Artículo de método

Infrarrojo Cercano (NIR) Luz aumenta la expresión de un marcador de la función mitocondrial en el ratón vestibular sensorial Epitelio

DOI:

10.3791/52265

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14 de marzo de 2015

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1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney

En este artículo

Resumen

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La disfunción mitocondrial es una característica de la senescencia celular. En este trabajo se utiliza el tratamiento no invasivo de infrarrojo cercano (NIR) para mejorar la función mitocondrial en el ratón epitelio sensorial vestibular envejecimiento.

Resumen

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Las estrategias para atenuar la disminución en la función del equilibrio con la edad son predominantemente centrada en terapias físicas que incluyen tareas de equilibrio y ejercicios. Sin embargo, estos enfoques no abordan las causas subyacentes del declive de equilibrio. Utilizando ratones, se evaluó el impacto de la luz del infrarrojo cercano (NIR) en el metabolismo de las células en el epitelio sensorial vestibular. Los datos recogidos muestran que esta intervención simple y seguro puede proteger estas células vulnerables de los efectos perjudiciales del envejecimiento natural. ARNm se extrajo a partir del epitelio sensorial vestibular periférica aislada (ampullaris crista y la mácula del utrículo) y posteriormente se transcribe en una biblioteca de ADNc. Después, esta biblioteca se probaron para la expresión de antioxidante ubicua (SOD-1). Entonces Antioxidante expresión génica se utilizó para cuantificar el metabolismo celular. Utilizando la entrega transcraneal de Nir en jóvenes (4 semanas) y mayores (8-9 meses) los ratones, y un régimen de tratamiento breve (90 seg / día durante 5 díasays), este trabajo sugiere Nir solo puede ser suficiente para mejorar la función mitocondrial en el epitelio sensorial vestibular. Dado que actualmente no hay métodos disponibles, asequibles, no invasivos de la terapia para mejorar la función de las células ciliadas vestibulares, la aplicación de radiación NIR externa proporciona una posible estrategia para contrarrestar el impacto del envejecimiento en el metabolismo celular enel epitelio sensorial vestibular.

Introducción

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Disminución en los resultados equilibrio y caídas posteriores son comunes, y por desgracia a menudo características definitorias de envejecimiento natural 1. El impacto de esta disminución puede ser tanto físico y social, y reduce significativamente la calidad de vida de las personas mayores. En respuesta, las terapias físicas y de rehabilitación han sido el foco de la investigación de cataratas, pero no se han asociado con la reducción constante en la prevalencia de caídas repetidas. Al mismo tiempo, el trabajo de investigación de los cambios en el sistema vestibular periférico o central (el sistema responsable de mantener el equilibrio) es escasa, y posibles estrategias terapéuticas dirigidas a estos sistemas y las causas subyacentes del desequilibrio limitado.

Trabajos recientes sobre los trastornos neurodegenerativos asociados con la edad, incluyendo la degeneración macular relacionada con la edad 2-4, modelos de enfermedad de Alzheimer 5-8, y la enfermedad de Parkinson 9-12 han demostrado efectos neuroprotectores de simple aplicación no invasiva de infrarrojo cercano (NIR) la luz. Además, en el sistema vestibular, NIR se ha utilizado para aumentar la actividad de las neuronas aferentes primarias vestibulares in vitro 13. Aunque no se entiende bien el mecanismo de la luz NIR, la mayoría de los estudios que utilizan NIR han sugerido que NIR estimula las mitocondrias complejo IV (citocromo c oxidasa) 14-17 para facilitar el metabolismo celular. En el epitelio sensorial vestibular la placa subcuticular de células que el cabello de tipo es denso en las mitocondrias de 18 años y, como tal, puede representar un punto de acción para el tratamiento terapéutico NIR.

Aquí, una breve régimen, el tratamiento no invasivo de transcraneal aplica NIR que se puede utilizar para medir el metabolismo celular (y por implicación, la función mitocondrial) en el ratón epitelio sensorial vestibular se describe. También se discutió es una preparación del epitelio sensorial vestibular y se muestra que NIR aumenta la expresión de un ubiquitonos anti-oxidante (superóxido dismutasa 1) en el epitelio sensorial - previamente demostrado ser importante para la supervivencia de las células ciliadas cóclea 19.

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Protocolo

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Declaración de Ética: Todos los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por la Universidad de Comité de Ética Animal Sydney.

1. Los animales

NOTA: 1 y 8 - Un 9 meses de edad ratones (C57 / BL6) se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia). Los animales fueron alojados en el Fondo para Bosch de roedores en la Universidad de Sydney.

