Un Proteoliposoma Basada Eflujo Ensayo para determinar una sola molécula Propiedades de Cl - Canales y Transportadores

Resumen

Los proteoliposomas se utilizan para estudiar canales purificados y transportadores reconstituidos en un entorno bioquímico bien definido. Se ilustra un procedimiento experimental para medir el flujo de eflujo mediado por estas proteínas. Se describen los pasos para preparar los proteoliposomas, realizar los registros y analizar los datos para determinar cuantitativamente las propiedades funcionales de la proteína reconstituida.

Resumen

Los últimos 15 años se han caracterizado por una explosión en la capacidad de sobreexpresar y purificar proteínas de membrana de organismos procariotas, así como de eucariotas. Este aumento ha sido impulsado en gran medida por el exitoso impulso para obtener información estructural sobre las proteínas de membrana. Sin embargo, la capacidad de interrogar funcionalmente estas proteínas no ha avanzado al mismo ritmo y, a menudo, se limita a ensayos cualitativos de valor cuantitativo limitado, lo que limita los conocimientos mecanicistas que pueden proporcionar. Se describe un ensayo para investigar cuantitativamente la actividad de transporte de canales o transportadores ^{de Cl-} reconstituidos. El ensayo se basa en la medición de la tasa de eflujo de Cl^- de los proteoliposomas tras la adición del ionóforo K⁺ valinomicina para desviar el potencial de membrana. Se utiliza un electrodo sensible a los iones para seguir el curso temporal de los flujos iónicos de los proteoliposomas reconstituidos con la proteína deseada. El método es muy adecuado para estudios mecanicistas, ya que permite la determinación cuantitativa de las propiedades clave de la proteína reconstituida, como su velocidad de transporte unitaria, la fracción de proteína activa y la masa molecular de la unidad funcional. El ensayo también se puede utilizar para determinar el efecto de compuestos de moléculas pequeñas que inhiben/activan directamente la proteína reconstituida, así como para probar los efectos moduladores de la composición de la membrana o los reactivos modificadores de lípidos. En la medida de lo posible, se encontró que la comparación directa entre los resultados obtenidos con este método concordaba bien con los obtenidos con enfoques electrofisiológicos. La técnica se ilustra utilizando CLC-ec1, un intercambiador de H⁺/Cl^- de tipo CLC, como sistema modelo. El ensayo de eflujo se puede utilizar para estudiar cualquier canal/transportador ^{conductor de Cl-} y, con cambios mínimos, se puede adaptar para estudiar cualquier proteína transportadora de iones.

Introducción

En las últimas dos décadas la capacidad para sobreexpresar y purificar las proteínas de transporte de membrana ha aumentado dramáticamente: canales iónicos, transportadores primario y secundario están ahora purificaron rutinariamente a partir de sistemas de expresión heterólogos, así como de fuentes naturales. Constantemente se están desarrollando nuevos enfoques para controlar la expresión, mejorar y facilitar la extracción y mejorar la estabilidad de estas proteínas ^1-5. Estos avances tecnológicos han sido fundamentales en el desencadenamiento de la explosión de la información estructural a nivel atómico en las proteínas de membrana que, a su vez, mejora....

Protocolo

1. Preparación de lípidos

1. Alícuota de los lípidos cantidad deseados en un tubo de vidrio transparente. Tu Ves. coli extracto lipídico polar, pero la mayoría de composiciones lipídicas pueden ser utilizados. Si los lípidos están en forma de polvo, ellos resuspender en cloroformo a una concentración de 20 mg / ml. Secar los lípidos a TA bajo _N2 gas hasta que todo el disolvente se haya evaporado.
2. Resuspender los lípidos en pentano y secar de nuevo un flujo constante de gas N ₂ para eliminar los restos sobrantes de cloroformo. Seco hasta que todo el disolvente se haya evaporado. Si bien el secado, gire suavemen....

Resultados

Se describe un protocolo detallado y robusto para medir Cl ^- transporte mediado por purificada CLC-ec1, un procariota tipo CLC H ⁺ / Cl ^- intercambiador, reconstituido en liposomas. Una representación esquemática del experimento se muestra en la Figura 3 proteoliposomas reconstituidos con purificada CLC-ec1 y contiene alta Cl interna ^-. Se sumergen en un baño de solución que contiene bajo Cl ^-. Bajo estas condiciones netas Cl ^- flujo de s.......

Discusión

Hemos descrito un protocolo detallado para medir la Cl ^- transporte mediado por canales o transportadores reconstituidas en liposomas aniones selectiva purificados. El ejemplo utilizado fue el procariota H ⁺ / Cl ^- Intercambiador CLC-ec1. Sin embargo, la metodología se puede adaptar fácilmente para estudiar canales cerrados por ligandos ^{12,13,15, 11,12} tensión, o deportivo selectividad diferente aniónico ^15,16 sustituyendo el Ag: electrodo AgCl con uno adecuado para.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Liposomizador, Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.	610200
IEC Centra CL2 Sobremesa	Thermo Scientific
Orion Research Modelo 701A Medidor			Estos se pueden encontrar en Ebay.
Sonda de pH no funcional Cualquier sonda			de medidor de pH con cables de plata funcionará. Es necesario quitar el recubrimiento de vidrio/plástico y limpiar los cables.
Registrador de datos DI-710 Instrumentos			DATAQ
Software de adquisición WinDAQ	Instrumentos
Columnas de plástico desechables Pierce, flujo por gravedad, 2 ml	Pierce (Thermo Scientific)	29922
KIMAX Tubos de cultivo, desechables, vidrio de borosilicato	Kimble Chase	73500-13100
con soporte/bloque	calefactorAvanti Polar Lipids Inc.	Computadora 610000