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Artículo de método

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

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DOI:

10.3791/52370

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12 de marzo de 2015

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo sobre cómo determinar la cantidad y distribución de metales en una muestra utilizando fluorescencia de rayos X de sincrotrón. Nos centramos en las células adherentes y describimos el método de fijación química para preparar esta muestra. A continuación, describimos cómo montar y obtener imágenes de la muestra utilizando rayos X de sincrotrón.

Resumen

imágenes de fluorescencia de rayos X nos permite medir de forma no destructiva la distribución espacial y la concentración de múltiples elementos simultáneamente en áreas de muestra grandes o pequeñas. Se ha aplicado en muchas áreas de la ciencia, incluida la ciencia de los materiales, la geociencia, el estudio de obras del patrimonio cultural y en la biología química. En el caso de la biología química, por ejemplo, la visualización de las distribuciones de metales dentro de las células nos permite estudiar tanto los iones metálicos que se producen naturalmente en las células, como los metales introducidos exógenamente, como los fármacos y las nanopartículas. Debido a la naturaleza completamente hidratada de casi todas las muestras biológicas, la criofijación seguida de imágenes a temperatura criogénica representa la modalidad de imagen ideal disponible en la actualidad. Sin embargo, en circunstancias en las que tal combinación no es fácilmente accesible o práctica, la fijación química basada en aldehídos sigue siendo útil y, a veces, inevitable. Este artículo describe con el mayor detalle posible la preparación de células de mamíferos adherentes mediante fijación química para la obtención de imágenes fluorescentes de rayos X.

Introducción

De rayos X de imágenes de fluorescencia permite tanto la identidad y cantidad de los elementos presentes en una muestra a ser resuelto espacialmente. Los rayos X incidente, de una energía seleccionado para ser mayor que la energía del elemento más pesado de interés de unión de electrones, superar la energía de enlace de los electrones del centro de la concha al núcleo 1. Esto crea un "agujero" en la capa de electrones. Como los electrones de mayor energía caen en estos agujeros, rayos X fluorescentes se emiten cuya longitud de onda depende de la separación de energía de esos orbitales. Desde el espaciado de energía de los orbitales es característica de un elemento dado, la emisión de fluorescencia de rayos X también tiene longitudes de onda características, dependiendo del elemento. Es esta emisión a una longitud de onda característica que permite la identificación de los elementos presentes. La calibración de la intensidad de fluorescencia permite la cuantificación de los elementos presentes.

De rayos X microscópicas de fluorescenciay (XFM) se ha convertido cada vez más utilizado, en parte por el desarrollo de fuentes de sincrotrón de rayos X muy brillantes, como los que en primavera-8 en Japón, la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Francia, y el Advanced Photon Source ( APS) en los EE.UU. 2. Estas fuentes proporcionan haces de rayos X de muy alta intensidad. Al mismo tiempo, las mejoras en la óptica de rayos X, tales como la tecnología de placa de zona, permite la concentración de estos haces a manchas sub-micras, aunque bastante ineficiente 3. Con vigas de muy alta intensidad, incluso una relativamente pequeña cantidad de luz que puede enfocarse es suficiente para excitar los metales endógenos en las células, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología de detectores actualmente disponibles. Por lo tanto, el estudio de la biología química de metales en la célula es una aplicación en particular, que hace uso de muchos de los acontecimientos recientes en esta técnica 4-10.

