La instilación de reactivos intratraqueal mediada por intubación (IMIT) es un método excelente y no invasivo para estudiar las enfermedades respiratorias, así como un método para instilar reactivos terapéuticos directamente en el pulmón. Es un método rápido y altamente reproducible que es adecuado para pruebas preclínicas.
Artículo de método
La intubación mediada intratraqueal (IMIT) instilación: A, Sistema de Entrega de pulmón-específica no invasiva
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Resumen
Resumen
Estudios de enfermedades respiratorias típicamente implican el uso de modelos murinos como sistemas sustitutos. Sin embargo, hay diferencias fisiológicas significativas entre el murino y los sistemas respiratorios humanos, especialmente en sus vías respiratorias superiores (URT). En algunos modelos, estas diferencias en la cavidad nasal murino pueden tener un impacto significativo sobre la progresión de la enfermedad y la presentación en el tracto respiratorio inferior (LRT) cuando se utilizan técnicas de instilación intranasal, limitando potencialmente la utilidad del modelo de ratón para estudiar estas enfermedades. Por estas razones, sería ventajoso desarrollar una técnica para inculcar bacterias directamente en los pulmones del ratón con el fin de estudiar la enfermedad LRT en ausencia de afectación de la URT. Hemos denominado este mediada por la intubación intratraqueal técnica de entrega (IMIT) la instilación específica del pulmón. Esta técnica no invasiva minimiza el potencial para la instilación en el torrente sanguíneo, lo cual puede ocurrir durante traditi más invasivaonal enfoques quirúrgicos intratraqueales infección, y limita la posibilidad de entrega tracto digestivo incidental. IMIT es un proceso de dos pasos en el que los ratones son intubados primero, con un paso intermedio para asegurar la colocación correcta del catéter en la tráquea, seguido por la inserción de una aguja roma en el catéter para mediar la entrega directa de las bacterias en el pulmón. Este enfoque facilita una eficacia> 98% de la ejecución en los pulmones con una excelente distribución de reactivo de todo el pulmón. Por lo tanto, IMIT representa un nuevo enfoque para estudiar la enfermedad LRT y suministro terapéutico directamente en el pulmón, la mejora de la capacidad de utilizar los ratones como sustitutos para estudiar la enfermedad respiratoria humana. Además, la exactitud y reproducibilidad de este sistema de administración también hace que sea susceptible de Normas de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), así como la entrega de una amplia gama de reactivos que requieren la entrega de alta eficiencia en el pulmón.
Introducción
Los ratones se han utilizado para modelar numerosas manifestaciones de enfermedades humanas, incluyendo una gran variedad de enfermedades respiratorias. Modelos de enfermedades sustitutos son a menudo incapaces de recapitular todos los aspectos de una enfermedad modelado, por lo general debido a la fisiológica importante o diferencias inmunológicas en los dos modelos de acogida. Por lo tanto, un objetivo de la mejora de los sistemas de modelo es el desarrollo de métodos que permitan a los sustitutos reflejan más de cerca un proceso de enfermedad o de acogida que la respuesta observada en el sistema host original. Hay varias diferencias fisiológicas clave entre ratones y seres humanos en el mecanismo por el que se inspiran aire. Se incluyen en estas diferencias son diferencias significativas en el tamaño radiométricos entre la URT y LRT. Se ha estimado que los ratones que poseen> 100 veces el área de superficie URT relativa a los seres humanos, normalizado contra el total de la capacidad pulmonar 1,2. Por lo tanto, los cornetes nasales del ratón permiten más extensa de filtrado de aire inspirado para facilitar una mayor tasa de breathing, que puede tener un impacto significativo en los estudios de neumonía si la infección de la cavidad nasal juega un papel importante en la progresión de la enfermedad.
