Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

Resumen

Aquí, presentamos un método simple para realizar la hibridación in situ de ADN fluorescente (DNA ISH) para visualizar secuencias heterocromáticas repetitivas en cromosomas montados en portaobjetos. El método requiere reactivos mínimos y es versátil para su uso con sondas cortas o largas, diferentes tejidos y detección con señales basadas en fluorescencia o no fluorescencia.

Resumen

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Este enfoque es particularmente eficaz en la cartografía de secuencias altamente repetitivas a heterochromatic regiones, donde los enfoques computacionales enfrentan desafíos prohibitivos. Aquí se describe un protocolo simplificado para ADN ISH que elude lavados de formamida que son medidas estándar en otros protocolos de ADN ISH. El protocolo se ha optimizado para la hibridación con sondas de ADN monocatenario cortos que llevan colorantes fluorescentes, que marcan efectivamente secuencias repetitivas de ADN dentro de las regiones cromosómicas heterocromatínicas a través de un número de diferentes tipos de tejidos de insectos. Sin embargo, las solicitudes podrán hacerse extensivas a utilizar con sondas de mayor tamaño y la visualización de las secuencias de ADN de copia única (no repetitiva). Demostramos este método mediante la asignación de varios diferentes secuencias repetitivas a los cromosomas de Drosophila melanogaster aplastadas células neuronales y Nasoniavitripennis espermatocitos. Mostramos los patrones de hibridación de ambas sondas pequeñas, sintetizados en el mercado y para una sonda grande para la comparación. Este procedimiento utiliza insumos de laboratorio sencillas y reactivos, y es ideal para los investigadores que tienen poca experiencia con la realización de ADN ISH.

Introducción

ADN hibridación in situ (ISH ADN) es un método comúnmente utilizado para las secuencias de mapeo a regiones específicas de cromosomas. Las sondas a las regiones de copia única dentro de la eucromatina se pueden generar a través de un puñado de enfoques, incluyendo nick-traducción o extremo etiquetado de los productos de ADN largas de ^1,2 y la incorporación de deoxygenin (DIG) nucleótidos, adscritos y su reconocimiento a través de una amplia variedad de anticuerpos de grupo-conjugado ^1-3. La visualización de secuencias euchromatic en pocos o un solo número de copias requiere el uso de cualquiera de las sondas individuales, grandes con al....

Protocolo

1. Tejido disección y fijación (60 min)

1. Para el cerebro de Drosophila, coloque larvas ^3º en una gota de 1x PBS (tampón fosfato salino). Elija gran ^3º estadio las larvas que se arrastraba activamente de los viales o botellas que no son de hacinamiento.
   1. Utilice uno ultrafino par de pinzas para agarrar los ganchos de la boca y otro par de pinzas para agarrar 2/3 abajo de la longitud del cuerpo (Figura 1 A, B). Tire suavemente de los ganchos de la boca para exponer el cerebro, los ganglios ventral, las glándulas salivales y parte del tracto digestivo de las larvas. Utilice las pinzas para separar el cerebro y gan....

Resultados

Para demostrar este método, hibridizada un conjunto de pequeñas oligos sintetizados comercialmente que se han modificado químicamente con conjugados fluorescentes (Figura 2) y una sonda biotinilada más larga (realizada a través de traducción nick de un producto de PCR; Figura 2B), a los cromosomas de varios tejidos diferentes tipos (ver Tabla 1). Las secuencias diana incluyen repeticiones satélite ubicadas en pericentromeric regiones (heterocromáticas) de los cromosomas.......

Discusión

ADN ISH se utiliza con frecuencia para mapear secuencias específicas a los cromosomas. Hemos descrito un método sencillo para el ADN ISH optimizado para alto número de copias, heterochromatic secuencias. En lugar de usar lavados en una solución de formamida, que es un requisito en otros protocolos de ISH de ADN existentes, ponemos diapositivas montado de tejidos directamente en un bloque de pre-calentada para desnaturalizar el ADN. Este método evita el uso de grandes cantidades de formamida. Un paso fundamental para la .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina (también se pueden utilizar portaobjetos normales)	Sigma Aldrich
(calibre 5)	Cubreobjetos Dumont
de 22 x 22 mm	Fisher		Sigmacote-tratado por inmersión durante 15 segundos, secado y limpiando todos los restos de Sigmacote para que el cubreobjetos quede transparente
Sigmacote	Sigma
Papel de filtro			75 - 150 mm
			encerado de parafina
Bloque de calor con termómetro
Incubadora
Cuchillas de
Cámara de			Caja de punta de pipeta vacía o Tupperware, forrada con toallas de papel humedecidas o frascos
	Coplin		con ranuras deslizantes
Papel
Pipetas
Tubos de microfuga de 1,5 ml
			transparente o coloreado
Micropipeta P20 y puntas
Clips			20 - 25 clips metálicos estándar unidos para formar un chain
Reactivos
16% Paraformaldehído de grado EM			microscopía
electrónica Ácido acético	Sigma
Nitrógeno
100% Etanol, grado
Oligonucleótidos sintetizados comercialmente, marcados con fluorescencia Sonda
biotinilada larga	Invitrogen; Pasos alternativos 2.7.1-2.7.3		p. ej., nick traducido y biotinilado con BioNick de Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Pasos alternativos 2.7.1-2.7.3		para la detección de sonda biotinilada larga
Tampón de hibridación	Receta por encima
4x SSCT	Receta por encima		citrato salino-sódico + Tween
0.1x SSC	Receta por encima		citrato salino-sódico
Solución de bloqueo	Receta por encima
de SBT	Receta por encima		SSC, albúmina sérica bovina, Tween
1x Receta de PBT	sobre		solución salina tamponada con fosfato + Tween
1x solución	salina tamponada con fosfato
Solución			al 0,5% de citrato de sodio en H2O
Formamida	Sigma Aldrich
Vectashield Medio de montaje con DAPI	Vector laboratorios

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