Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, el equipo y las técnicas necesarias para completar la tinción inmunohistoquímica de cerebros de roedores, utilizando marcadores para la microglía y los elementos neuronales como ejemplo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Primer para inmunohistoquímica en el tejido cryosectioned cerebro de rata: Ejemplo de tinción de microglía y neuronas
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para detectar la presencia, localización, y la abundancia relativa de antígenos in situ. Este protocolo de nivel introductorio describe los reactivos, equipos y técnicas requeridas para completar la tinción inmunohistoquímica de tejido de cerebro de roedores, el uso de marcadores para microglia y elementos neuronales como un ejemplo. En concreto, este trabajo es un protocolo de paso a paso para la visualización fluorescente de la microglia y neuronas a través de inmunohistoquímica para Iba1 y Pan-neuronal, respectivamente. Fluorescencia doble etiquetado es particularmente útil para la localización de múltiples proteínas dentro de la misma muestra, proporcionando la oportunidad de observar con precisión las interacciones entre tipos de células, receptores, ligandos, y / o la matriz extracelular en relación el uno al otro, así como co-proteína localización dentro de una sola célula. A diferencia de otras técnicas de visualización, intensidad de la tinción inmunohistoquímica de fluorescencia puede disminuir enlas semanas a meses después de la tinción, si no se toman las precauciones adecuadas. A pesar de esta limitación, en muchas aplicaciones se prefiere la fluorescencia doble etiquetado sobre alternativas tales como tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina (DAB) o fosfatasa alcalina (AP), como fluorescencia es más eficiente en el tiempo y permite la diferenciación más precisa entre dos o más marcadores. La discusión incluye sugerencias para solucionar problemas y consejos para promover el éxito.
Introducción
La inmunohistoquímica es un proceso para la detección de antígenos (es decir, proteínas) en secciones de tejido mediante el uso de anticuerpos primarios que se unen específicamente a los antígenos de interés. La inmunohistoquímica fue iniciado por JR Marrack en 1934 cuando se determinó que los anticuerpos podrían localizar antígenos con gran especificidad 1. A partir de 1942, algunos de los primeros estudios in vitro usando anticuerpos fluorescentes para visualizar inmunohistoquímica se publicaron 2,3, después de lo cual el primer estudio in vivo en histoquímica fue publicado 4. Durante la década de 19....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de Arizona. Una lista de los materiales y equipos recomendados se puede encontrar en la Tabla 1.
1. Preparación del tejido
- Perfusión
- La eutanasia a los roedores con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, IP), y perfundir transcardially con tampón fosfato salino (PBS) hasta que esté completamente desangrado (3-5 min) a una velocidad de flujo de 8 ml / min. Para obtener instrucciones de perfusión en profundidad, ver Gage et al 2012 9.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Este protocolo de tinción resultados en secciones de tejido de cerebro de rata que han microglia marcados con fluorescencia en el canal 594 (rojo) y neuronas marcadas en el canal 488 (verde; véase la Figura 4). Si una mancha nuclear se ha hecho, se mostrará en el canal 405 (azul). Las imágenes pueden ser tomadas en diferentes canales y superpuestos para la comparación directa de los tres canales, o entre dos canales. Muchos paquetes de software de adquisición digitales incluyen esta funcionalidad. Haga .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
El objetivo general de esta comunicación fue la introducción de procedimientos de inmunohistoquímica para el lector. Para ello, el ejemplo de doble etiquetado con Iba1 y antígenos Pan-neuronales para observar microglia y neuronas en paraformaldehído perfundido, se utilizó sacarosa cerebro cryoprotected, rata cryosectioned.
Esta técnica se puede adaptar para servir a los propósitos sin fin. Una serie de diferentes antígenos en una variedad de tipos de tejidos tales como, pero sin limitarse a .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Sr. Ryan Hart y al Sr. Arriz Lucas por sus valiosos comentarios sobre esta comunicación. Este trabajo contó con el apoyo de los Fondos de Apoyo a la Misión de los NIH NINDS R01 NS065052 y el Hospital Infantil de Phoenix.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de vidrio Superfrost Plus de Fisherbrand | Fisher Scientific | 22-034-979 | Se utiliza para el montaje de tejidos (1.2.2) |
| Horno | Thermo Scientific | 51028112 | Se utiliza para el secado de tejidos (2.1.1) |
| Mini bolígrafo Papanicolaou | Life Technologies | 00-8877 | Se utiliza en el paso 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Plato de tinción en portaobjetos | Fisher Scientific | 22-149-429 | Se utiliza para todos los lavados durante la tinción (2.2), así como en el paso Hoechst (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Se utiliza para secar portaobjetos (2.2) |
| Caja de tinción negra | Ted Pella | 21050 | Se utiliza para bloquear y teñir pasos (2.2) |
| Suero de burro normal | Fisher Scientific | 50-413-253 | Se utiliza para la incubación de bloques y anticuerpos (2.2) |
| Ratón α-Millipore panneuronal | MAB2300 | Se utiliza para anticuerpos primarios (2.2.4) | |
| Conejo α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Utilizado para anticuerpo primario (2.2.4) |
| Burro α-conejo 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Utilizado para anticuerpo secundario (2.2.6) |
| Burro α-ratón 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Utilizado para anticuerpo secundario (2.2.6) |
| Lámina de catering | Cualquiera | N/A | Utilizado en los pasos 1.2.2 y 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Utilizado para el deslizamiento (2.2.8) |
| Cubreobjetos | Fisher Scientific | 12544E | Utilizado para el deslizamiento (2.2.8) |
| Esmalte de uñas transparente | Cualquiera | N/A | Utilizado para el deslizamiento (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 y LSM 710 (escaneo láser, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Utilizado para la obtención de imágenes (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | utilizado para la obtención de imágenes (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Para el protocolo DAB | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | Para el protocolo |
| DAB Kit de peroxidasa DAB | Vector Laboratories | SK-4100 | Para el protocolo DAB |
| Laboratorio de vectores de IgG de caballo α-conejo biotinilado | BA-1100 | Para protocolo DAB | |
| Laboratorios de vectores | IgG de caballo α-ratón biotinilado | BA-2001 | Para el protocolo DAB |
| Peróxido de hidrógeno al 30% | FisherScientific | H325-500 | Para el protocolo DAB |
| Gradillas de portaobjetos y platos de tinción Wheaton | TedPella | 21043 | Para protocolo DAB |
| Masterflex Bomba de perfusión y tubo | Cole-Parmer | Utilizado para la perfusión (1.1.1 y 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek Compuesto CRYO-OCT (caja de 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Utilizado para la congelación de tejidos (1.2.1) |
| Termómetro (-50 a 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Utilizado para la congelación de tejidos (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Se utiliza para el corte de tejidos (1.2.2) |
| Plato de tinción, plástico con 2 tapas | Grale Scientific | 353 | Para retrival |
| de antígenos Rejilla de tinción de 20 lugares, portaobjetos horizontales | Grale Scientific | 354 | Para retrival de antígenos |
| Microondas | Any | N/A | Para retrival de antígenos |
Referencias
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marsha....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
