Artículo de método

Un ensayo multi-detección para los mosquitos transmisores de la malaria

DOI:

10.3791/52385

⸱

28 de febrero de 2015

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1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, School of Veterinary Medicine, University of California - Davis, 2Veterinary Genetics Laboratory, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

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Los mosquitos transmisores de la malaria tienen una serie de características epidemiológicamente importantes que solo pueden detectarse mediante técnicas moleculares. Utilizando una plataforma de genotipado de SNP basada en MALDI-TOF, desarrollamos un ensayo para detectar simultáneamente múltiples rasgos clave (especie, resistencia a insecticidas, infección por parásitos y elección de huésped) de los vectores de la malaria.

Resumen

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El complejo de especies de Anopheles gambiae incluye el principal transmisores de la malaria mosquitos en África. Debido a que estas especies son de tal importancia médica, varios rasgos se caracterizan típicamente utilizando ensayos moleculares para ayudar en los estudios epidemiológicos. Estos rasgos incluyen la identificación de especies, resistencia a los insecticidas, el estado de infección del parásito, y la preferencia de acogida. Dado que las poblaciones del complejo Anopheles gambiae son morfológicamente indistinguibles, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza tradicionalmente para identificar las especies. Una vez que se conoce la especie, varios ensayos posteriores se realizan rutinariamente Para aclarar aún más características. Por ejemplo, mutaciones conocidas como KDR en un gen párrafo confieren resistencia contra el DDT y los insecticidas piretroides. Además, los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de PCR de detección de ADN del parásito Plasmodium se utilizan para detectar parásitos presentes en los tejidos de mosquitos. Por último, una combinación de PCR y digestiones con enzimas de restricción se puede utilizar para dilucidar preferencia host (por ejemplo, humano frente a sangre animal) mediante el cribado de la harina de sangre de mosquitos para el ADN-host específico. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos los ensayos mencionados anteriormente en un único 33SNPs de genotipado multiplex de reacción durante 96 o 384 muestras a la vez. Debido a que la MDA incluye múltiples marcadores para las especies, detección de Plasmodium, y la identificación de sangre anfitrión, la probabilidad de generar falsos positivos o negativos se reduce en gran medida a partir de ensayos anteriores que incluyen sólo un marcador por rasgo. Este ensayo robusto y simple puede detectar estos rasgos clave de mosquitos de manera rentable y en una fracción del tiempo de los ensayos existentes.

Introducción

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Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii y Anopheles gambiae son los principales vectores responsables de la transmisión de la malaria en África 1. Estas tres especies son morfológicamente indistinguibles 2 y sólo se pueden distinguir por ensayos moleculares 3-9. Además, hay muchos ensayos posteriores realizados rutinariamente para ayudar a los estudios epidemiológicos y de genética de población. Estos incluyen (1) un ensayo de genotipado para las islas de especiación 10-12, (2) un ensayo de genotipado reconocimiento no es sinónimo SNPs en el 1014 ª posición del aminoácido codón del gen para (la resistencia knock-down, o kdr, SNP) 13 -18, (3) la detección de parásitos PCR 19-23, y (4) la detección de ADN-host específico en midguts de mosquitos 24,25.

Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos estos ensayos en una reacción multiplex individual con el objetivo de unaalyzing características epidemiológicamente importantes de vectores de la malaria en África. El ensayo MDA incluye múltiples marcadores para la detección de (1) especies (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, u otro (ninguno de los tres)), (2) resistencia a los insecticidas representado en kdr SNPs (tanto L1014F y L1014S) , (3) la presencia de dos importantes parásitos de la malaria, Plasmodium falciparum y P. vivax, y (4) fuente de sangre de uno aviar y seis huéspedes mamíferos.

Tradicionalmente, estos ensayos se llevaron a cabo en reacciones en cadena de la polimerasa por separado. Cuando todos estos ensayos se realizaron utilizando una plataforma PCR convencional, se requiere la realización de 8-10 ensayos de reacción de PCR y acompañar los pasos de electroforesis en gel. Cada reacción individual PCR desde la preparación hasta que documentan los resultados toma 4-5 horas, mientras que el método de MDA se presenta aquí toma aproximadamente 5 horas en su totalidad. Esto es equivalente a un 90% de ahorro en costos de mano de obra solamente. La MDA presentó aquí cuesta $ 5por muestra para determinar el genotipo de los 33 SNPs. Esto es considerablemente menos costoso que los ensayos individuales basados ​​en gel de agarosa, que cuesta alrededor de $ 1.50 por muestra. Los ensayos que detectan todas las características cubiertas por la MDA requeriría un mínimo de 8-10 ensayos basados ​​en gel de agarosa separadas por un costo de $ 15.12 por cada muestra. Además, la MDA reduce enormemente la posibilidad de generar un falso positivo o negativo mediante la utilización de al menos tres marcadores para cada parásito o fuente de acogida de detección.

