Artículo de método

La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en

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DOI:

10.3791/52345

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5 de abril de 2015

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método rentable para definir las interacciones químico-genéticas en levaduras en ciernes. El enfoque se basa en técnicas fundamentales en biología molecular de levaduras y es muy adecuado para la interrogación mecanicista de colecciones pequeñas y medianas de productos químicos y otros entornos de medios.

Resumen

Determinar el modo de acción de los productos químicos bioactivos es de interés para una amplia gama de académico, farmacéutico, y los científicos industriales. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura en ciernes, es un modelo eucariota para la que una colección completa de ~ 6000 mutantes de deleción de gen y gen esencial hypomorphic mutantes están disponibles comercialmente. Estas colecciones de mutantes se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la interacción química de genes, es decir, genes necesarios para tolerar una sustancia química. Esta información, a su vez, informa sobre el modo probable de acción del compuesto. Aquí se describe un protocolo para la identificación rápida de las interacciones químicas genética de la levadura en ciernes. Demostramos el método que utiliza el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tiene un mecanismo bien definido de acción. Nuestros resultados muestran que la TRAMP nuclear RNA se necesitan enzimas de exosoma y de reparación del ADN para la proliferación en presencia de 5-FU, que es coherente con m anterioricroarray enfoques basados ​​de códigos de barras químicos genéticos y de los conocimientos que el 5-FU afecta negativamente tanto el metabolismo de ARN y ADN. También se describen los protocolos de validación solicitada de estas pantallas de alto rendimiento.

Introducción

Las herramientas genéticas y los recursos disponibles en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae han permitido a gran escala estudios de genómica funcional que proporcionan colectivamente una nueva visión de cómo los genes funcionan como redes para cumplir con los requisitos de los sistemas biológicos. La piedra angular de estas herramientas fue la creación en colaboración de un conjunto completo de no esenciales supresiones de genes de todos los marcos de lectura abierta en la levadura 1,2. Una observación sorprendente fue que sólo ~ 20% de los genes de levadura se requiere para la viabilidad cuando se cultiva como haploides en condiciones estándar de laboratorio. Esto pone de relieve la capacidad de una célula para amortiguar contra perturbaciones genómico a través de la utilización de las vías biológicas alternativas. Mutantes genéticos que sean viables individualmente, pero letal en combinación, señalan caminos biológicos paralelos conectados o convergentes y forman redes de interacción genéticos que describen la función biológica. Con el desarrollo de te condicionalalelos mperatura sensibles y hypomorphic de genes esenciales de la tecnología no se ha limitado al estudio de los genes no esenciales 3,4. Este concepto ha sido aplicado en una escala genómica producir un imparcial mapa interacción genética que ilustra cómo los genes implicados en los procesos celulares similares se agrupan 5.

Perturbaciones químicas de redes genéticas imitan supresiones de genes (Figura 1) 6. Consulta de compuestos inhibidores del crecimiento contra un array de alta densidad de cepas de deleción para la hipersensibilidad identifica un perfil de interacción química y genética, es decir, una lista de genes que se requiere para tolerar el estrés químico. Al igual que las interacciones genéticas, pantallas de gran escala de las bibliotecas químicas han demostrado que los compuestos con un modo similar de racimo acción juntos 7. Por lo tanto, mediante el establecimiento del perfil de interacción química y genética de un compuesto el modo de acción se puede deducir mediante la comparación con LARinteracción genética genética y química sintética ge-escala datasets 8,9.

Pantallas de química y genética a gran escala, donde son interrogados decenas de compuestos, se han realizado ensayos de competición por código de barras. En este enfoque, la colección agrupada de las cepas de deleción se cultiva en masa durante varias generaciones en un pequeño volumen de medio que contiene una sustancia química. Dado que cada mutante de deleción alberga un código de barras genético único, la viabilidad / crecimiento de mutantes individuales dentro de la piscina de supresión cepas se realiza un seguimiento de microarrays o de alto rendimiento de secuenciación 10.

