Utilizando ensayos ex vivo optimizados de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), demostramos que una preparación de productos de tabaco combustible suprime marcadamente las citocinas secretadas intracelularmente mediadas por receptores y la capacidad citolítica de las PBMC efectoras. Estos ensayos rápidos pueden ser útiles para la evaluación de productos y la comprensión de los posibles efectos a largo plazo de la exposición al tabaco.
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Artículo de método
Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto
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Resumen
Resumen
Entre otros cambios fisiopatológicos, la exposición crónica al humo del cigarrillo provoca inflamación y la supresión inmune, que han sido vinculados a un aumento de la susceptibilidad de los fumadores a infecciones microbianas y la incidencia de tumores. Ex vivo supresión de las respuestas inmunes mediadas por el receptor en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tratado con los componentes del humo es un enfoque atractivo para estudiar los mecanismos y evaluar los probables efectos a largo plazo de la exposición a los productos de tabaco. Aquí, hemos optimizado los métodos para llevar a cabo ensayos ex vivo utilizando PBMCs estimulados por lipopolisacárido bacteriano, un receptor-4 ligando Toll-like. Los efectos del humo de medio acondicionado conjunto (WS-CM), una preparación de productos de tabaco combustible (TPP), y la nicotina se investigaron sobre la secreción de citoquinas y la destrucción de células diana por PBMCs en los ensayos ex vivo. Se demuestra que las citoquinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 y citoquinas intracelulares IFN47 ;, TNF-α, y MIP-1α fueron suprimidos en PBMCs expuestos-WS-CM. La función citolítica de PBMCs efectoras, tal como se determina mediante un ensayo de célula diana K562 matar se redujo también por la exposición a WS-CM; nicotina era mínimamente eficaz en estos ensayos. En resumen, presentamos un conjunto de ensayos mejorados para evaluar los efectos de los TPP en ensayos ex vivo, y estos métodos podrían adaptarse fácilmente para probar otros productos de interés.
Introducción
Un importante conjunto de puntos de conocimiento a los efectos adversos para la salud del tabaquismo crónico, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de 1,2. Fumar cigarrillos crónica se ha sabido para causar la inflamación y la supresión inmune, y estas alteraciones se informó de contribuir a un mayor riesgo de infección microbiana y el cáncer en fumadores 3. In vitro y técnicas ex vivo son útiles en la elucidación de la base molecular de los efectos fisiopatológicos de el humo del cigarrillo 4-9 (Tabla 1) y se reconocen como importan....
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Protocolo
NOTA: consentimiento informado por escrito para hacer este estudio se obtuvo en una unidad de investigación clínica local bajo la aprobación del IRB, por Buenas Prácticas Clínicas. Procesamiento de la sangre, el aislamiento de PBMCs y otros experimentos de cultivo celular se realizan bajo condiciones estériles, utilizando suministros microbiológicamente estériles y reactivos.
1. WS-CM Preparación
- Generar WS-CM como se ha descrito previamente 12.
- Preparar WS-CM pasando humo de cuatro 3R4F cigarrillos de referencia a través de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo fenol mediante el siguiente rég....
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Resultados
Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (cuatro muestras de donantes). Se realizó la prueba t del estudiante entre las muestras de control de tratados y no tratados utilizando el software Excel, así como comparaciones de la prueba t para todos los tratamientos con sus correspondientes controles. La significación estadística se indica con: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Para medir el efecto de la exposición a WS-CM y la nicotina, PBMCs se tratar.......
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Discusión
Nosotros y otros han demostrado previamente que el tratamiento de las PBMC con TPPs suprime varias respuestas, incluyendo la expresión y secreción de citoquinas y medidas funcionales tales como célula diana matando a 14. Los métodos experimentales descritos en el anterior trabajo requieren períodos de incubación más largos y fueron modestos en magnitud 14. Teniendo en cuenta las posibles aplicaciones de este atractivo modelo ex vivo para la investigación básica y aplicada, se investigó si .......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo está financiado por RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) bajo un acuerdo de investigación en colaboración con la Wake Forest University School of Medicina. GL Prasad es un empleado a tiempo completo de RJRT.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 12 tubos de 75 mm | BD Falcon | 352058 | |
| tubos cónicos de 15 ml | Corning | 430790 | |
| Microtubos de 2 ml | Axygen | MCT-150-C-S | |
| de referencia | Univ. de Kentucky, Facultad de Agricultura | 3R4F | |
| Tubos cónicos de 50 ml | Corning | 430828 | |
| botella | de 500 mlCorning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| Placa de fondo plano de 96 pocillos | Termo Nunc | 439454 | |
| Placas de fondo redondas de 96 pocillos | BD Falcon | 353077 | |
| Campana de cultivo celular | Centrífuga Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Eppendorf | 58110R | ||
| CFSE | Sondas moleculares Life Technologies | C34554 | |
| Tubos de racimo | Corning | 4401 | Nocivos si se ingieren, carcinógenos |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | |
| DMSO (dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analiza los datos CBA |
| Unidad de filtro | Nalgene | 156-4020 | |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACS Canto II 8 | colores, a Ex 405 y Em 785. |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | FACS Calibur 4 | colores a Ex 495 y Em 785. |
| software de análisis por citometría de flujo | Tree Star | FlowJo | |
| Contenedor de congelación | Nalgene | 5100-0001 | Contiene DMSO, irritante |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinógeno, irritante, corrosivo |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| kit de citocinas inflamatorias humanas | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Anticuerpo | BD Horizon | 561980 | sensibilizador cutáneo |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Tampón de aislamiento | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Líquido inflamable, irritante |
| Alcohol isopropílico | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamina | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Anticuerpo | BD Pharmingen | 554730 | Toxicidad aguda, oral |
| Monensina | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotina | Sigma-Aldrich | N3876 | Toxicidad aguda, peligro ambiental |
| Parafilm | Bemis | " M" | |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | P6148 | Inflamable, irritación de la piel |
| Pluma/estreptococo | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Tampón de ejecución | MACS Tampón de ejecución, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-y alfa; Alexa Fluor 488 Anticuerpo | BioLegend | 502915 | |
| Pipeta de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Referencias
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogu....
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Reimpresiones y permisos
