de flujo de células de clasificación y un método robusto para el cultivo in vitro de células T humanas para permitir la producción de clones de células T de células clasificadas individuales ( visión general en la Figura 1).

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Protocolo

NOTA: Este protocolo requiere el uso de muestras de sangre periférica de voluntarios humanos. Todas las investigaciones con seres humanos debe ser revisado y aprobado por un Estudios Humanos Junta de Revisión Institucional para garantizar el cumplimiento de la Declaración de Helsinki (2013) y la Portabilidad del Seguro de Salud y la Ley de Responsabilidad de 1996.

1. Aislamiento de células T de sangre entera

  1. Antes de comenzar, calentar el medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente. Alícuota 4 ml de medio de gradiente de densidad en 2-4 estériles de 15 ml tubos de centrífuga cónicos (1 tubo será utilizado por cada 10 ml de volumen total de sangre diluida).
  2. Obtener 10-20 ml de sangre en aerosol heparina 1-2 de sodio revestido (verde-top) tubos de extracción de sangre venosa. Recoger muestras humanas bajo la supervisión de personas capacitadas y de acuerdo con una Junta de Revisión Institucional protocolo aprobado.
  3. Limpiar el exterior de los tubos con etanol al 70%. Retire con cuidado la parte superior de la fillenada tubos de recogida y decantar la sangre en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril.
  4. Añadir 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a cada tubo de recogida de sangre. Recoger el PBS, añadir a la sangre entera se decanta, y mezclar suavemente.
  5. Añadir 25 mu l T humanas de enriquecimiento celular Cocktail / 2 ml de volumen total. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
  6. Usando una pipeta de 10 ml, la capa de hasta 10 ml de la 1: 1 sangre diluida suavemente en la parte superior del medio de gradiente de densidad. Tenga cuidado de no perturbar la superficie del medio de gradiente de densidad.
  7. Sangre en capas Centrifugar y medio de gradiente de densidad a 1.200 xg durante 20 min a 20 o C.
  8. Sacar los tubos de la centrífuga, teniendo cuidado de no alterar la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y la capa de leucocitos en la interfaz entre el medio de gradiente de densidad y el plasma diluido. Con una pipeta de 5 ml, recoger cuidadosamente la capa leucocitaria y traslado a un nuevo 50 ml bañera cónico estérile.
  9. Añadir PBS para llevar el volumen de la PBL recogidos a 50 ml y mezclar suavemente.
  10. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar.
  11. Resuspender las células sedimentaron en 10 ml estéril citometría de flujo de la clasificación tampón (PBS filtrada de forma estéril que contiene 1% de BSA). Muestra de 10 l de suspensión celular, se diluye 1:10 (añadir a 90 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro (rendimiento esperado 1-4 x 10 6 células / tubo de sangre total).
    1. Eliminar 1 ml alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células T no etiquetados por tetrámero. Mantener la suspensión de células en hielo.

2. Enriquecimiento magnética de las células T específicas de aloantígeno-

  1. Diluir aloantígeno pMHC tetrámero a 1: 100 en tampón de tipo estéril.
  2. Centrifugar la suspensión celular (9 ml del paso 1,11) a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar.
  3. Añadir 50 l de diluirse aloantıgeno pMHC tetrámero de peletizadocélulas (hasta 10 7 células). Mezclar por pipeteo suave. Transferir a un tubo de 5 ml estéril. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Añadir 2 ml de tipo buffer. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Decantar.
  5. Resuspender las células en 100 l de tampón especie. Añadir 10 l de cóctel de selección de biotina y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
  6. Añadir 5 l Magnetic nanopartículas y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
  7. Añadir 2,5 ml especie de amortiguamiento y se mezclan suavemente con la pipeta. Quite 100 l alícuota, traslado al tubo de 5 ml, y mantener en hielo para el análisis de las células pre-enriquecimiento.
  8. Coloque el tubo de 5 ml que contiene la suspensión celular en el imán de separación de células. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  9. Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar el contenido del tubo en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo aeliminar las últimas gotas de líquido.
  10. Retire el tubo del imán. Añadir 2 ml de tampón de tipo frío y mezclar suavemente con la pipeta. Muestra de 10 l de suspensión celular, diluir 1: 2 (añadir a 10 l) de azul de tripano para contar las células utilizando un hemocitómetro.

