Los mosquitos transmisores de la malaria tienen una serie de características epidemiológicamente importantes que solo pueden detectarse mediante técnicas moleculares. Utilizando una plataforma de genotipado de SNP basada en MALDI-TOF, desarrollamos un ensayo para detectar simultáneamente múltiples rasgos clave (especie, resistencia a insecticidas, infección por parásitos y elección de huésped) de los vectores de la malaria.
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Artículo de método
Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria
En este artículo
Resumen
Resumen
El complejo de especies de Anopheles gambiae incluye el principal transmisores de la malaria mosquitos en África. Debido a que estas especies son de tal importancia médica, varios rasgos se caracterizan típicamente utilizando ensayos moleculares para ayudar en los estudios epidemiológicos. Estos rasgos incluyen la identificación de especies, resistencia a los insecticidas, el estado de infección del parásito, y la preferencia de acogida. Dado que las poblaciones del complejo Anopheles gambiae son morfológicamente indistinguibles, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza tradicionalmente para identificar las especies. Una vez que se conoce la especie, varios ensayos posteriores se realizan rutinariamente Para aclarar aún más características. Por ejemplo, mutaciones conocidas como KDR en un gen párrafo confieren resistencia contra el DDT y los insecticidas piretroides. Además, los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de PCR de detección de ADN del parásito Plasmodium se utilizan para detectar parásitos presentes en los tejidos de mosquitos. Por último, una combinación de PCR y digestiones con enzimas de restricción se puede utilizar para dilucidar preferencia host (por ejemplo, humano frente a sangre animal) mediante el cribado de la harina de sangre de mosquitos para el ADN-host específico. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos los ensayos mencionados anteriormente en un único 33SNPs de genotipado multiplex de reacción durante 96 o 384 muestras a la vez. Debido a que la MDA incluye múltiples marcadores para las especies, detección de Plasmodium, y la identificación de sangre anfitrión, la probabilidad de generar falsos positivos o negativos se reduce en gran medida a partir de ensayos anteriores que incluyen sólo un marcador por rasgo. Este ensayo robusto y simple puede detectar estos rasgos clave de mosquitos de manera rentable y en una fracción del tiempo de los ensayos existentes.
Introducción
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii y Anopheles gambiae son los principales vectores responsables de la transmisión de la malaria en África 1. Estas tres especies son morfológicamente indistinguibles 2 y sólo se pueden distinguir por ensayos moleculares 3-9. Además, hay muchos ensayos posteriores realizados rutinariamente para ayudar a los estudios epidemiológicos y de genética de población. Estos incluyen (1) un ensayo de genotipado para las islas de especiación 10-12, (2) un ensayo de genotipado reconocimiento no es sinónimo SNPs en el 1014 ª posición del aminoácido codón del gen para....
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Protocolo
1. Amplificación por PCR
- Mezclar todos los cebadores de PCR (Ver Tabla S1 complementario) en un microtubo de 1,5 ml. Cada SNP tiene dos primers (adelante y atrás). Asegúrese de que la concentración de reserva de cada cebador de PCR se mantiene a 100 mM. Hacer suficiente mezcla de cebadores de 500-1.000 reacciones para reducir el error y el tiempo de pipeteo en el banco (Ver Tabla S2 complementario). Si lo desea, preparar alícuotas de 100-200 reacciones por tubo y se almacena a -20 ° C.
- Preparar cóctel de PCR como se describe en el protocolo del fabricante (Tabla 1). El volumen para 96 reacciones incluye un voladizo de 20%. Vortex el tubo que co....
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Resultados
La identificación de especies:
Los 5 SNPs siguientes juntos identifican tres especies (A. arabiensis, A. y A. gambiae coluzzii) (Tabla 4). Si una muestra no es una de las tres especies, los tres SNPs (01073-213, 04679-157 y 10313 -052) no amplifican.
kdr genotipo para inferir resistencia a los insecticidas:
El codón de 1014 º del canal de sodio gated-tensión .......
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Discusión
La MDA se compone de cinco pasos principales: la amplificación por PCR, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de reacción, de extensión SNP, producto de extensión de acondicionamiento, y la matriz con ayuda de láser desorción / ionización - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) 33-37. La primera etapa de amplificación PCR amplifica ADN que flanquea cada SNP de manera que la plantilla de ADN lo suficientemente estará disponible en la etapa de extensión de SNP. La reacción SAP neutraliza dNTPs no utilizados que pueden int.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Anthony Cornel y Laura Norris en la UC Davis y el Dr. Katharina Kreppel en la Universidad de Glasgow para proporcionar muestras de mosquitos de Tanzania. Damos las gracias a la Sra Smita Das y el Dr. Douglas Norris de la Escuela Johns Hopkins de Salud Pública para el intercambio de muestras de mosquitos de Zambia. También damos las gracias al Sr. Lee V. Millon en el Laboratorio de Genética Veterinaria para la formación en diseño de ensayo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01AI 078.183 y R21AI062929.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Analizador MassARRAY Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF espectrometría de masas para aplicaciones genómicas para analizar ácidos nucleicos. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfiere los productos de reacción iPLEX completados al |
| conjunto de reactivos de genotipado SpectroCHIP iPLEX Gold | Sequenom | 10158 | Reactivos utilizados para el ensayo iPLEX, incluido el kit SAP. |
Referencias
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gamb....
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Reimpresiones y permisos