Hay muchos factores críticos a tener en cuenta mientras Appacostado XFM para investigar la distribución elemental y cuantificación de células de mamífero cultivadas o de otras muestras biológicas. En primer lugar, la muestra debe mantenerse intacta, tanto estructuralmente como con respecto a su composición elemental, para que la medición sea significativa. En segundo lugar, la muestra también se debe preservar de alguna manera para que sea resistente a los daños de radiación que puede ser causado por un haz de rayos X enfocada. Una manera en que una muestra puede cumplir ambos criterios a la vez se va a congelar rápidamente en una vítreo, hielo amorfo 11,12. La congelación rápida se logra a menudo a través de diversas técnicas de criopreservación como la congelación de inmersión o de alta presión congelación 13-16. Es generalmente aceptado que la criopreservación conserva la arquitectura celular general y composiciones químicas en muestras biológicas tan cerca de estado nativo como sea posible. La fijación química, por otro lado, debido a la penetración lenta y selectiva de fijadores en células y tejidos como well cambios posteriores como en la permeabilidad de la membrana, pueden permitir varios iones celulares especialmente los iones difusibles, tales como Cl, Ca y K para ser lixiviado, perdidos o reubicados, haciendo así la investigación de estos elementos subóptimas 17-19. A pesar de la clara ventaja de la crio-fijación sobre la fijación química en general, para células de mamífero adherentes, en particular, la criopreservación tiene varias limitaciones 20-23. La más obvia es que no todos los laboratorios de investigación tiene fácil acceso a los instrumentos de criopreservación. La mayoría de los congeladores de alta presión actuales o incluso sumergen congeladores son costosos y propiedad solamente por un subconjunto de las instalaciones criogénicas, que puede ser muy lejos de donde se incuban las células. El beneficio de la criopreservación podría ser objeto de comercio para la desventaja de estrés del viaje colocado en las células. Así, mientras que la crioconservación es sin duda la forma más rigurosa para preservar muestras para el análisis de fluorescencia de rayos X, ciertamente no es el más accesible a todos los investigadores en todas las circunstancias;ni tampoco es siempre esencial - si los metales de interés están estrechamente vinculados a las macromoléculas que se pueden fijar, y la resolución en la que se tomó imágenes de la muestra es mayor que el daño a la ultra-microestructura que pudiera ocurrir durante el secado. Consciente de las advertencias 24, fijación química y secado pueden ser una buena opción.

Otros factores en el éxito de rayos X experimento de imágenes de fluorescencia incluyen un análisis adecuado. Imágenes de fluorescencia de rayos X es fundamentalmente de rayos X espectroscopia de emisión de fluorescencia combinado con la trama de exploración para proporcionar la resolución espacial. Los espectros de emisión de fluorescencia de rayos X recogidos contienen una combinación de la superposición de picos de emisión, los antecedentes y los picos de dispersión elástica e inelástica del haz incidente. Software que permite la de-convolución de estas aportaciones y en el acondicionamiento de los picos de emisión, ha sido un desarrollo crítico a este campo 25. También, el desarrollo y la dist comercialribution de normas de capa fina de composición conocida, que se utiliza para calibrar la intensidad de fluorescencia relativa a la cantidad de material, también ha sido muy importante.

Este protocolo proporciona una descripción de la preparación de células adherentes por la fijación química y secado al aire. Un paso vital en este proceso es el crecimiento de las células en las ventanas de nitruro de silicio, que a menudo no se adhieren bien, hacer un enjuague suave en una clave de la moda en particular para el éxito.