3. Preparación de las células T de células Individual Citometría de Flujo clasificación de células

  1. Añadir tampón de tipo frío a todos los tubos de células (tetrámero no marcado, marcado con tetrámero-un enriquecido, y tetrámero marcado enriquecido) para llevar el volumen a 3 ml.
  2. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células.
  3. Resuspender las células sedimentadas en 25 l de tampón especie frío. Añadir 5 l bloque Fc humana. Incubar en hielo durante 20 min.
  4. Preparar anticuerpos para la clasificación de citometría de flujo. Mezclar 15 l de tampón especie, 15 l anti-CD5, 15 l anti-CD14, y 15 l anti-CD19.
  5. Añadir 20 l de mezcla de anticuerpos a cada tubo de las células. Incubar en hielo durante 20 min.
  6. Añadir 2 ml de tampón de tipo frío a cada tubo.
  7. Centrifugar a 600 xg durante 5 min a 4 ° C y el tampón de decantación para recuperar las células.
  8. Resuspender las células a una concentración de 1 -2 x 10 6 células / ml en tampón de clasificación.
  9. Alícuota de 100 l de medio de cultivo de células humanas T (DMEM de Iscove suplementado con 2 mM Glutamax, HEPES 10 mM, 50 mg / ml de gentamicina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 10% suero AB humano inactivado por calor, y 2,5 humana recombinante ng / ml IL-2) a cada pocillo de una placa redonda de 96 pocillos de cultivo celular de fondo. Mantener en hielo.

4. Aislamiento de células T tetrámero marcado por celda individual Citometría de Flujo Clasificación

  1. Establecer citometría de flujo para identificar los parámetros de compuerta aloantígeno-pMHC tetrámero células T marcados (Figura 2.A). Utilice la fracción tetrámero pre-enriquecimiento etiquetados para establecer gating estrategias para eliminar dobletes, puerta de linfocitos, las células que expresan CD19 excluir B y CD14expresando monocitos, e identificar las células T mediante la expresión CD5. Utilice la muestra no etiquetada con tetrámero como una fluorescencia menos uno de control para establecer la gating para la identificación de las células T tetramer vinculante (con 0% de CD5 + CD14 - CD19 - células de la muestra no etiquetada por tetrámero deben caer dentro de esta puerta) .
    NOTA: Gating estrategias que no son adecuadamente rigurosas dará como resultado el aislamiento de células no T o células T que no son específicas de antígeno, mientras que las estrategias de compuerta excesivamente restrictivas se reducirá el número de células T aisladas.
  2. Programar los parámetros de la placa de la célula única especie. Dirigir el clasificador para colocar un CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero + células en cada pocillo. Dirigir el plato creado para contener 1 pocillo de control negativo (no hay células ordenadas en el pozo) y 1 control positivo también (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetrámero - células) en cada fila (figura 2.B ).
  3. Uso de la citometría de flujo establecido gating estrategia y la configuración de la placa, aislar células individuales de unión tetrámero-T directamente en la placa de 96 pocillos usando un clasificador de células por citometría de flujo.

5. Cultura y expansión de clones aloantígeno-específicos de células T

  1. Después de la finalización de la clasificación de células, la placa se centrifuga a 600 xg durante 5 min a 20 ° C. Lugar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%.
  2. Vortex estimulantes microperlas anti-CD3 / anti-CD28 durante 30 segundos para volver a suspender cuentas.
  3. Calcular el volumen de perlas de activador necesarios para la estimulación de las células T recogidas (0,5 l de microperlas de activador / pocillo). Traslado volumen calculado de cuentas estimuladoras a un tubo de 5 ml estéril. Añadir 1 ml de medio de cultivo de células T humanas y de vórtice.
  4. Coloque el tubo con la suspensión de microperlas en imán. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
  5. Retire con cuidadola tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, contenido del tubo de decantación en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo.
  6. Retire el tubo del imán. Añadir medio de cultivo de células humanas T (100 medianas l / 0,5 l de microperlas añaden inicialmente).
  7. Alícuota de 100 l de suspensión de perlas activador a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%.
  8. Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen microscópico. Pequeños grupos de células proliferantes pueden ser observados microscópicamente después de 5 - 7 días de cultivo (Figura 3.A).
    NOTA: Visualización de cultivos de células T en este punto puede ser difícil, y la ausencia de grupos de células observables en esta etapa puede no ser indicativo de una falta de células T en crecimiento.
  9. A los 14 días después del aislamiento de células, cultivos de alimentación retirando cuidadosamente 100 l de los medios de comunicación fuera de la parte superior de la cultura y la reemplazan con 100 μ; L fresco T humano medio de cultivo celular. Continuar la incubación de placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%.
  10. Monitorear el crecimiento celular diariamente por examen y evaluación de el color del medio de cultivo microscópico. Grupos de células grandes deben ser visibles al microscopio 2 - 3 días después de que el cambio de medio. Macroscópicamente, los sedimentos celulares deben ser visibles durante los 14 días siguientes al cambio de medio.
  11. A los 28 días siguientes de aislamiento de células, identificar clones que crecen por el examen microscópico. Transferir el volumen 200 l de los cultivos en placas de 96 pocillos de crecimiento positivo a pocillos individuales de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos que contenía 200 medio de cultivo de células T humanas l.
  12. Añadir 100 l que contenían 12,5 l de microperlas anti-CD3 / anti-CD28 estimuladoras (preparada como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Incubar placa de cultivo a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%.
  13. Monitorear el crecimiento del cultivo a diario por ex microscópicaaminación y evaluación de el color del medio de cultivo. Cuando el cultivo de células T alcanza> 2x10 6 / ml (típicamente 3-5 días después de la re-estimulación, se puede estimar por el día en que los medios de comunicación comienza girando amarillo paja), la cultura transferencia a un pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y añadir 500 l medio celular humana T.
  14. En 10 a 14 días seguir re-estimulación, recoger 200 l de cultivo de células T para evaluar aloantıgeno especificidad por citometría de flujo análisis de pMHC tetrámero de unión (mediante la estrategia de etiquetado y la compuerta se describe en las secciones 3 y 4.1).