Se han empleado varios enfoques diferentes para infundir bacterias en los pulmones de ratones para estudiar la enfermedad respiratoria similar a la humana. El más común de estos enfoques es la inoculación intranasal, en el que se aplica una suspensión líquida en uno o ambos orificios nasales de un ratón. Aunque es relativamente sencillo, advertencias, como el volumen de la instilación y el tipo de anestesia que se utiliza puede afectar la eficiencia de la instilación en la LRT a través de la inoculación intranasal 3-5. Específicamente, Miller et al. han mostrado que la instilación intranasal de Francisella tularensis en los volúmenes de menos de 50 l no dio lugar a la instilación de las bacterias en la LRT 6. Observaron además mejor instilación LRT al utilizar isoflurano inhalado en lugar de inyectar ketamina / xilacina para la anestesia. Sin embargo, nuestra experience con Yersinia pestis inoculación intranasal indica la inoculación más consistente se puede lograr usando ketamina / xilacina en comparación con isoflurano (MBL, datos no publicados). Estas diferencias podrían atribuirse a patógeno utilizado o a la variación en los procedimientos de laboratorio, pero importante destacar la variabilidad potencial en esta técnica. Además, los pulmones cosechadas poco después de la instilación intranasal muestran que un porcentaje relativamente bajo del inóculo bacteriano inicial alcanza el pulmón (en el caso de Y. pestis, sólo el 10% se recuperaron 1 hr después de la instilación 7), lo que sugiere que un gran número de bacterias podría ser retenido en la URT (o se ingiere en el tracto gastrointestinal). En ciertos modelos de enfermedad, esta deposición significativa de bacterias en la mucosa URT puede confundir nuestra comprensión de la evolución de la enfermedad si el organismo es capaz de colonizar la cavidad nasal murino de manera incompatible con la enfermedad humana. Por ejemplo, el uso in vivo </ Em> de imágenes, se ha observado que Burkholderia pseudomallei, que no colonizan la URT humano, causa una infección oportunista abrumadora de la cavidad nasal murino cuando se entrega por el método de la instilación intranasal 8.
Otros métodos para inculcar bacterias en los pulmones de ratones también se han empleado en investigación de enfermedades infecciosas. Sin embargo, en comparación con la instilación intranasal estos métodos tienden a requerir más conocimientos técnicos y / o un equipo costoso, sin eliminar el potencial para la iniciación de la infección en múltiples sitios (por ejemplo, aerosol [URT y LRT]; transoral [tracto digestivo y LRT]; y intratraqueal quirúrgica [LRT y corriente de la sangre]). Dadas las complicaciones potenciales que podrían estar asociados con los sitios secundarios de la infección, hemos tratado de desarrollar un enfoque intratraqueal que no pasa por la URT y entrega patógeno directamente en los pulmones de ratones anestesiados, pero también limita inoculados inadvertidade iones en el torrente sanguíneo o en el tracto GI. Hacia este fin, intratraqueal (IMIT) instilación intubación mediada fue desarrollado como un procedimiento no quirúrgico que garantiza LRT instilación de inóculo mediante la inclusión de un paso intermedio para verificar la colocación del catéter adecuado antes de la instilación. Este método se describe usando el tinte de la instilación de demostrar visualmente amplia distribución del inóculo en todo el pulmón, y P. aeruginosa instilación para demostrar la entrega altamente eficaz (> 98% del inóculo) de este método para el pulmón. Es importante destacar que, mientras que originalmente desarrollado para la entrega bacteriana, IMIT también ofrece una herramienta eficaz para: i) la instilación de diferentes moléculas para el estudio de otros modelos de enfermedades respiratorias, ii) la entrega terapéutico-pulmonar específica, y iii) los estudios de función pulmonar básica, incluyendo dirigido siRNA entrega al pulmón.
Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos descritos aquí fueron revisados y aprobados por la Universidad de Louisville Comité Institucional de Bioseguridad (protocolo # 13-056) e Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (protocolo # 13-064).
1. Preparación del Tinte
- Diluir 0,1% (w / v) azul brillante de Coomassie en PBS y esterilizar filtro utilizando un filtro de jeringa de 0,45 mM.
2. Preparación de Pseudomonas aeruginosa Cultura
- 15 horas antes de la instilación, se inoculan 3 ml de caldo de cultivo con una sola colonia bacteriana.
