La rápida identificación de químicos interacciones genéticas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Resumen

Aquí presentamos un método rentable para definir las interacciones químico-genéticas en levaduras en ciernes. El enfoque se basa en técnicas fundamentales en biología molecular de levaduras y es muy adecuado para la interrogación mecanicista de colecciones pequeñas y medianas de productos químicos y otros entornos de medios.

Resumen

Determinar el modo de acción de los productos químicos bioactivos es de interés para una amplia gama de académico, farmacéutico, y los científicos industriales. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura en ciernes, es un modelo eucariota para la que una colección completa de ~ 6000 mutantes de deleción de gen y gen esencial hypomorphic mutantes están disponibles comercialmente. Estas colecciones de mutantes se pueden utilizar para detectar sistemáticamente la interacción química de genes, es decir, genes necesarios para tolerar una sustancia química. Esta información, a su vez, informa sobre el modo probable de acción del compuesto. Aquí se describe un protocolo para la identificación rápida de las interacciones químicas genética de la levadura en ciernes. Demostramos el método que utiliza el agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU), que tiene un mecanismo bien definido de acción. Nuestros resultados muestran que la TRAMP nuclear RNA se necesitan enzimas de exosoma y de reparación del ADN para la proliferación en presencia de 5-FU, que es coherente con m anterioricroarray enfoques basados ​​de códigos de barras químicos genéticos y de los conocimientos que el 5-FU afecta negativamente tanto el metabolismo de ARN y ADN. También se describen los protocolos de validación solicitada de estas pantallas de alto rendimiento.

Introducción

Las herramientas genéticas y los recursos disponibles en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae han permitido a gran escala estudios de genómica funcional que proporcionan colectivamente una nueva visión de cómo los genes funcionan como redes para cumplir con los requisitos de los sistemas biológicos. La piedra angular de estas herramientas fue la creación en colaboración de un conjunto completo de no esenciales supresiones de genes de todos los marcos de lectura abierta en la levadura ^1,2. Una observación sorprendente fue que sólo ~ 20% de los genes de levadura se requiere para la viabilidad cuando se cultiva como haploides en condiciones e....

Protocolo

NOTA: El flujo de trabajo general de este procedimiento se describe en la Figura 2.

1. Determinación de la dosis inhibidora del crecimiento

1. Preparación de la levadura cultivo durante la noche
   NOTA: Los medios de crecimiento de la levadura-extracto-peptona-dextrosa (YEPD) utilizado en este protocolo es una receta estándar ^13.
   1. Streak a las células en una placa de agar YEPD BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) y se incuba durante 48 horas a 30 ° C o hasta que se formen colonias visibles.
   2. Preparar cultivos de una noche mediante la inoculación de 5 ml de medio líq....

Resultados

Como una validación de este enfoque se realizó una pantalla genética química representante interacción del agente quimioterapéutico 5-fluorouracilo (5-FU) siguiendo el protocolo descrito anteriormente. 5-FU es conocido para interrumpir la timidilato sintasa, así como ADN y ARN metabolismo ^18. Las interacciones genéticas químicas de 5-FU son bien estudiado y se han investigado mediante técnicas de microarrays de código de barras de la levadura utilizando ambas colecciones supresión heterocigotos y homocigotos .......

Discusión

Esbozado aquí es un enfoque para la generación de perfiles de interacción química y genética. El método es simple: mediante la comparación de tamaños de colonia de cada cepa en colecciones integrales de supresión de genes en presencia y ausencia de un producto químico, todos los genes necesarios para tolerar un insulto química se identifican. Análisis de enriquecimiento de anotación de la lista resultante de cepas sensibles a continuación, se puede utilizar para proporcionar información sobre un modo de productos químic.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Extracto de levadura	BioBasic	G0961	Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 1% (p/v)
Tyrptone Powder	BD Biosciences	211820	Para medios líquidos/sólidos YEPD añadir hasta una concentración final del 2% (p/v)
Anachemia	dextrosa	31096-380	Para medios líquidos/sólidos YEPD, agregue una concentración final del 2% (p/v) — No lo haga en autoclave. Prepare la solución madre al 20%, filtre, esterilice y agregue a los medios después de esterilizar en autoclave.
Agar A	Bio Basic	FB0010	Para medios sólidos YEPD agregar al 2% de concentración final (w/v)
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Prepare 1,000x stock a 200  mg/ml en dH2O y filtro esterilizante.
Placa de 12 pocillos	Greiner Bio One	655180
Tubos de cultivo de 5 ml	Evergreen Scientific	222-2376-080
Placa de Petri de 10 cm	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	robot de fijación de matriz microbiana de alto rendimiento
PLUSPLATE© Placa de Petri	Singer Instrumentos	PLU-001	Caja de 200 platos
384 RePad de Pin Corto	Singer Instruments	RP-MP-384	Caja de 1,000 pads
1536 RePad de Pin Corto	Singer Instruments	RP-MP-1536	Caja de 1,000 almohadillas
Herramientas de fijación alternativas
Sistemas Robtic Totalmente Automatizados	S& P robotics	http://www.sprobotics.com	Varios sistemas automatizados de robótica e imaginación de manejo de colonias disponibles.
Herramientas de fijación manual	V& P Scientific http://www.vp-scientific.com		Herramientas y accesorios de replicación portátiles.

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