  1. Ratones Casa en jaulas estándar del ratón en un 12/12 horas de luz / oscuridad ciclo con el acceso a alimentos y agua ad libitum.
  2. Divida a los ratones en cada grupo de edad en el infrarrojo cercano (NIR) tratados o tratamiento simulado (control) grupos de comparación.

2. Infrarrojo Cercano (NIR) Irradiación y Sham Tratamiento

  1. Afeitarse la piel en la región de la cabeza y el cuello del ratón con una afeitadora eléctrica tan estrechamente como sea posible para prevenir el rebrote rápida del cabello antes de la finalización del régimen de tratamiento. A fin de mantener el estado libre de patógenos de los ratones, utilice etanol al 70%para limpiar instrumentos entre los animales afeitado y desinfectante veterinaria F10 entre los animales de jaulas separadas. Haga esto 2-3 días antes del comienzo del tratamiento para que los animales no son excesivamente manipulado.
  2. Restringir ratón manteniendo el extremo proximal de la cola y dejar que se relaje en la palma de una mano o de banco con el fin de minimizar el estrés que podría conducir a resultados falsos.
  3. Sostenga el NIR (670 nm) LED (diodo emisor de luz) dispositivo 1-2 cm de distancia de la zona expuesta (rebajado) y encienda el dispositivo durante 90 segundos (Figura 1).
    NOTA: El cambio de temperatura como resultado de 90 segundos de exposición se midió como <0,2 ° C en 100 ml de agua.
  4. Repita los pasos 2.2 a 2.3 para el grupo de tratamiento simulado de los animales, pero deje el dispositivo apagado (Figura 1B).
  5. Repita los pasos 2.2 a 2.3 para el grupo de tratamiento bloqueado-NIR de los animales, pero cubre el dispositivo con papel de aluminio.
  6. Repita los pasos 2.2 a 2.5 días a las approximatintervalos hr e 24 durante 5 días consecutivos.
  7. Extraer el epitelio vestibular sensorial (3 crestas y 1 mácula utricular) de ambos oídos en el post-tratamiento quinto día (véase la sección 3).

3. Extracción de tejido 20

  1. Preparar 300 ml de un fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF) basado en glicerol que consiste en (en mM): 26 NaHCO3, 11 glucosa, 250 glicerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2, y 2.5 CaCl 2. Antes de la adición de CaCl2, gas la solución con carbógeno (95% de O2 y 5% de CO 2) para establecer un pH de 7,4 y evitar la precipitación de calcio (nubosidad). Enfriar la solución en un congelador a -80ºC durante 45 min de manera que se forma una suspensión de hielo.
  2. Preparar el tampón de lisis aislamiento de ARN en microtubos de tapa de rosca marcados (se detiene el estallido de las tapas cuando los cambios de presión del tubo entre la congelación y descongelación en nitrógeno líquido) de acuerdoa las instrucciones del fabricante o las prácticas habituales de laboratorio. Tener nitrógeno líquido listo en un frasco Dewar de aluminio.
    NOTA: Utilice ropa protectora y eyeware al manejar nitrógeno líquido. Asegúrese de que se utiliza nitrógeno líquido en una habitación bien ventilada, ya que el volumen de su forma de gas es aproximadamente 700 veces mayor que la de su forma líquida y puede causar asfixia.
  3. Profundamente anestesiar a los ratones con ketamina (400 mg / kg) a través de una inyección intra-peritoneal. Deje que el reflejo de las extremidades posteriores se desplome por completo como indicación de que los ratones están completamente anestesiados.
  4. Decapitar a los ratones con tijeras de acero inoxidable afiladas y hacer una incisión a lo largo de la piel sagital del cráneo usando una cuchilla de afeitar (redondeado # 22). En este punto y los pasos a lo largo de 3.5 a 3.9, mantener la bóveda del cráneo, el cerebro y aparato vestibular subyacente lo más fresco posible por la aplicación regular de ACSF helada sobre el tejido.
  5. Utilizando el brazo con punta de tijeras patrón estándar hacer una Small incisión en el cráneo en Lambda y cortar a lo largo de la sutura sagital.
  6. Deslice suavemente un brazo de una gubia poco profundas debajo del hueso parietal de mantenimiento de la cuchilla lo más cerca posible a la superficie inferior del hueso sin arrastrar el cerebro. Seguros y alejarse del hueso parietal lateral y el hueso occipital posterior hasta que se vea el cerebro.
  7. Use una pequeña espátula de acero inoxidable y levante el cerebro lejos de la anterior y la fosa craneal media para exponer el nervio vestíbulo coclear (CN VIII). Seccionar el nervio para evitar tensiones innecesarias en los axones aferentes primarias que inervan directamente las células ciliadas vestibulares.
  8. Retire el cerebro en su totalidad después de la sección del CN VIII.
  9. Observe el laberinto óseo contiene la cóclea y los órganos vestibulares periféricas en la fosa craneal media. Haga dos incisiones pequeñas al lado de cada laberinto óseo y extirpar toda la estructura sosteniendo el canal semicircular anterior y tirando despuésaliado.
  10. Inmediatamente sumerja laberintos extirpados en un plato de la disección de la solución que contiene ACSF enfriado en hielo (como se describe en el paso 3.1), mientras continua perfusión con carbógeno.
  11. Bajo un microscopio estereoscópico, mantenga pulsado el laberinto de la cóclea y fijarlo a la parte inferior del plato con fórceps.
    1. El uso de fórceps recto finas rayar una pequeña abertura en el hueso por encima del canal semicircular (SSC) ampolla anterior.
    2. Ampliar suavemente esta apertura al llegar inmediatamente debajo del hueso y chasqueando hacia el exterior lejos de la ampolla. Tenga precaución para no empujar fórceps en la abertura y dañar el laberinto membranoso frágil continuación. Continuar de esta manera hasta el utrículo, anterior y lateral ampollas están expuestos. Si es posible eliminar la ampolla posterior también.
  12. Con unas pinzas finas, levante suavemente el utrículo y ampollas lejos del laberinto óseo hasta que estén completamente separados. Siempre que sea posible, mantenerlospor sus canales semicirculares asociados para evitar dañar el epitelio sensorial. En algunos casos, puede ser necesario cortar con tijeras iris para liberar las ampollas de la médula la parte proximal del conducto membranoso semicircular.
  13. Agarrar firmemente los órganos vestibulares entre la punta del fórceps y el lugar en el tampón de lisis preparado anteriormente en el paso 3.2. Agite suavemente la pinza alrededor en el búfer para asegurar órganos vestibulares han desprendido de los fórceps. Compruebe este es el caso de llevar a los fórceps bajo el microscopio estereoscópico.
    1. Tornillo en la tapa de los microtúbulos y congelar la muestra en nitrógeno líquido inmediatamente.

