Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar

Resumen

La neumonectomía en ratón es un modelo comúnmente empleado de crecimiento pulmonar compensatorio. Este procedimiento se puede utilizar junto con el rastreo de linaje o modelos de ratones transgénicos para dilucidar los mecanismos subyacentes.

Resumen

En los seres humanos, la reparación y remodelación interrumpida del pulmón lesionado contribuye a una serie de trastornos pulmonares agudos y crónicos que, en última instancia, pueden conducir a la discapacidad o la muerte. Los modelos animales de reparación y regeneración pulmonar basados en lesiones están limitados por las respuestas específicas de la lesión, lo que dificulta diferenciar los cambios relacionados con la respuesta a la lesión y la resolución de la lesión de los cambios relacionados con la reparación y la regeneración pulmonar. Sin embargo, el uso de modelos animales para identificar estas vías de señalización de reparación y regeneración es fundamental para el desarrollo de nuevas terapias destinadas a mejorar la función pulmonar después de una lesión pulmonar. El modelo de neumonectomía en ratón utiliza el crecimiento pulmonar compensatorio para aislar esas señales de reparación y regeneración con el fin de definir más claramente los mecanismos de reseptación alveolar. Aquí, describimos nuestra técnica para realizar la neumonectomía en ratón y la neumonectomía simulada. Esta técnica se puede utilizar junto con el rastreo de linaje u otros modelos de ratones transgénicos para definir el mecanismo molecular y celular de la reparación y regeneración pulmonar.

Introducción

La función principal del pulmón es proporcionar para el oxígeno y el dióxido de carbono de intercambio entre un organismo y el ambiente. En los seres humanos, una serie de condiciones congénitas y adquiridas conducen a la reducción de la superficie pulmonar que se traduce en la función pulmonar. Aunque una serie de terapias tales como los corticosteroides inhalados, broncodilatadores, oxígeno suplementario, y la ventilación mecánica crónica se utilizan para mitigar las consecuencias de la función pulmonar ^1-3, la terapia ideal para estas condiciones sería promover el recrecimiento del tejido pulmonar funcional - es decir, de pulmón regeneración.

La regeneración de tejidos de mamíferos ha sido bien documentado. El Ratón espinoso africano puede regenerar grandes zonas de piel sin la formación de cicatrices ^4. La falange distal en los seres humanos puede regenerarse después de una lesión o amputación ^5-7. Siguiendo neumonectomía (PNX), el crecimiento pulmonar compensatorio se produce en ratones ^{8, 9} ratas, hacergs ^10, y los seres humanos ^11. Por definición, el crecimiento pulmonar compensatorio implica no sólo la expansión de los espacios aéreos existentes, pero volver a la tabicación de estos espacios aéreos ampliados con la expansión de la microcirculación ¹² asociado. La expresión de genes ha demostrado que este modelo recapitula muchos de los eventos de señalización de desarrollo pulmonar ^13. Cuatro semanas después de ratón PNX, área de la superficie alveolar es equivalente a la de animales operados simulados ^14. En este manuscrito, se describe la PNX ratón y procedimientos simulados PNX.

Protocolo

Declaración de uso animal:: NOTA Todos los procedimientos de este estudio se llevaron a cabo con la aprobación y siguiendo las directrices de la Institutional Animal Uso y Comité de Cuidado (IACUC) en el Hospital de Niños de Cincinnati. C57BL / 6J macho de ocho semanas de edad se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se dejaron aclimatar durante una semana antes de usar. Hasta la cirugía, los animales fueron alojados en un centro de barrera libre de patógenos y siempre pienso en autoclave y se filtra agua ad libdium. Cada jaula ratón se suministra con un aire dedicado y agua, y las habitaciones se mantuvieron en un ciclo día-noche de 12 horas. Después de la recuperación de la cirugía, los ratones fueron mantenidos en jaulas con las tapas filtrados, siempre autoclave comida ad libitum, y siempre que filtran el agua de una botella de agua.

1. Elaboración de Instrumentos

1. Hacer 6 retractores de la piel utilizando clips y pines de papel. Giro enderezó clips de papel en los vástagos de los pines de papel, lalero de un alambre de acero recta 5 cm en un extremo y hacer un solo 0.5 cm "U" en forma de gancho en el extremo del cable.
2. Hacer un poco de 15 x 15 cm paños quirúrgicos cuadrados utilizando una envoltura de plástico. Prepare un aderezo por ratón. Ponga una torre de papel entre cada envoltura.
3. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos junto con una pila de fichas de 12 x 12 pulgadas de corcho, gasas, y aplicadores de algodón.