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Protocolo

1. Elaboración de Instrumentos, Sustratos, Medios de Cultivo y platos

  1. Manejo de nitruro de silicio (Si 3 N 4) ventanas.
    1. Abrir la cápsula ligeramente apretando un extremo que contiene la ventana de una manera tal como para no apretar la propia ventana, mientras gira el otro extremo de la cápsula con la otra mano.
    2. Echa un par de reversa, pinzas de punta fina bajo microscopio estereoscópico para asegurarse de que no hay adhesivas, lagunas o dobleces en la punta. De lo contrario, las ventanas se pueden romper por las pinzas o vuelan fuera de ellos durante las etapas posteriores.
    3. Retire la ventana de la cápsula sujetando cuidadosamente el marco de la ventana con pinzas, mientras que apretando suavemente la cápsula cerca del extremo abierto la aplicación de presión en una dirección para hacer que la cápsula más amplio donde los bordes de la ventana necesitan para salir.
  2. Ventana de pre-lavado (opcional).
    1. Si lo desea, ventanas pre-lavado por inmersión suavementeen agua destilada durante 5 segundos, seguido por 2 min de lavado en etanol al 70% y 2 min de lavado en etanol al 100%.
  3. Colocación y esterilización de las ventanas en la placa de cultivo.
    1. Para colocar las ventanas, configurar la ventana con el lado plano hacia arriba en la parte inferior de la placa de cultivo, coloque un pedazo de cinta adhesiva en un portaobjetos de vidrio limpio. Corte sobre una tira cuarto de pulgada por el lado largo de la cinta. Tome un trozo de cinta adhesiva de la parte corta (en ⅛ "por ¾") con una hoja de afeitar limpia.
    2. Use pinzas para aplicar la rebanada de cinta hasta el borde de la red o ventana. Use suficiente para adherirse firmemente que sin cubrir la misma abertura de la ventana. La manipulación de la cinta adherida con pinzas, configurar la ventana hacia abajo sobre la parte inferior de la placa de cultivo. Utilice la punta de las pinzas para adherir la cinta a la parte inferior de la placa de cultivo con firmeza.
    3. Aplique otra tira de cinta hasta el otro borde y se adhieren a la parte inferior esta firmemente con la punta de las pinzas.
    4. Una vez que todas las ventanas songrabada, esterilizar ventanas en placas de cultivo con luz ultravioleta (UV). Lograr esto colocando el plato bajo la lámpara UV en una campana de flujo laminar durante aproximadamente 1 hora.
    5. (Opcional) Si las ventanas son para ser pre-recubiertos con poli-lisina, hacerlo siguiendo ventana esterilización. Escudo de la ventana con 10 l de solución estéril lisina poli-L-0.01% durante 1 hora en una incubadora a 37 °, y luego enjuague la solución restante con los medios de cultivo.
  4. Preparar tampones para lavado final antes XFM.
    1. Preparar ya sea una Tris-glucosa o piperazina N, N 'bis (ácido etanosulfónico) (tuberías) -sacarosa tampón libre de cualquier metales traza con la osmolalidad y pH equivalente a tampón fosfato salino de Dulbecco (D-PBS) sin calcio y magnesio. Utilice uno de estos tampones para enjuagar las células después de las células se fijan químicamente.
      1. Para hacer la solución de Tris-glucosa (10 mM Tris, 260 mM de glucosa, ácido acético 9 mM,) añadir 1,4 g de glucosa, 36 mg de base Tris y16 l de ácido acético a 20 ml de agua ultrapura. Luego, ajustar el volumen final a 30 ml con agua ultrapura. No es necesario ajustar el pH. Guarde a temperatura ambiente hasta por una semana.
      2. Para hacer que los tubos de sacarosa (TUBOS 20 mM, sacarosa 200 mM) añaden 0,18 g de tuberías y 2,0 g de sacarosa a 20 ml de agua ultrapura y ajustar el pH a 7,4 con pequeñas cantidades de ácido acético concentrado. Luego, ajustar el volumen final a 30 ml con agua ultrapura. Guarde a temperatura ambiente hasta por una semana.
        NOTA: La razón para evitar el uso de PBS en el enjuague final es que las concentraciones de fosfato, cloruro y potasio en PBS son tan alta que puede interferir con XFM si no se elimina por completo antes de secado al aire.
  5. Preparar tampones para chapado celular.
    1. Preparar o llevar a cabo todos los medios de comunicación, como medio RPMI 1640, 1x solución de tripsina-EDTA, D-PBS, y cualquier otro reactivo que sean necesarios para la línea de células adherentes especialmente en lo que normalmente se hace para pasar las células adherentes of interés, y calentar a 37 ° C.

2. Chapado de células

  1. Para el plato de cultivo esterilizado que contiene las ventanas, en la campana de flujo laminar, agregar suavemente medios de comunicación (10 ml para una placa de cultivo de 100 mm), a lo largo del lado de la placa de cultivo con ella inclinada en un ángulo. Evitar la creación de la tensión superficial innecesarios o dejar caer los medios de comunicación directamente sobre la superficie de las ventanas de nitruro de silicio. A medida que se añadió medio, aliviar lentamente el ángulo de inclinación para recubrir la rejilla y ventana con medios de comunicación.
  2. Preparar la línea de células adherentes de interés apropiada, trypsinizing o raspar las células fuera de las placas como de costumbre para pases la línea celular. Realizar cualquier recuento celular, u otra preparación necesaria antes de la aplicación de las células a la placa fresca.
  3. Añadir células a la placa de cultivo con ventanas a una densidad celular que se necesita para alcanzar típicamente 50% -70% de confluencia el plazo de 24-72 hr, y se incuba a 37 ° C en un incubador humidificado con dióxido de carbono al 5%.
  4. Observar el crecimiento de las células de vez en cuando, utilizando un microscopio de luz invertida, hasta que la densidad celular deseada (normalmente 50% -70% de confluencia) se alcanza.