Inferir la aptitud mediante el control de tamaño de las colonias de mutantes físicamente dispuestos cultivadas en agar sólido que contiene un compuesto bioactivo es también un método eficaz para identificar las interacciones química y genética 11,12. Este enfoque proporciona una alternativa rentable a la selección basada en la competencia y es muy adecuado para el ensayo de las pequeñas bibliotecas de productos químicos.Esbozado aquí es una metodología sencilla para producir una lista de interacciones químicas genética en S. cerevisiae que no se basa en la manipulación molecular o la infraestructura de biología. Se requiere sólo una colección deleción de levadura, un aparato de colocación de clavos robótico o manual, y el software de análisis de imagen disponible libremente.

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Protocolo

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 2.

1. Determinación de la dosis inhibidora del crecimiento

  1. Preparación de la levadura cultivo durante la noche
    NOTA: Los medios de crecimiento de la levadura-extracto-peptona-dextrosa (YEPD) utilizado en este protocolo es una receta estándar 13.
    1. Streak a las células en una placa de agar YEPD BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) y se incuba durante 48 horas a 30 ° C o hasta que se formen colonias visibles.
    2. Preparar cultivos de una noche mediante la inoculación de 5 ml de medio líquido YEPD en un recipiente de cultivo estéril con una sola colonia. Incubar durante la noche a 30 ° C con rotación continua o agitación. La cultura se suele llegar a la saturación por la mañana (~ 2 × 10 8 células / ml).
  2. Preparación de medios de agar sólido que contiene dosis químicas diferentes
    1. Prepare varias poblaciones deel producto químico a ensayar en 100x concentración final deseada en un disolvente apropiado.
      NOTA: Las concentraciones eficaces dependerán de la química, y deben ser determinado empíricamente. Por tanto, es aconsejable probar inicialmente un amplio rango de concentración final; es decir, de baja M a alta mM.
    2. Para cada concentración de producto químico a ensayar, alícuota de 3 ml de agar YEPD fundida a un tubo de cultivo estéril varios. Lugar en el 55 ° C baño de agua para mantener la solidificación.
    3. Para cada concentración de producto químico a ensayar añadir 30 l de compuesto 100x a los medios fundidos, vórtice 2-3 segundos para mezclar, y pipeta de 1 ml en cada par de pocillos duplicados en una placa de 12 pocillos. Asegúrese de incluir un vehículo único control. Permitir a las placas reposar durante la noche a temperatura ambiente. Deseche cualquier medio extra.
  3. Células Spread chapado
    1. Inocular 10 ml de medio líquido YEPD con 2 l de un cultivo de levadura saturado, cultivadas durante la noche como en el paso 1.1.2.
    2. Placa de 25 l de cultivo de levadura diluida por pocillo, distribuidos uniformemente usando perlas de vidrio estériles o varilla, y permiten que la placa se seque bajo una llama. Incubar la placa a 30 ° C durante 48 horas.
    3. Evaluar el crecimiento de la levadura (tanto en número total y el tamaño de las colonias) en las placas. Seleccione una concentración subletal de compuesto que no inhibe el crecimiento en más de un 10% -15% para realizar la pantalla.