- Crece la cultura hr 15 a 37 ° C en un agitador (200 rpm).
- Centrifugar 1 ml de cultivo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml 12.000 xg durante 30 seg.
- Retire el medio y volver a suspender el sedimento en 1 ml de PBS.
- Diluir una alícuota de la suspensión bacteriana Stock 1:10 en PBS y medir el OD 600 de la suspensión bacteriana diluida para determinar elconcentración bacteriana.
- Diluir la suspensión bacteriana de valores en PBS a la concentración deseada de inóculo bacteriano, utilizando un volumen de entrega de 50 l para la inoculación IMIT.
3. IMIT instilación
- Colocar un grupo de ratones en la cámara de inducción de anestesia con isoflurano y anestesiar utilizando un 2 - mezcla de isoflurano / oxígeno del 3%.
- En el inicio de la sedación inicial, pescuezo del ratón, sostiene el ratón en posición vertical, y administrar 10 l de una solución de lidocaína al 2% en aguja de sonda a la parte posterior de la garganta y permitir que la solución fluya hacia abajo para la epiglotis. Devuelva el ratón a la cámara de la anestesia.
- Deje un mínimo de 5 minutos para permitir la lidocaína a surtir efecto completo como anestésico local.
- Cuando los ratones han alcanzado el nivel deseado de sedación (tasa de ~ 60 bpm de respiración), reducir el isoflurano al 2% para mantener la sedación.
- Precarga tinte o inóculo bacteriano en un 250 l hermética a los gasesen forma de jeringa de precisión con una aguja roma largo 22 G.
- En primer lugar la elaboración de 150 l de aire, medida por el émbolo de teflón de la jeringa. A continuación, la elaboración de 50 l de inóculo haciendo avanzar el émbolo de teflón de la marca de 150 l hasta la marca de 200 l en el cuerpo de la jeringa.
NOTA: Cuando la muestra es expulsada en un ratón intubado, la suspensión 50 l será entregado primero, seguido por un cojín de aire 150 l que distribuirá el inóculo en todo el pulmón.
- En primer lugar la elaboración de 150 l de aire, medida por el émbolo de teflón de la jeringa. A continuación, la elaboración de 50 l de inóculo haciendo avanzar el émbolo de teflón de la marca de 150 l hasta la marca de 200 l en el cuerpo de la jeringa.
- Retire un ratón desde la cámara de inducción y poner en posición supina sobre una plataforma de intubación. Asegure el ratón a la plataforma enganchando sus incisivos con una junta tórica adjunta a la tira de velcro, y asegurar el velcro a la plataforma. Levante el ratón a una inclinación de 45 °.
- El uso de un aplicador de micro algodón, retraer la lengua con un movimiento de balanceo, utilizando la mano dominante.
- Con la mano no dominante, utilice un ajuste otoscopio operando con un espéculos intubación tanto maintain retracción de la lengua y visualizar la glotis.
- Con la mano dominante, utilice un alambre de guía roscada a través de un catéter de 20 G de intubar el ratón, asentar el catéter a una profundidad de 10 mm en la tráquea de ratón (catéter está en forma de un manguito de silicio con 10 mm de catéter expuesto). Retire el otoscopio / espéculos.
- Confirmar que el ratón ha sido intubado correctamente por asegurar el catéter con la mano no dominante mientras se coloca brevemente una longitud conectado Luer de 1/16 "tubo transparente que contiene un colorante de color.
NOTA: El tinte migrar rápidamente hacia atrás y adelante en respuesta a la respiración. - No continúe con los pasos siguientes, si la confirmación de la intubación no se ha establecido en este punto. Si la intubación intentado realizar falló, restablecer el alambre y catéter guía para un intento adicional en la intubación.
NOTA: Es aconsejable intentar más de dos intubaciones de un ratón en una sesión sin causar traumatismo en el ratón. - Continuarasegurar el catéter con la mano no dominante, mientras que la inserción de la / aguja roma jeringa de precisión que contiene el amortiguador de suspensión líquido / aire.