3. Fijación de las células

  1. Preparar fresco paraformaldehído al 4% en D-PBS por dilución de una acción comprado (por ejemplo, 25% de paraformaldehído) y ajustando el pH a 7,4 con ácido acético (para evitar la adición de exceso de sodio a la muestra).
  2. Cuando las células se han cultivado como se desee, y las manchas vitales (como Hoescht) se han aplicado y fotografiado, retire los medios por aspiración suave, inclinando el plato en un ángulo de 45 ° con una mano, y la aspiración con una pipeta mano con la otra .
    NOTA: En lugar de los medios de pipeteado invertido, una alternativa es escoger la ventana de arriba, sumerja la ventana en tubos de microcentrífuga con D-PBS dos veces y luego se coloca en un nuevo recipiente de cultivo con las soluciones para la adherencia durante 20 minutos seguido de 2 tiempos de lavado PBS para eliminar los fijadores residuales. Si se elige, vaya dircesados ​​directamente al paso 3.5.
  3. Enjuague el plato suavemente con D-PBS y reemplazar el líquido eliminado inmediatamente por la adición suavemente la fresca 4% PFA / PBS mientras se mantiene el plato en un ángulo de 45 °, el pipeteo hacia el lado del plato, y lentamente se relaja el ángulo de inclinación para permitir la solución de fijación para cubrir las ventanas. Mantener las células cubiertas con el fijador durante 20 min a RT.
  4. Retire el líquido por aspiración suave, de nuevo como antes, inclinando el plato ligeramente y aspirar a mano.
  5. Reemplace el líquido eliminado añadiendo suavemente algunos de los tubos / Solución de sacarosa, utilizando el método de inclinación y pipeteo describe en el Paso 3.3.
  6. Repita los pasos 3.4 y 3.5.
  7. Preparar los materiales para el secado.
    1. Reúna toallas sin pelusa como Kimwipes, y tirar uno fuera de la caja por lo que es muy útil muy rápido y fácil.
    2. Prepare un lugar limpio, no el nivel para ajustar la ventana que se seque. Establecer una estera de rejilla de caucho del tipo de los utilizados en microscopía electrónica, que tiene crestas tanla ventana puede ser apoyado en un extremo mientras se seca. Esto evitará que la ventana se queden atascados en la superficie de secado cuando se seca, y drenar el buffer restante hasta el borde de la muestra.
  8. Tweeze cuidado la cinta conectado a la ventana para celebrar la ventana hacia arriba fuera del líquido. Recuperar ventanas que se desprenden de la cinta mediante la aplicación de una pequeña cantidad de TUBOS / sacarosa para conseguir que flotan y luego recogerlos con las pinzas inversa.
  9. Con cuidado (sin tocar la propia ventana) ya fondo embadurnar cualquier TUBOS exceso / sacarosa desde el borde de la ventana con un Kimwipe. También embadurnar la parte posterior área de sangría utilizando un pliegue redondeado de un Kimwipe.
    NOTA: El objetivo es tener tan poco cristalización de sales o tampones en la superficie de la ventana como sea posible.
  10. Coloque la ventana sobre la estera de rejilla. Asegúrese de que la ventana no está plano en la estera de rejilla, pero apoyado en un borde (usando las crestas de la estera de rejilla) y tocar el menor de la cuadrículamat posible. Deje la ventana seco.