La plataforma se utilizó no se limita a vectores de la malaria, pero se puede utilizar en una amplia variedad de aplicaciones tales como la medicina, medicina veterinaria, y la biología básica 26-28. Estudios en profundidad de asociación o de genética de poblaciones estudios con un gran número (con el fin de 100s) de muestras requieren ensayos de cribado rentables para varios marcadores simultáneamente. La mayoría de los estudios que utilizan dos o más ensayos de PCR separadas podrían implementar el MDA para resultados más rápidos a un costo menor.

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Protocolo

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1. Amplificación por PCR

  1. Mezclar todos los cebadores de PCR (Ver Tabla S1 complementario) en un microtubo de 1,5 ml. Cada SNP tiene dos primers (adelante y atrás). Asegúrese de que la concentración de reserva de cada cebador de PCR se mantiene a 100 mM. Hacer suficiente mezcla de cebadores de 500-1.000 reacciones para reducir el error y el tiempo de pipeteo en el banco (Ver Tabla S2 complementario). Si lo desea, preparar alícuotas de 100-200 reacciones por tubo y se almacena a -20 ° C.
  2. Preparar cóctel de PCR como se describe en el protocolo del fabricante (Tabla 1). El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%. Vortex el tubo que contiene el cóctel de PCR ligeramente y centrifugar durante 30 segundos a 2.000 x g.
  3. Dispensar 3 l de cóctel de PCR en cada pocillo de un no-bordeado placa de 96 pocillos. Una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  4. Añadir 2 l de ADN genómico adecuada de los mosquitos en cada pocillo.
    NOTA: Proceso de obtención de ADN genómico a partir de m tejidos osquito (cabeza / tórax, abdomen o del cuerpo entero) se describe en otras literaturas 29-32. Elige un protocolo de extracción de ADN apropiada para diferenciar aquellos con Plasmodium en la sangre (abdomen) de los mosquitos infecciosos (Plasmodium en la cabeza / tórax). Utilizamos típicamente ADN extraído de las partes del cuerpo (cabeza / tórax o abdomen) de mosquitos, por lo que la concentración de ADN varía de 0.05-2ng / l. Aunque la entrada de ADN total es inferior a la recomendación del fabricante (5-10ng / reacción), típicamente obtenemos robusta SNP llama desde el 98% de las muestras de ADN sin amplificación de todo el genoma.
  5. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g.
  6. Utilice el siguiente protocolo termociclador para llevar a cabo la amplificación por PCR: (1) 94 ° C durante 2 min, (2) 94 ° C durante 30 seg, (3) 56 ° C durante 30 seg, (4) 72 ° C durante 1 min , (5) repetir la etapa (2) - (4) para 45 ciclos, (6) 72 ° C durante 1 min, y 4 ° C espera.
_title "> 2. Tratamiento SAP

  1. Prepare la solución de enzima SAP en una placa de 96 pocillos (Ver Tabla 2). Procesar 96 muestras en una placa. El volumen para 96 ​​reacciones incluye un voladizo de 20%.
  2. Vortex el tubo de solución de enzima SAP suavemente y centrifugar durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de la solución de enzima SAP en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  3. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Incubar la placa de la siguiente manera: (1) 37 ° C durante 40 min, (2) 85 ° C durante 5 min para inactivar la enzima, (3) 4 ° C espera. Al finalizar este paso, la placa de almacenar a -20 ° C antes de continuar. Procese la plancha almacenado dentro de 2 semanas.

3. Extensión SNP

  1. Si la placa de muestra se congela después del tratamiento SAP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder.
  2. Preparar la mezcla de cebador de extensión (complementario el cuadro S2). Cada SNP tiene una exteimprimación nsion. Mantener la concentración de reserva de cada cebador de extensión a 500 mM. Opcionalmente, alícuota de 100 a 200 reacciones por tubo y almacenar a -20 ° C.
  3. Preparar la mezcla de extensión como se describe en la Tabla 3. El volumen de reacción 96 incluye un saliente de 20%.
  4. Vortex el tubo de cóctel de extensión a la ligera y se centrifuga durante 30 segundos a 2000 x g. Dispensar 2 l de cóctel de extensión en cada pocillo. Una vez más, una pipeta repetidor puede ahorrar tiempo para este proceso.
  5. Sellar la placa, mezclar suavemente o vórtice, y centrifugar durante 1 min a 370 x g. Termociclo la placa como se muestra en la Figura 1. En este punto, proceda a espectrometría de masas o almacenar la placa a -20 ° C hasta 2 semanas.