2. Preparación del ratón

1. Inducir la anestesia con isoflurano al 2%. Pesar animal.
2. En un área de preparación quirúrgica dedicada afeitarse tórax izquierdo y el cuello con la máquina de afeitar eléctrica.
3. Aplique una gota del ungüento de lágrimas artificiales para los ojos del ratón.
4. Descontaminar el cuello y el tórax izquierdo con clorhexidina y alcohol isopropílico. Repite dos veces más.

3. Ratón Oro-traqueal La intubación y ventilación mecánica

1. Haga que un técnico quirúrgico lugar no estéril la supina ratón en el área quirúrgica pre-calentado.
2. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la documentación de la falta de una respuesta a la pizca de la pata.
3. Después de lavarse las manos y ponerse el traje quirúrgico, máscara y sombrero, ponerse guantes quirúrgicos estériles.
4. Después de drapeado y utilizando una técnica aséptica, hacer una incisión vertical de 1 cm en el mediano anterior del cuello para exponer la laringe. Ligeramente retraer los músculos de la correa dentada, con curvas de 10 cm pinzas y exponer la laringe y la tráquea mediante la difusión de los músculos de la correa con la punta de unas tijeras rectas.
5. Por vía oral insertar un 22 G angiocatéter romo-punta en la mitad de la tráquea (Figura 1A) y confirmar visualmente la colocación (Figura 1B). Mantener la anestesia y ventilar utilizando 1-3% isoflurano a través del ventilador de roedores (225 l por golpe; 200 Stokes por minuto). Emplear un límite de presión de 15 cm H ₂ O.

4. Ratón neumonectomía

1. Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho con la espalda del ratón haciael operador (a la izquierda hacia arriba). Utilice una envoltura de plástico de cierre automático como un campo estéril. Corte a través de la cortina, utilice contundentes tijeras curvas de punta para hacer un 2 cm de largo corte paralelo a las costillas en el espacio intercostal 4 ^º y 5 ^º. Inserte las tijeras de punta curvada contundentes y diseccionar la piel lejos de las costillas subyacentes y los músculos intercostales.
2. Retraer la piel con cuatro retractores para exponer un cuadrado 1,5 x 1,5 cm de la ventana quirúrgica (Figura 2A). Asegure los retractores al tablero de corcho.
3. Diseccionar a costillas utilizando pinzas curvas, y utilizar una punta de las pinzas curvas para entrar en la cavidad torácica.
4. Usando la punta roma micro-tijeras, utilice la cuchilla inferior para entrar en la cavidad torácica. Hacer una incisión de 0,5 cm entre las costillas y la repetición en la dirección opuesta.
5. Usando los dos retractores restantes, abrir el tórax en el eje antero-posterior y el seguro de los retractores de la placa de corcho (Figura 2B).
6. Con unas pinzas de punta roma curvas en la mano izquierda, sujete el pulmón izquierdo y desplazar a la parte superior del pulmón izquierdo lateral e inferior a través de la toracotomía hasta la arteria pulmonar izquierda y bronquios están expuestos (Figura 3A, B).
7. Sosteniendo el titanio microclip vascular aplicador cargado en la mano derecha con el cuerpo del aplicador en la palma y punta curva en dirección opuesta a la palma de la mano (Figura 3C), deslice la punta del aplicador en el tórax a lo largo de la curvatura de la cara posterior de la izquierda pulmón y el clip del bronquio izquierdo y la arteria pulmonar (Figura 3D).
8. Retire el aplicador pero mantener el pulmón izquierdo retraída. Sujete las puntas micro-tijeras de punta roma con la mano derecha y cortar el bronquio y distal de la arteria pulmonar para el clip y retire pulmón izquierdo (Figura 3E).
9. Retire los retractores costales.
10. Utilice las pinzas contundentes curvas pellizcar hasta 1 cm de piel de calidad inferior a la incisien pero por encima del nivel del diafragma e insertar un angiocatéter 24 G a través de la piel y en la cavidad torácica izquierda (Figura 4A, B).
11. Utilice 5-0 prolene sutura colocar dos puntos separados alrededor de la 4 ^ª y 5 ^ª costillas para cerrar la cavidad torácica.
12. Retire los retractores de la piel. Utilice dos conjuntos de pinzas para aproximar la piel a lo largo de la longitud de la incisión y pegar la piel cerrada.
13. Conecte una jeringa luer-lock 3 ml al angiocatéter y eliminar el aire residual aplicando succión suave y retirar el angiocatéter.
14. Pegue la incisión en el cuello cerrado usando dos juegos de pinzas como antes.