4. Montaje de la muestra e Imagen

  1. Una vez que la muestra se ha secado, verificar la presencia de células en las ventanas utilizando un microscopio de luz. Lleve a cabo esta verificación, antes de preparar las muestras para su transporte a un sincrotrón.
  2. Paquete de las ventanas para el transporte de la línea de luz de sincrotrón de alojamiento de su experimento. Colocar suavemente las ventanas con cinta en dos lados a un portaobjetos de vidrio, a continuación, colocar el portaobjetos de vidrio con cinta a la parte inferior de una placa Petri de plástico. Pegue el plato de Petri cerrada.
    NOTA: Antes de este punto, estos pasos pueden llevarse a cabo en cualquier laboratorio típico. Los siguientes pasos mejor se haría en una línea de luz de sincrotrón.
  3. Retire la cinta de la ventana con cuidado con unas pinzas. Utilice esmalte de uñas, en una capa fina, incluso a lo largo del borde de la ventana, para asegurar las ventanas a un soporte de aluminio proporcionado por los colaboradores línea de luz en el sincrotrón.
  4. Inserte el soporte de aluminio enuna cinemática de montaje, y luego se coloca en su posición en el microscopio de rayos X. Montar la muestra en un soporte de conectarlo a etapas motorizados, dentro de la cámara de muestra en la línea de luz.
  5. Después de salir del área de rayos X instrumento microscopio muestra (una jaula hecha de paredes de plomo llena), la configuración de la exploración. Usando software de línea de luz específica, elegir el área apropiada de la muestra a analizar, mientras se visualiza la posición del haz de rayos X sobre la muestra utilizando una cámara equipada con un vídeo en forma de cruz y pre-alineada con una cámara de centelleo aguas abajo.
  6. Elige la resolución adecuada para la muestra, basándose en una estimación del tamaño de la característica más pequeña de interés. Para imágenes de células de mamíferos individuales (~ 20 a 40 micras de tamaño), utilice una resolución de 0,25 hasta 0,5 micras. Para las áreas de tejidos de imágenes, y distinguir las capas de células entre sí, utilice una resolución de 2.20 micras.
  7. Elige el tiempo de permanencia apropiado para la muestra, basándose en una estimación de la cantidad de The Metal de interés presente. Para una exploración rápida visión, o si grandes cantidades de metales están presentes, use exploraciones mosca con tiempos de permanencia de 30 a 300 ms por píxel. Si poco material está presente, o para medir metales de baja abundancia relativa, utilizar exploraciones paso con tiempos de permanencia de 1-2 seg por píxel.
  8. Programar las exploraciones en el software de la línea de luz específica. Adquirir una imagen de trama de exploración. Trabajar en conjunto con los colaboradores línea de luz para analizar los datos con el software que identificarán los picos de energía característicos para cada elemento.

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Resultados

La capacidad de formación de imágenes de fluorescencia de rayos X para proporcionar información sobre muestras biológicas es contingente sobre estas muestras se preparan de una manera tal que son robustos a daño de la radiación en la escala de tiempo del experimento, y sin embargo, su composición química y sus características estructurales son bien preservado. En ver el resultado de una muestra que ha sido preparado como se describe anteriormente y la imagen, es posible ver que existe una variación en los elementos pres...

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Discusión

Imágenes de fluorescencia de rayos X es útil en muchos campos, incluyendo las geociencias, ciencias de los materiales y la biología química 26-34. Los avances en los rayos X de sincrotrón, y su centrado, han producido vigas de muy alta intensidad. Enfocado de rayos X vigas suficiente para excitar los metales endógenos en las células existen ahora, la producción de la señal que se puede medir con la tecnología disponible actualmente detector de deriva de silicio. Y el estudio de la biología química de metales ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Stefan Vogt por su ayuda en el ajuste de los datos representativos mostrados en este artículo, y por sus útiles discusiones. Los autores también agradecen a Chris Jacobsen por su apoyo a Q. J.

El uso de la Fuente Avanzada de Fotones, líneas de luz 2-ID-E y 8-BM-B, en el Laboratorio Nacional Argonne fue apoyado por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, bajo el Contrato No. DE-AC02-06CH11357.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ventanas de nitruro de silicioSilson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, Reino UnidoSiRN-5.0-200-2.0-200. Ordenar por talla. Tamaño de la membrana: 1,5 mm x 1,5 mm. Espesor: 200 mm; Nm. Tamaño del cuadro: 5  mm x 5 mm. Espesor del marco: 200 µm.Fuente alternativa: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Pinzas inversasCiencias de la Microscopía Electrónica, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Número gratuito: 800-523-5874, Fax: 215-412-845078520-5XEMS 5X, NC – Pinzas ultrafinas
Alfombrilla de rejilla de gomaCiencias de la Microscopía Electrónica, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Número gratuito: 800-523-5874, Fax: 215-412-845071170Tapete de rejilla redonda
Ácido acéticoSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052338826tampón de ácido acético concentrado de grado de metales traza
PIPESSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052P6757Tampón sólido PIPES
Solución madre de formaldehído ElectrónicaMicroscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Línea gratuita: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450RT 1711310 x 10 ml Ampollas de paraformaldehído acuoso al 20%

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