El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.
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Artículo de método
Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios
En este artículo
Resumen
Resumen
Las células madre pluripotentes poseen la capacidad de proliferar indefinidamente y de diferenciarse en casi cualquier tipo de célula. Además, el desarrollo de técnicas para reprogramar células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ha generado interés y entusiasmo hacia la posibilidad de una medicina regenerativa personal personalizada. Sin embargo, la eficiencia de la diferenciación de las células madre hacia un linaje deseado sigue siendo baja. El propósito de este estudio es describir un protocolo para derivar epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células iPS (iPS-EPR) mediante la aplicación de un enfoque de ingeniería de tejidos para generar poblaciones homogéneas de cuerpos embrioides (EB), un intermediario común durante la diferenciación in vitro. El protocolo aplica la formación de tamaños específicos de EB utilizando la tecnología de placas de micropocillos. También se explican los métodos para identificar marcadores de proteínas y genes de EPR mediante inmunocitoquímica y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). Finalmente, se describe la eficiencia de la diferenciación en diferentes tamaños de EBs monitorizados por el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de marcadores RPE. Estas técnicas facilitarán la diferenciación de las células iPS en EPR para futuras aplicaciones.
Introducción
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son un tipo de células madre pluripotentes obtenidas por la reprogramación de células adultas con factores extrínsecos 1. En contraste, las células madre embrionarias (CES), otro tipo de células madre pluripotentes, se generan a partir de la masa celular interna del blastocisto 2-3. A pesar de sus diferentes orígenes, las células iPS y las CME son comparables en su ilimitada capacidad para replicarse in vitro y en su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula 4-5. Estas características de las células iPS les hacen candidatos ideales para aplicaciones en medicina rege....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos de cultivo y placas de cultivo
- Preparar medio de cultivo de células madre alimentador libre mediante la adición de 100 ml de suplemento de suero libre de 5x a 400 ml de medio basal de células madre. El medio es estable a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas y a -20 ° C durante 6 meses.
- Añadir 10 mM solución de Rho-asociado, espiral de la bobina que contiene la proteína quinasa (Rock) inhibidor (Y-27362) al cuerpo embrioide (EB) Medio de formación disponibles en el mercado.
- Preparar medio de diferenciación mediante la adición de 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 2 mM L-glutamina, la....
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Resultados
En este experimento, las células iPS fueron cultivadas y diferenciarse en el linaje RPE de EBS. EBS de tamaños controlados se formaron utilizando placas de micropocillos. Como se ve en la figura 1 la formación de EB fue homogénea en las placas de micropocillos. Estos EB fueron recogidos y se sembraron en placas de 6 pocillos (Figura 2).
RPE puede ser identificado por su clásica hexagonal morfología, pigmentación, y la expresión de marcadores de RPE. Después .......
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Discusión
Para conseguir plenamente las promesas de las células madre pluripotentes para la terapia celular, es necesario regular su diferenciación de una manera consistente y reproducible. Este informe describe los protocolos para formar EBS tamaño controlado utilizando la tecnología de placas de pocillos, iniciar la diferenciación hacia RPE e identificar marcadores de proteínas y genes de RPE. Para sincronizar la diferenciación in vitro, tamaños homogéneos de EB fueron formados por un número conocido de células iPS cen.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las opiniones o afirmaciones contenidas en este documento son los puntos de vista privados de los autores y no deben interpretarse como oficiales ni reflejar los puntos de vista del Departamento del Ejército o del Departamento de Defensa. Esta investigación se llevó a cabo mientras los autores Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene y Jae-Hyek Choi tenían una beca de investigación postdoctoral del Consejo Nacional de Investigación en la USAISR. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de Medicina de Rehabilitación Clínica del Ejército de los Estados Unidos (CRMRP) y el Programa de Investigación de Medicina Operativa Militar (MOMRP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| mTeSR1 media + 5x suplemento | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Inhibidor de rocas) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Aminoácidos no esenciales | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Suero knockout reemplazo | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicina | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamina | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM medios | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 suplemento | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Hidrocortisona | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovino Hiclon sérico | (Fisher) | SH3008803HI | |
| Triyodo-L-tironina sodio sal | Sigma | T6397 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | S5881 | |
| Dispasa | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | Hiclon (Fisher) | 10010-023 | |
| Placa Aggrewell 400 | Tecnologías de células madre | 27940 | |
| Medio AggreWell | Tecnologías de células madre | 5893 | |
| Accutase | Tecnologías de células madre | 7920 | |
| BD Cytofix/Kit de fijación/permeabilización Cytoperm BD | Biosciences | 554714 | |
| Anticuerpo anti-PAX6 de ratón | Estudios de desarrollo Banco | ||
| Conejo Anticuerpo anti-RX | Abcam | Ab23340 | |
| Ratón Anticuerpo anti-MITF | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Conejo Anticuerpo anti-ZO-1 | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | Promega | M7502 | |
| Kit de ARN a ADNc de alta capacidad | Life Technologies | 4387406 |
Referencias
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol
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Reimpresiones y permisos