5. Ratón Sham neumonectomía

1. Exponer el pulmón izquierdo como se señala en el protocolo "Ratón Neumonectomía". Levante la caja torácica con unas pinzas romas curvas para permitir que el aire en la cavidad torácica izquierda (Figura 5 A, B).
2. Coloque una G angiocatéter 24 en el tho izquierdacavidad Racic que arriba con cuidado de no dañar el pulmón izquierdo.
3. Utilizando 5-0 prolene sutura y teniendo cuidado de no perforar el pulmón (Figura 5C), colocar dos trozos de material de sutura en la ^3ª / ^4ª y ^5ª / 6 espacios intermedios ^ª costilla (Figura 5D). Coloque las dos longitudes de material de sutura antes de atar a disminuir los riesgos de hernia pulmón izquierdo. Ate el material de sutura para hacer dos puntos separados (Figura 5E).
4. Pegue la piel sobre la incisión torácica, eliminar el aire residual con el angiocatéter y pegar la incisión en el cuello que el anterior.

6. Reanimación, Analgesia y Recuperación

1. Apague el isoflurano, y administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina y 0,5 ml de solución salina normal por vía subcutánea.
2. Cuando la respiración espontánea se reanuden, retire el tubo endotraqueal.
3. Observe ratón hasta que esté de nuevo ambulatorio. Caminar normalmente Resumit varios minutos después de la extracción del tubo endotraqueal.
4. Coloca el ratón en un 27 ° C incubadora (, 25% de oxígeno humidificado) para recuperar O / N.
   NOTA: Nos colocamos varias bolitas de comida humedecida con agua en el suelo de la jaula por primera 24 horas después de la cirugía.
5. Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina por inyección intraperitoneal dos veces al día durante tres días después de la cirugía. Tenga cuidado de no abrir el sitio quirúrgico al manipular animales.

7. Monitoreo Ratón

1. Pesar ratones a 1, 3, 5, y 7 días después de la cirugía.

Resultados

. Una parcela de PNX y operación simulada pesos de los ratones se proporciona en la figura 6 En nuestras manos, la supervivencia es consistentemente 95-100% tanto para PNX y farsa neumonectomía. Para obtener una descripción de cómo el pulmón derecho re-crece en este modelo y la evolución en el tiempo previsto, nos remite al lector a los manuscritos de Gibney et al. ¹⁵ y Wang et al. ¹⁴

Varios errores comunes se deben evitar para realiza...

Discusión

Hemos proporcionado la descripción más detallada de los procedimientos PNX PNX ratón y ratón del impostor reportados hasta la fecha. Hemos hecho el lector consciente de varios de los errores comunes que los investigadores están aprendiendo el procedimiento comúnmente se enfrentan, y que hemos descrito varias técnicas desarrolladas por nuestro laboratorio para mitigar estos riesgos. Otros laboratorios que utilizan este modelo pueden haber desarrollado otras modificaciones en la técnica o utilizar diferentes instrumentos....

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Aplicador de clip vascular de 6 pulgadas	Teleflex Medical (WECK)	137062
Horizon pequeño clip rojo titanio	Teleflex Medical (WECK)	1201
Pinza curva de 12 cm de patrón estrecho	Fine Science Tools	11003-12
Pinza Graefe dentada curva de 10 cm	Pinza Fine Science Tools	11052-10
Portaagujas	CastroviejoFine Science Tools	12565-14
Tijeras rectas de 9 cm para el estrabismo (punta roma)	Fine Science Tools	14075-09
Tijeras rectas endurecidas de 8,5 cm	Fine Science Tools	14090-09
Tijeras de muelle Cohan-Vannas rectas y de punta roma	Fine Science Tools	15000-12
Pegamento para la piel	Gluture	32046
22 g Angiocatéter
24 G Angiocatéter
3 ml Jeringa
4 Retractores cortos
5-0 Prolene en aguja de corte curva	Ethicon	8698G
0,5 ml Jeringa en aguja
Solución salina
Buprenorfina
Envoltura Press-n-Seal	Glad Products Company
12 x 12 pulgadas Pila de tableros de corcho	Office Depot
70% Etanol
Betadine
Ventilador de ratón	Hugo Sachs Elektronnik	Minivent Tipo 845
Vaporizador de isoflurano	OHMEDA	Excel 210 SE
Pomada de lágrimas artificiales	Puralube	NDC: 17033-211-38

Luer lock 2 Retractores largos de 27 Gnormal