- Dispensar el líquido / aire directamente en el pulmón en un solo movimiento fluido y retire inmediatamente la aguja / catéter del ratón.
- Devuelva el ratón a una jaula y permitir la recuperación de la anestesia.
4. Caracterización de las IMT Entrega
- Después de la instilación IMIT, la eutanasia el ratón por asfixia de CO 2 en un momento apropiado después de la inoculación.
- Asegure el ratón sacrificados en un tablero de disección y tomar el pecho y el abdomen con EtOH al 70% utilizando una jeringa.
- Si la evaluación de la distribución de un agente de imagen en todo el pulmón, eliminar los pulmones de los animales utilizando una técnica estéril y mostrar los pulmones en su caso para la imagen.
NOTA:. Los pulmones pueden ser preparados por técnicas de tinción histológicas adicionales a través de la fijación o la criopreservación apropiado - Si la evaluación de la carga bacteriana del tejido pulmonar infectado, eliminar los pulmones del animal utilizando una técnica estéril. Coloque los pulmones en un estéril, previamente pesado 1 oz bolsa de muestra. Pesar y registrar el peso de la bolsa de muestra + pulmones.
- Añadir 1 ml de PBS 1x estéril a cada bolsa de tejidos + muestra. Vuelva a sellar la bolsa de muestra.
- Homogeneizar los tejidos por una suave rodando 25 ml pipeta serológica sobre la bolsa de muestra + tejido.
- Generar diluciones seriadas del homogeneizado de pulmón en PBS estéril y placa en placa de agar (LB, o en su caso de las especies de bacterias en estudio):
- Llevar a cabo una dilución en serie de seis veces en una placa de fondo en U 96 por pipeta multicanal a continuación, la placa muestras por triplicado por multicanal en la placa de agar.
- Incubar las placas de agar durante la noche a 37 ° C y enumerar unidades formadoras de colonias al día siguiente.
Resultados
Para visualizar la distribución del material instilado mediante el método IMIT, se instilaron 50 µl de colorante azul brillante de Coomassie al 0,1 % en los pulmones de un ratón anestesiado. El ratón fue sacrificado inmediatamente y los pulmones se extrajeron mediante necropsia estéril. Figura 1 muestra que el colorante se distribuyó en todos los lóbulos del pulmón.
Para determinar la cantidad de bacterias administradas a los pulmones mediante el método IMIT, tres grupos de ratones (n = 3) recibieron instilaciones con tres concentraciones diferentes de P. aeruginosa (1,21 x 108, 1,21x107, y 1,21 x 106 unidades formadoras de colonias [UFC] por 50 µl). Inmediatamente después de la instilación de IMIT, los ratones fueron sacrificados, se extrajeron los pulmones y se cuantificaron los números bacterianos, comparándolos con el inóculo (Figura 2). La administración del inóculo es altamente eficiente mediante este método, con >98% del inóculo recuperado de los pulmones de los animales instilados. Además, la instilación IMIT fue altamente reproducible independientemente de la concentración del inóculo (R2 = 0.9951).
Figura 1: La instilación IMIT distribuye el inóculo a través de los pulmones. Los pulmones de ratones instilados con 50 µl de Azul Brillante de Coomassie al 0,1 % muestran distribución del colorante azul en todos los lóbulos.
Figura 2: Instilación de bacterias en los pulmones mediante IMIT. Se instilaron ratones con P. aeruginosa y se comparó el número de bacterias instiladas en los pulmones (Log10 UFC – recuperadas) con el inóculo estimado (Log10 UFC – administradas). Cada círculo representa la UFC/pulmón de un ratón individual (n = 3 para cada dosis bacteriana).
