Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

Rebecca L. Acabchuk; Ye Sun; Richard Wolferz, Jr.; Matthew B. Eastman; Jessica B. Lennington; Brett A. Shook; Qian Wu; Joanne C. Conover

doi:10.3791/52328

Artículo de método

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

DOI:

10.3791/52328

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19 de mayo de 2015

Rebecca L. Acabchuk¹ , Ye Sun¹ , Richard Wolferz, Jr.¹ , Matthew B. Eastman¹ , Jessica B. Lennington¹ , Brett A. Shook¹ , Qian Wu² , Joanne C. Conover¹

¹Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, ²Department of Anatomic Pathology and Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center

En este artículo

Resumen

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Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Resumen

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El sistema ventricular transporta y hace circular el líquido cefalorraquídeo (LCR) y facilita la eliminación de solutos y toxinas del cerebro. Las unidades funcionales de los ventrículos son células epiteliales ciliadas denominadas células ependimarias, que recubren los ventrículos y, a través de la acción ciliar, son capaces de generar flujo laminar de LCR en la superficie del ventrículo. Esta monocapa de células ependimarias también proporciona funciones de barrera y filtración que promueven el intercambio entre los fluidos intersticiales cerebrales (ISF) y el LCR circulante. Los cambios bioquímicos en el cerebro se reflejan en la composición del líquido cefalorraquídeo y la destrucción del epéndimo puede alterar el delicado equilibrio del intercambio entre el líquido cefalorraquídeo y el líquido cefalorraquídeo. En los seres humanos existe una fuerte correlación entre la expansión del ventrículo lateral y el envejecimiento. La ventriculomegalia asociada a la edad puede ocurrir incluso en ausencia de demencia u obstrucción del flujo del líquido cefalorraquídeo. A menudo se desconoce la causa exacta y la progresión de la ventriculomegalia; Sin embargo, los ventrículos agrandados pueden mostrar una pérdida regional y, a menudo, extensa de la cobertura de las células ependimarias, con astrogliosis de la superficie del ventrículo y edema periventricular asociado que reemplaza la monocapa funcional de células ependimarias. Utilizando resonancias magnéticas junto con tejido cerebral humano postmortem, describimos cómo preparar, obtener imágenes y compilar representaciones en 3D de los volúmenes de los ventrículos laterales, calcular los volúmenes de los ventrículos laterales y caracterizar el tejido periventricular mediante el análisis inmunohistoquímico de las preparaciones de tejido de la pared del ventrículo lateral en la cara. También se presentan los análisis correspondientes del tejido cerebral de ratón, lo que respalda el uso de modelos de ratón como medio para evaluar los cambios en los ventrículos laterales y el tejido periventricular que se encuentran en el envejecimiento y la enfermedad humana. En conjunto, estos protocolos permiten investigar la causa y el efecto de la ventriculomegalia y destacar las técnicas para estudiar la salud del sistema ventricular y sus importantes funciones de barrera y filtración dentro del cerebro.

Introducción

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Un ependimarias líneas monocapa de células del sistema ventricular del cerebro que proporciona funciones de barrera y de transporte bidireccionales entre el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el líquido intersticial (ISF), ^1-3. Estas funciones ayudan a mantener el cerebro tóxico-libre y en equilibrio fisiológico ^2,3. En los seres humanos la pérdida de porciones de este revestimiento a través de una lesión o enfermedad no parece resultar en sustitución regenerativa como se encuentra en otros revestimientos epiteliales; más bien la pérdida de cobertura de la célula ependimal parece resultar en astrogliosis periventricular con una malla de los astroci....

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Protocolo

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NOTA: Los procedimientos en animales fueron aprobados por la Universidad de Connecticut IACUC y se ajustan a las directrices del NIH. Tejido humano y el análisis de datos y procedimientos estaban en el cumplimiento y aprobados por la Universidad de Connecticut IRB y se ajustan a las directrices del NIH.

1. Mouse: Análisis de periventricular celular Integridad y Modelado 3D del ventrículo lateral

1.1) Preparación del mouse laterales ventrículo Wall enteros Mounts

Preparar ratón ventrículo montajes enteros laterales para inmunohistoquímica (IHC), como anteriormente descrita ^16,17.

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Resultados

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Contorno de trazado de los ventrículos laterales del ratón sobre la base de inmunoteñidas 50 micras secciones coronales y reconstrucciones en 3D (Figura 3) permite que los datos de volumen para ser recogidos en diferentes paradigmas experimentales utilizando el ratón como sistema modelo para la enfermedad o lesión. Fundamental para este procedimiento es la exclusión de las regiones donde las paredes del ventrículo lateral se adhieren el uno al otro. Por subsegmenting regiones de los ventrículos y la des.......

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Discusión

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Presentamos herramientas y protocolos que pueden utilizarse para evaluar la integridad del sistema ventricular del cerebro en ratones y en seres humanos. Estas herramientas, sin embargo, pueden también ser aplicados a otras estructuras cerebrales o sistemas de órganos que sufren cambios debido a una lesión, enfermedad, o durante el proceso de envejecimiento ^14,21,22. Las estrategias presentadas toma ventaja de software que permite la alineación de secuencias de RM transversales y longitudinales para generar r.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Una subvención del NINDS NS05033 (JCC) apoyó este trabajo. Los programas RAC, SURF y OUR de la Universidad de Connecticut proporcionaron apoyo adicional.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Life Technologies	21600-069
Paraformaldehído (PFA)	Ciencias de la Microscopía Electrónica	19210	Uso al 4% en PBS, 4 & grados; C
Suero de Caballo Normal	Life Technologies	16050 10	% en PBS-TX (v/v)
Suero de Cabra Normal	Life Technologies	16210	10% en PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)	Sigma-Aldrich	T8787	0.1% en PBS (v/v)
Vibratomo	Leica	VT1000S
Microscopio de fluorescencia	Zeiss	Imager.M2
Cámara	Hamamatsu	ORCA R2
Microscopio Controlador de etapa	Ludl Electronic Products	MAC 6000
Software de estereología	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
Software de estereología	ImageJ/NIH	NIH freeware
3D Software de reconstrucción MBF	Bioscience	Neurolucida Explorer
Microscopio confocal	Leica	TCS SP2
			resonancia magnética
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	Segmentación y volumen
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		Segmentación y análisis de volumen
de múltiples imágenes GUI (Mango)	http://ric.uthscsa.edu/mango/		Recubrimiento longitudinal
Equipo de montaje completo 22.5
& grados; cuchillo de puñalada recta microquirúrgico	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm

pinzas
			finas
aquapolymount
microscopio de disección	Leica	MZ95
Anticuerpos
ratón anti-b-catenina	BD Bioschiences, San José, CA, EE. UU		1:250
cabra anti-GFAP	Santa Cruz Biotechnology		1:250
conejo anti-AQP4 (acuaporina-4)	Sigma-Aldrich		1:400
Anticuerpos
Anti-S100 y beta; anticuerpo	Sigma-Aldrich		1:500
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Life Technologies	D-1306	10 µ g/ml en PBS

Software de plato de disección con fondo de cera de montaje entero. coronales

Referencias

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Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid,....

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Volumen ventricular reconstrucci n 3D an lisis inmunohistoqu mico c lulas ependimarias exploraciones por RM tejido cerebral de rat n microscop a confocal ventriculomegalia

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

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