6. A largo plazo Re-estimulación y Cultura de clones de células T

  1. Continuamente re-estimular y expandir los cultivos de células T clonales con la especificidad deseada puede ser cada 14 días. Recoger cultivos de células T en un tubo de 5 ml estéril a 14 días después de la última estimulación microperlas anti-CD3 / CD28. Combinar múltiples pocillos de la misma clon de células T en un solo tubo, hasta un volumen de 2,5 ml.
  2. Añadir medio para llevar el volumen final a 2,5 ml y mezclar suavemente por pipeteado.
  3. Coloque el tubo de 5 ml que contiene el cultivo de células T en el imán de separación de células para eliminar microperlas de edad del cultivo. La tapa debe estar ligeramente encima del tubo. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Retire con cuidado la tapa del tubo. Sosteniendo el tubo y el imán juntos, decantar la suspensión de células en un tubo de 5 ml fresco. No golpee ni sacuda el contenido del tubo para eliminar las últimas gotas de líquido.
  5. Añadir medio para llevar el volumen final a 4 ml. Muestra de 10 l para contar las células utilizando un hemocitómetro.
  6. Recuperar las células T mediante centrifugación a 600 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
  7. Decantar el sobrenadante. Resuspender las células T en 10 6 células / T humanas medio de cultivo celular ml. Transferir 1 ml de alícuotas a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos.
  8. Vuelva a estimular las células T mediante la adición de 100 medios de comunicación l que contenía 12,5 l de estimulante anti-CD3 / amicroperlas nti-CD28 (como se describe en las secciones 5.2 a 5.6). Se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 6%.

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Resultados

Este protocolo describe la generación de cultivos de células humanas T clonal con aloantígeno especificidad definida a través de un enriquecimiento de perla magnética y flujo de una sola célula de clasificación de citometría de estrategia. La Figura 1 proporciona un esquema del proceso.

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Figura 1: Visión general de Protocolo El protocolo aquí d...

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Discusión

La aloreactividad de las células T es un fenómeno largamente estudiado y clínicamente relevante. Las robustas respuestas proliferativas y efectoras de las células T a la estimulación alogénica han permitido un análisis exhaustivo de las respuestas de las células T humanas in vitro a través de reacciones linfocitarias mixtas relativamente sencillas de células T de sangre periférica contra células alogénicas inactivadas. Sin embargo, estas respuestas primarias de células T aloreactivas son oligoclonales, compuesta...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

El autor desea agradecer a la Instalación Central de Terámeros de los NIH por la producción de tetrámeros. El autor también desea agradecer a E.D. O'Connor y K.E. Márquez del laboratorio de citometría de flujo de la Instalación Central de Células Madre Embrionarias Humanas de UCSD por su ayuda en la clasificación de células. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud K08AI085039 (G.P.M.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de extracción de sangre venosa con heparina sódica 16 x 100 mmBecton, Dickenson and Company366480
LymphoprepStemcell Technologies7801
Rosette Sep Kit de enriquecimiento de células T humanasStemcell Technologies15061
PBS de Dulbecco, 1x sin Ca ni MgCorning21-031-CV
Albúminasérica bovinaSigma-AldrichA7906
EDTASigma-AldrichE6635
Tetrámero pMHC marcado con fluoróforos Instalación detetrámeros NIH NA
EasySep Kit de selección de biotinaStemcell Technologies18553
EasySep Imán de selecciónStemcell Technologies18000
TruStain FcX Soluciónde bloqueo de Fc humanoBiolegend422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clon UCHT2)Biolegend300621
Anti-CD14 FITC (clon HCD14)Biolegend325603
Anti-CD19 FITC (clon HIB19)Biolegend302205
DMEM de Iscove, sin b-ME ni L-glutaminaCorning15-016-CV
HEPESCorning25-060-CI
b-Mercaptoetanol Life Technologies21985-023
GlutamaxLife Technologies35050061
Sulfato de gentamicina (50 mg/ml)Suero Omega ScientificGT-50
Human AB, donante masculinoOmega ScientificHS-30
IL-2 humano recombinantePeprotechAF 200-02
Dynabeads Activador T Humano CD3/CD28Vida Tecnologías11131D
Medios
Tampón
PBS, pH 7,41 L
BSA10 g
EDTA (0,5 M)2 ml
cultivo
humanas DMEM de Iscove351,6 ml
Suero AB humano inactivado por calor40 ml
HEPES (1 M)4 ml
Glutamax (100x)4 ml
Gentamicina (50 mg/ml)0,4 ml
b-mercaptoetanol (14,3 M)1,4 ml
IL-2 humana recombinante (1 mg/ml)1 ml
de clasificación de células Medio de de células T

Referencias

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