2. Sistemática Pantalla Química Genética

  1. Mantenimiento de eliminación-mutante-array (DMA) y Preparación de Fuente Plate
    1. Para una descripción detallada de la construcción de matrices de mutantes de deleción de las existencias de glicerol consulte Baryshnikova et al. 14. Una vez mutantes de deleción han sido dispuestos a una densidad de 384 colonias por placa, la DMA se puede almacenar durante varios meses a 4 ° C. Replicar en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 si es necesario para prevenir el crecimiento de colonias en cadaotra.
      NOTA: Varias réplicas de serie se deben evitar para prevenir la pérdida de estirpes de crecimiento lento y minimizar la aparición de mutantes supresores. Esto es particularmente relevante si el mantenimiento de las colecciones como haploides.
    2. Realice todos los pasos réplica de galvanoplastia utilizando un microbiana arraying sistema robótico. Alternativamente, manipular colonias utilizando herramientas manuales de colocación de clavos dispuestos.
      NOTA: La colección de deleción de levadura está disponible como haploides y diploides a partir de varias fuentes comerciales y se envía típicamente como stocks de glicerol en placas de 96 pocillos.
  2. Condensar el array mutante de deleción
    1. Preparar 250 ml de medio YEPD agar que contiene 200 mg / ml de G418. La concentración efectiva de G418 puede variar y cada lote debe ser probado empíricamente.
    2. Preparar cinco placas de agar YEPD vertiendo 50 ml de agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418 por placa. Haga esto un día antes de condensar la matriz y permita que las placas se enfríen a temperatura ambientebibliografía durante la noche en una superficie plana.
      NOTA: Se requieren cuatro placas de la colección en la densidad de 1536-deformación, la quinta placa se vierte como extra.
    3. Retire las 16 placas de Petri que contienen la colección mutante de deleción a una densidad de 384 colonias por placa y se deja llegar a temperatura ambiente (~ 1 h).
    4. Limpiar cualquier condensación que se ha formado en la tapa de cada placa utilizando una tarea delicada toallita. El no hacerlo puede resultar en las gotas de agua que se deposita en la matriz y la contaminación cruzada de los mutantes dispuestos.
    5. El uso de una matriz fijando robot microbiana, condensar el DMA de una densidad de 384 colonias por placa (16 platos de Petri) para 1536 colonias por placa (4 platos de Petri). Realice este modo que el 1 de colonia de la placa 1 pines a la fila 1 columna 1 de la matriz condensada, el 1 de colonia de la placa 2 a la fila 1 columna 2, el 1 de colonia de la placa 3 de fila 2 y la columna 1, y la colonia 1 de placa de 4 a la fila 2columna 2.
    6. Incubar la matriz consolidada a 30 ° C durante la noche.
    7. Examine la matriz para asegurar la transferencia uniforme de colonias de las placas de origen. Habrá varias posiciones en blanco, a propósito incorporados en la matriz, que sirven como una guía para asegurar la DMA se ha condensado correctamente (Figura 4A).
      NOTA: Estos serán los platos de origen de réplica en placa en medios que contienen el compuesto de ensayo. Una placa de una sola fuente puede ser utilizado para múltiples apuntalamientos. También muchos robots tendrán una función de compensación, lo que garantizará un número similar de levadura se están transfiriendo cada vez.
  3. Replica placa matriz mutante de deleción
    1. Preparar 700 ml de control (vehículo solo) y 700 ml de medio experimental (que contienen productos químicos). Esto es suficiente para realizar el ensayo por triplicado (12 placas por condición, además de dos extras).
    2. Verter 50 ml de agar YEPD contengan la sustancia problema o control por placa. Permitir los platos to enfriar a temperatura ambiente durante la noche en una superficie plana.
    3. Utilizando el robot para réplica de la placa, inocular el DMA en tres conjuntos de placas que contienen los productos químicos en la concentración determinado experimentalmente, así como tres conjuntos de placas que contienen el control del vehículo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

3. Las placas de imagen y análisis de datos

  1. Retire las placas de la incubadora y permitir que alcancen la temperatura ambiente (~ 1 hora) antes de la imagen. Esto evitará que se forme condensación mientras que las imágenes de las placas.
  2. Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas por retirar la tapa y colocar boca abajo en un escáner de cama plana. Captura imágenes a una resolución de al menos 300 dpi. También puede utilizar una cámara digital para capturar imágenes. Si al hacerlo, placas lugar boca arriba sobre un fondo oscuro y quitar las tapas de imagen.
    NOTA: El formato de archivo y la colocación de placas dependerán del programa de cuantificación utilizado.
  3. Realizar la cuantificación y la comparación de tamaños de colonia de matriz utilizando uno de varios programas de código abierto, incluyendo Balony 15, SGAtools 16 y ScreenMill 17.

4. Validación de Pantalla

NOTA: En esta etapa varias supresiones levaduras mutantes puntuarán como hipersensibilidad a la sustancia química de interés. Estas interacciones químicas genética próximo deben ser validados en dos maneras. En primer lugar la identidad de las cepas sensibles debe ser confirmada por PCR. En segundo lugar, la sensibilidad química debe ser puntuado de forma independiente. A continuación ofrecemos una breve protocolo para la realización de ensayos de manchado para validar hipersensibilidad cepa, una técnica común en la biología de la levadura.