4. Acondicionamiento de la extensión del producto SNP para optimizar el análisis de Espectrometría de Masas

  1. Si la placa de muestra se congela después de la extensión SNP, deje que se descongele a temperatura ambiente antes de proceder.
  2. Transferir 15 mg de resina de su contaINER sobre la placa de depresión utilizando una cuchara alargada. Utilice el rascador para difundir la resina en los pocillos de la placa de depresión. Barra el raspador de lado a lado a través de la placa de depresión para difundir la resina. Asegúrese de que hay resina en cada pocillo.
  3. Raspe el exceso de resina de la placa de depresión con la rasqueta. Deje que la resina de pie en la placa de hoyuelo durante al menos 20 min. Mientras que deja la resina de pie en la placa de hoyuelo, añadir 41 l de agua de grado HPLC a cada pocillo de la placa de muestra.
  4. Con cuidado, coloque la placa de muestra al revés, sobre la placa de depresión. Asegúrese de que se restablezca el plato de muestras contra el pequeño puesto redondeado de la placa de depresión, que alinea los pozos de la placa de la muestra con los pozos de la placa de depresión.
  5. La celebración de la placa de la muestra y la placa de depresión juntos, dar la vuelta suavemente sobre lo que la resina se cae de la placa de depresión en los pocillos de la placa de la muestra. Toque en la placa de depresión por lo que la resina se cae en la placa de muestra. Asegúrese de que toda la resina en la diplaca mple cae en los pocillos de la placa de la muestra. Centrifugar la placa a 3200 xg durante 30 seg.
  6. Girar la placa de muestra en un aparato rotatorio durante 5 min a RT. Rotador debe girar la placa de muestra de 360 ​​° alrededor del eje largo.
  7. Centrifugar la placa de muestras a 3.200 g durante 5 min. Después de este paso, almacenar la placa de muestra a -20 ° C hasta 2 semanas antes de proceder al siguiente paso.

5. MALDI-TOF espectrometría de masas

  1. Transferir el producto de extensión del SNP acondicionado en un BioArray tales como SpectroCHIP según las instrucciones del fabricante. Utilizamos MassArray Nanodispenser para este paso.
  2. Una vez que se complete la transferencia, definir cómo los ensayos y las placas se van a establecer en la base de datos de ensayo. Nombre del ensayo y placas de tal manera que cada placa tiene identificador único que une al diseño específico de ensayo (Suplementario Tabla S3).
  3. Después de ensayo y la placa se han definido, adquirir espectros utilizando un espectrómetro de masas.

6. Análisis de Datos

  1. Realizar análisis de datos utilizando un análisis en tiempo real PCR software de interpretación de datos, como Typer analizador o TyperViewer (Sequenom). Obtener datos en formato .xml que contiene el diseño de la muestra, espectrograma de masas para cada pozo, la información de marcadores incluyendo nombre, masa esperada para cada variante del SNP correspondiente, y cualquier error o mensajes de advertencia relacionados con cada reacción. Vea la Figura 2 para el espectrograma de masas resultante.
  2. Llevar a cabo el análisis de agrupamiento SNP genotipo estableciendo el umbral de detección (magnitud o relación señal a ruido) y la tolerancia / varianza permitido para cada genotipo. La Figura 3 muestra un ejemplo de un 04707-KDR # 2 grupos de genotipo de SNP.
  3. Exportar los resultantes llamadas SNP genotipo en un programa de hoja de cálculo.

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Resultados

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La identificación de especies:

Los 5 SNPs siguientes juntos identifican tres especies (A. arabiensis, A. y A. gambiae coluzzii) (Tabla 4). Si una muestra no es una de las tres especies, los tres SNPs (01073-213, 04679-157 y 10313 -052) no amplifican.

kdr genotipo para inferir resistencia a los insecticidas:

El codón de 1014 º del canal de sodio gated-tensión ...

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Discusión

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La MDA se compone de cinco pasos principales: la amplificación por PCR, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de reacción, de extensión SNP, producto de extensión de acondicionamiento, y la matriz con ayuda de láser desorción / ionización - tiempo de vuelo (MALDI-TOF) 33-37. La primera etapa de amplificación PCR amplifica ADN que flanquea cada SNP de manera que la plantilla de ADN lo suficientemente estará disponible en la etapa de extensión de SNP. La reacción SAP neutraliza dNTPs no utilizados que pueden int...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los Dres. Anthony Cornel y Laura Norris en la UC Davis y el Dr. Katharina Kreppel en la Universidad de Glasgow para proporcionar muestras de mosquitos de Tanzania. Damos las gracias a la Sra Smita Das y el Dr. Douglas Norris de la Escuela Johns Hopkins de Salud Pública para el intercambio de muestras de mosquitos de Zambia. También damos las gracias al Sr. Lee V. Millon en el Laboratorio de Genética Veterinaria para la formación en diseño de ensayo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01AI 078.183 y R21AI062929.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Analizador MassARRAY CompactSequenomMT9MALDI-TOF espectrometría de masas para aplicaciones genómicas para analizar ácidos nucleicos.
MassARRAY NanodispenserSequenomRS1000Transfiere los productos de reacción iPLEX completados al
conjunto de reactivos de genotipado SpectroCHIP iPLEX GoldSequenom10158Reactivos utilizados para el ensayo iPLEX, incluido el kit SAP.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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