Discusión
La instilación IMIT ofrece mejoras clave a los modelos de enfermedades respiratorias existentes en la capacidad de instilar reactivos de manera reproducible directamente en el pulmón. Es un enfoque rápido que está idealmente situado para un equipo de dos investigadores, uno de los cuales gestiona la logística de la anestesia y el enjaulamiento, y el otro que realiza la técnica IMIT. Se pueden realizar estudios grandes utilizando IMIT con un compromiso de tiempo promedio de 2 a 3 minutos por ratón. Debido a que el enfoque utiliza isoflurano como anestésico, los ratones se recuperan rápidamente de la anestesia, lo que reduce el tiempo de cría de los animales durante la recuperación.
El aspecto técnicamente más desafiante del método IMIT es el paso inicial de intubar ratones. Las personas que aprenden a realizar IMIT pueden concentrarse en este primer paso de colocación del catéter y asegurarse de que la intubación se haya logrado a través de la confirmación visual del movimiento del tinte. El beneficio del enfoque es que la instilación específica del pulmón está garantizada mediante el uso de la confirmación de la intubación, lo que aumenta la confianza tanto del nuevo investigador como del experto que intenta intubar a un animal difícil. Los elementos clave para optimizar la probabilidad de una intubación exitosa son: i) lograr una sedación profunda para permitir un tiempo de trabajo suficiente, ii) colocación correcta de los espéculos en la boca para permitir una buena visualización de la epiglotis, iii) buena colocación profunda de los espéculos para que la lengua permanezca retraída durante todo el procedimiento, y iv) uso de la plataforma basculante para apoyar las manos del investigador para que el procedimiento se realice relajado y con un enfoque constante.
Una de las limitaciones del procedimiento IMIT está relacionada con la frecuencia de los eventos de instilación IMIT. Debido al posible trauma asociado con una intubación perdida, no se recomienda que se realicen más de dos intentos de intubación en una sola sesión (hasta dos fallas). La IMIT tiene un excelente potencial en su capacidad para ser utilizada para administrar terapias en el pulmón murino, sin embargo, los regímenes terapéuticos que utilizan la administración muy frecuente de reactivos en el pulmón pueden no ser adecuados para la IMIT. Es posible que IMIT se pueda usar diariamente para administrar reactivos en un pulmón murino sin causar un trauma significativo, pero solo cuando lo realiza un investigador altamente calificado, ya que se cree que la mayoría de los traumatismos asociados con la intubación se asocian con un evento de intubación perdido. Este IMIT de alta frecuencia debe discutirse con veterinarios locales e IACUC.
Una limitación potencial adicional de IMIT es el tamaño del ratón que se está intubando. El procedimiento IMIT descrito anteriormente se desarrolló utilizando ratones de aproximadamente 17 a 22 g, donde se encontró que un catéter de 20 G era de un tamaño adecuado para la tráquea de ratones en este rango de tamaño. Los catéteres más grandes se han utilizado con éxito en ratones más viejos; el desarrollo inicial de IMIT hizo uso de un catéter de 18 G en ratones BALB/c que son >20 g. Es importante destacar que, si se utilizan tamaños de catéter alternativos, se deben obtener agujas romas que se ajusten a la luz del catéter y se recorten a una longitud que se extienda solo 1 mm más allá de la punta del catéter. La intubación de ratones de menos de 17 g puede ser posible, pero no se recomienda debido a la experiencia requerida, y requeriría el uso de catéteres y espéculos más pequeños que los descritos anteriormente.
Hemos utilizado IMIT para la administración de varios patógenos respiratorios además de P. aeruginosa, incluidos B. pseudomallei9 y Klebsiella pneumoniae10. El modelo IMIT ha logrado avances importantes en nuestros estudios de la enfermedad respiratoria de B. pseudomallei , habiendo identificado que la inoculación intranasal causa una morbilidad temprana relacionada con la URT en ratones en lugar del criterio de valoración de la enfermedad sistémica observado en la enfermedad humana9. B. pseudomallei es un agente selecto de nivel 1 de impacto de biodefensa y, como tal, se están desarrollando modelos de enfermedades respiratorias para la exposición a aerosoles que modelan una posible ruta de entrada relacionada con la biodefensa para patógenos armados. Debido a que los modelos de aerosol actuales dan como resultado la infección tanto de la URT como de la LRT, los mismos fenotipos de morbilidad temprana potencial que hemos identificado para el modelo intranasal de la enfermedad respiratoria de B. pseudomallei pueden aplicarse al modelo de aerosol. Una adaptación futura del modelo IMIT podría ser una administración de aerosol mediada por intubación (IMAD), en la que los ratones son intubados para la administración de aerosol objetivo solo en el pulmón. Actualmente hay ventiladores mecánicos disponibles para mantener la anestesia con isoflurano, que podría adaptarse para administrar un desafío patógeno en aerosol, en lugar de líquido.