  1. Streak cabo deseada (hipersensible) mutantes de la colección de levadura supresión en agar YEPD que contiene 200 mg / ml de G418. Se incuba a 30 ° C hasta que se formen colonias. Verificar el genotipo de la cepa por PCR con cebadores de diagnóstico segúnel protocolo del fabricante.
  2. Inocular 5 ml del líquido YEPD para cada cepa e incubar durante la noche a 30 ° C con rotación o agitación.
  3. Mide 600 OD y diluir cada cepa a OD 600 = 1 en DH estéril 2 O. Estos son ahora los cultivos de levaduras normalizados.
  4. Prescindir de 100 l de normalizado levadura de tipo salvaje (BY4741) cultura para así A1 de una placa de 96 pocillos. Prescindir de 100 l de hasta siete cepas adicionales de pozos B1-H1.
  5. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 90 l de dH 2 O estéril para pozos A2-H2 a través A6-H6. Finalmente, preparar una serie de diluciones 1:10 de cultivos de levadura normalizados. Iniciar pipeteando en serie 10 l de la columna 1 a la columna 2 con una pipeta multicanal, y continuar a través de la placa de 96 pocillos hasta que se hagan seis diluciones (es decir, 10 0 a 10 -5).
  6. Transferencia de 2-5 l de cultivos de levadura diluidas en una cuadrícula utilizando un multicanalpipeta sobre YEPD medios sólidos que contienen sustancias químicas y el control del vehículo. Incubar las placas a la temperatura adecuada durante 24-48 h.
  7. Inspeccionar placas y comparar la sensibilidad de seleccionar mutantes para química (en relación con BY4741 control). Las placas radiográficas a las 24 y 48 horas como en el paso 3.2.
    NOTA: Si bien la identificación de varias cepas hipersensibles con ontologías de genes relacionados o funciones presta confianza para la validez de la pantalla, se requiere la transformación de una cepa de deleción hipersensibles con un plásmido que contiene una copia de tipo salvaje del gen para establecer formalmente que un gen eliminación de interés (y las mutaciones no ocultos segundo sitio) provoca sensibilidad a los fármacos.

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Resultados

Como una validación de este enfoque se realizó una pantalla genética química representante interacción del agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 5-FU es conocido para interrumpir la timidilato sintasa, así como ADN y ARN metabolismo 18. Las interacciones genéticas químicas de 5-FU son bien estudiado y se han investigado mediante técnicas de microarrays de código de barras de la levadura utilizando ambas colecciones supresión heterocigotos y homocigotos ...

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Discusión

Esbozado aquí es un enfoque para la generación de perfiles de interacción química y genética. El método es simple: mediante la comparación de tamaños de colonia de cada cepa en colecciones integrales de supresión de genes en presencia y ausencia de un producto químico, todos los genes necesarios para tolerar un insulto química se identifican. Análisis de enriquecimiento de anotación de la lista resultante de cepas sensibles a continuación, se puede utilizar para proporcionar información sobre un modo de productos químic...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

La investigación en el laboratorio de CJN con el apoyo de subvenciones de funcionamiento de NSERC, el Instituto Canadiense del Cáncer Research Society (CCSRI) y la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Extracto de levaduraBioBasicG0961Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 1% (p/v)
Tyrptone PowderBD Biosciences211820Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 2% (p/v)
Anachemiadextrosa31096-380Para medios líquidos/sólidos YEPD, agregue una concentración final del 2% (p/v) — No lo haga en autoclave. Prepare la solución madre al 20%, filtre, esterilice y agregue a los medios después de esterilizar en autoclave.
Agar ABio BasicFB0010Para medios sólidos YEPD agregar al 2% de concentración final (w/v)
G418A.G. Scientific Inc.G-1033Prepare 1,000x stock a 200  mg/ml en dH2O y filtro esterilizante.
Placa de 12 pocillosGreiner Bio One655180
Tubos de cultivo de 5 mlEvergreen Scientific222-2376-080
Placa de Petri de 10 cmVWR25384-302
ROTOR HDASinger Instruments ROT-001robot de fijación de matriz microbiana de alto rendimiento
PLUSPLATE© Placa de PetriSinger Instrumentos PLU-001Caja de 200 platos
384 RePad de Pin CortoSinger Instruments RP-MP-384Caja de 1,000 pads
1536 RePad de Pin CortoSinger Instruments RP-MP-1536Caja de 1,000 almohadillas
Herramientas de fijación alternativas
Sistemas Robtic Totalmente AutomatizadosS& P roboticshttp://www.sprobotics.comVarios sistemas automatizados de robótica e imaginación de manejo de colonias disponibles.
Herramientas de fijación manualV& P Scientific http://www.vp-scientific.comHerramientas y accesorios de replicación portátiles.
de :

Referencias

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