Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

Resumen

Este artículo describe un método para la generación y propagación de clones de células T humanas que responden específicamente a un aloantígeno definido. Este protocolo se puede adaptar para la clonación de células T humanas específicas para una variedad de ligandos péptidos-MHC.

Resumen

El estudio de la biología de los linfocitos T humanos a menudo implica el examen de las respuestas a los ligandos activadores. Las células T reconocen y responden a los antígenos peptídicos procesados presentados por las moléculas MHC (HLA ortólogo humano) a través del receptor de células T (TCR) de una manera altamente sensible y específica. Mientras que la función principal de las células T es mediar las respuestas inmunitarias protectoras a los antígenos extraños presentados por el autoMHC, las células T responden de forma robusta a las diferencias antigénicas en los tejidos alogénicos. Las respuestas de las células T a los aloantígenos pueden describirse como aloreactividad directa o indirecta. En la aloreactividad, la célula T responde a través del reconocimiento altamente específico tanto del péptido presentado como de la molécula MHC. La robusta respuesta oligoclonal de las células T a la estimulación alogénica refleja el gran número de aloantígenos potencialmente estimuladores presentes en los tejidos alogénicos. Si bien la amplitud de las respuestas de los linfocitos T aloreactivos es un factor importante en el inicio y la mediación de la patología asociada con las respuestas aloreactivas biológicamente relevantes, como la enfermedad de injerto contra huésped y el rechazo del aloinjerto, puede impedir el análisis de las respuestas de los linfocitos T a los ligandos alogénicos. Con este fin, este protocolo describe un método para generar células T aloreactivas a partir de leucocitos de sangre periférica humana (PBL) naïve que responden a aloantígenos peptídicos-MHC (pMHC) conocidos. El protocolo aplica el marcaje de multímeros pMHC, el enriquecimiento magnético de perlas y la citometría de flujo a los métodos de cultivo in vitro de una sola célula para la generación de clones de células T específicas de aloantígenos. Esto permite estudiar la bioquímica y la función de las células T que responden a la estimulación alogénica.

Introducción

Los linfocitos T son componentes críticos del sistema inmune adaptativo. Las células T son responsables de mediar no sólo directamente respuestas inmunes protectoras a los agentes patógenos a través de una variedad de mecanismos efectores, sino también mantener activamente la auto-tolerancia inmunológica y dirigir las respuestas de otras células en el sistema inmune. Estas funciones están dirigidas a través de un número de señales integradas, incluyendo receptores de células T (TCR) de la ligación, citocinas y quimiocinas, y los metabolitos ^1. De estas señales, el TCR es de particular importancia, ya que proporciona la especificidad característica que defi....

Protocolo

NOTA: Este protocolo requiere el uso de muestras de sangre periférica de voluntarios humanos. Todas las investigaciones con seres humanos debe ser revisado y aprobado por un Estudios Humanos Junta de Revisión Institucional para garantizar el cumplimiento de la Declaración de Helsinki (2013) y la Portabilidad del Seguro de Salud y la Ley de Responsabilidad de 1996.

1. Aislamiento de células T de sangre entera

1. Antes de comenzar, calentar el medio de gradiente de densidad a temperatura ambiente. Alícuota 4 ml de medio de gradiente de densidad en 2-4 estériles de 15 ml tubos de centrífuga cónicos (1 tubo será utilizado por cada 10 ....

Resultados

Este protocolo describe la generación de cultivos de células humanas T clonal con aloantígeno especificidad definida a través de un enriquecimiento de perla magnética y flujo de una sola célula de clasificación de citometría de estrategia. La Figura 1 proporciona un esquema del proceso.

Figura 1: Visión general de Protocolo El protocolo aquí d.......

Discusión

La aloreactividad de las células T es un fenómeno largamente estudiado y clínicamente relevante. Las robustas respuestas proliferativas y efectoras de las células T a la estimulación alogénica han permitido un análisis exhaustivo de las respuestas de las células T humanas in vitro a través de reacciones linfocitarias mixtas relativamente sencillas de células T de sangre periférica contra células alogénicas inactivadas. Sin embargo, estas respuestas primarias de células T aloreactivas son oligoclonales, compuesta.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de extracción de sangre venosa con heparina sódica 16 x 100 mm	Becton, Dickenson and Company	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
Rosette Sep Kit de enriquecimiento de células T humanas	Stemcell Technologies	15061
PBS de Dulbecco, 1x sin Ca ni Mg	Corning	21-031-CV
Albúmina	sérica bovinaSigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Tetrámero pMHC marcado con fluoróforos Instalación de	tetrámeros NIH NA
EasySep Kit de selección de biotina	Stemcell Technologies	18553
EasySep Imán de selección	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Solución	de bloqueo de Fc humanoBiolegend	422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (clon UCHT2)	Biolegend	300621
Anti-CD14 FITC (clon HCD14)	Biolegend	325603
Anti-CD19 FITC (clon HIB19)	Biolegend	302205
DMEM de Iscove, sin b-ME ni L-glutamina	Corning	15-016-CV
HEPES	Corning	25-060-CI
b-Mercaptoetanol	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
Sulfato de gentamicina (50 mg/ml)	Suero Omega Scientific	GT-50
Human AB, donante masculino	Omega Scientific	HS-30
IL-2 humano recombinante	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads Activador T Humano CD3/CD28	Vida Tecnologías	11131D
Medios
Tampón
PBS, pH 7,4	1 L
BSA	10 g
EDTA (0,5 M)	2 ml
cultivo
humanas DMEM de Iscove	351,6 ml
Suero AB humano inactivado por calor	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
Glutamax (100x)	4 ml
Gentamicina (50 mg/ml)	0,4 ml
b-mercaptoetanol (14,3 M)	1,4 ml
IL-2 humana recombinante (1 mg/ml)	1 ml

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