IMIT se desarrolló inicialmente como un enfoque para optimizar la administración de bacterias al pulmón, pero también tiene aplicación para la administración de otros reactivos en el pulmón del ratón. Como se discutió anteriormente, la administración intranasal de compuestos en ratones da como resultado una administración de reactivos altamente variable y de baja eficiencia en el órgano diana del pulmón. La administración intranasal de reactivos de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) al pulmón murino produjo una eficiencia de administración del 40%11, mientras que hemos demostrado que IMIT ofrece una excelente alternativa a otros enfoques de administración pulmonar con su eficacia de administración del >98% y distribución multilobar. Esta mejora en la administración dirigida al pulmón tiene el potencial de aumentar la reproducibilidad de la administración terapéutica para el tratamiento de la enfermedad pulmonar. IMIT podría ofrecer beneficios similares a los estudios de: i) el impacto de los irritantes pulmonares ambientales, ii) estudios fenotípicos de cáncer de pulmón, iii) eliminación de ARNip específicos de pulmón.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores están agradecidos por el apoyo de las instalaciones centrales del Centro de Modelos Animales de Medicina Predicativa (Carol Vanover, Ashley Biller y Jennifer Kraenzle) y Microbiology (Daniel Cramer y Julie Sotsky). Este trabajo fue apoyado por fondos de los NIH (HHSN272201000033I a M.B.L y J.M.W.).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Roedor, Soporte de trabajo basculante | Hallowell EMC | 000A3467 | La base debe separarse cuando se trabaja en un BSC |
| Cabezal de Otoscopio | Operativo Welch Allyn | 21700 | |
| Otoscopio 3.5 V Li Batería | Welch Allyn | 71900 | |
| Ratón Intubación Espéculos cortos, Autoclavable | Hallowell EMC | 200A3589S | |
| Bucles Incisivos Hallowell | EMC | 210A3490A Aplicador de punta fina | |
| algodón | Puritan | 871-PC DBL | Se utiliza para la retracción de la lengua |
| Catéter intravenoso, 20 G | Exel Int | 26741 | Opcional: ajuste un manguito de silicona con una superficie de catéter expuesta de 10 mm |
| Jeringa hermética al gas, 250 ul | Hamilton | 81120 | Se utiliza para la administración de inóculo líquido por IMIT |
| Aguja roma, 22 g | Hamilton | 91022 | Recorte a la longitud para que sobresalga 1 mm del catéter de 20 G |
| Cable guía (cable de fibra óptica, 0,5 mm) | TheFiberOpticStore.com | FOF .50 | Cortado a 6" de longitud: utilizado como alambre guía para la intubación |
| Jeringa de tuberculina, 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | Ensamble con cable de fibra óptica como cable guía |
| Brilliant Blue R (Coomassie) | Sigma | B0149 | |
| Tygon tubing, 1/16 " | Saint Gobain | ALC00002 | |
| Luer macho 1/16" lengüeta | Cole Parmer | 45503-22 | |
| Luer hembra 1/16" lengüeta | Cole Parmer | 45500-00 | |
| Lidocaína, USP | Spectrum | LI102 | pH lidocaína en solución al 2% (p/v) pH7.0 |
| Bolsa de muestra, 1 oz | Whirl-Pak | B01067 | |
| Placa de 96 pocillos con fondo en U, Greiner estéril | 650161 |
Referencias
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