4. Extracción de ARN y RT-PCR

  1. Siga métodos estándar de ARN mensajero (ARNm) de extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante o protocolos de laboratorio preferidos.
    NOTA: Un kit comercial que utilizó ARN portador para ayudar a aislar pequeños rendimientos de ARNm se utilizó en esteprotocolo. Volúmenes de elución más bajas pueden ser usados ​​para aumentar las concentraciones finales de mRNA.
    NOTA: Negativo controles "sin enzima" (CNE) y controles "sin plantilla de ADN" (NTC) también deben completarse para asegurar la validez de los efectos observados.
  2. Aplicar métodos estándar de la transcripción inversa de ARNm en ADN complementario (ADNc) y la amplificación de los genes diana 21-23.

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Resultados

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Para comparar el impacto del tratamiento en Nir joven (4 semanas) y mayores (8-9 meses) los ratones que mide la expresión de antioxidante superóxido dismutasa 1 (SOD-1) en jóvenes (n = 16) y mayores (n = 20) Los ratones que fueron NIR-tratada, tratada simulada, o bloqueado-NIR. La Figura 2 muestra un aumento significativo en normalizado SOD-1 la expresión de β-actina de más de 2 veces en los animales jóvenes tratados con NIR jóvenes en comparación con los animales tratados con placebo (p <0,01) y ani...

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Discusión

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Los resultados representativos descritos aquí muestran que breve entrega transcraneal de la luz NIR (90 seg / día durante 5 días) es suficiente para elevar los niveles de expresión de antioxidantes en ratones de edad avanzada en comparación con los ratones tratados con placebo. Mientras que el calor emitido podría representar una fuente de mitocondrial y / o activación neuronal, según lo informado por vestibular rata aferentes 24 - nuestra medición del calor emitido por el NIR LED dispositivo fue <0,2 ° C ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Los autores desean agradecer al Dr. Paul Witting y Genevieve Fong por su ayuda con la extracción de ARNm y PCR, y la Garnett Passe y Rodney Williams Memorial Fundación para el apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Quantum WARP 10Quantum Devices2070N030-A
Microtúbulos con tapa de rosca CalidadScientific Plastics520-GRD-Q
KetaminaParnell, Alejandría Australia
Tijeras de patrón estándarFST14001-12
Cuchillas quirúrgicas de acero al carbono #22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeursFST16221-14
Microscopio estereoscópicoLeica MicrosystemsA60S
FST11252-00
Aislado II ARN Micro KitBiolineBIO-52075
Dumont #5 SF pinzas

Referencias

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