Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes

Resumen

Este protocolo describe la disociación rápida no enzimática de fragmentos de tejido humano fresco para la evaluación cualitativa y cuantitativa de células CD45⁺ (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Además, el sobrenadante obtenido del homogeneizado de tejido primario puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

Resumen

La capacidad de las células malignas para evadir el sistema inmune, caracterizado por el escape del tumor de ambos respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se acepta ahora como un sello importante de cáncer. Nuestra investigación sobre el cáncer de mama se centra en el papel activo que desempeñan linfocitos infiltrantes de tumores en la progresión tumoral y la evolución del paciente. Hacia este objetivo, hemos desarrollado una metodología para el aislamiento rápido de células linfoides intactos de tejidos normales y anormales en un esfuerzo para evaluar los próximo a su estado nativo. Los homogeneizados preparados usando un espectáculo disociador mecánica tanto una mayor recuperación de la viabilidad celular y preservando al mismo tiempo la expresión receptor de superficie en comparación tejidos digeridos con enzima para. Por otra parte, la digestión enzimática del material insoluble restante no se recuperó células CD45 ⁺ adicionales que indican que las mediciones cuantitativas y cualitativas en el homogeneizado primaria probablemente reflejen realmente la infiltración de las subpoblaciones en la Fragm tejidoent. Las células linfoides en estos homogeneizados pueden ser fácilmente caracterizado usando inmunológica (fenotipo, la proliferación, etc.) o molecular (ADN, ARN y / o proteína) enfoques. Células CD45 ⁺ también pueden ser utilizados para la purificación subpoblación, la expansión in vitro o crioconservación. Un beneficio adicional de este enfoque es que el sobrenadante tejido primario a partir de los homogeneizados se puede utilizar para caracterizar y comparar citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos presentes en tejidos normales y malignos. Este funciones de protocolo extremadamente bien para los tejidos de mama humanos y deberían ser aplicables a una amplia variedad de tejidos normales y anormales.

Introducción

El microambiente tumoral está compuesto por varios tipos de células, con numerosos estudios que demuestran que cada uno de ellos desempeña funciones distintas e importantes en la tumorigénesis^1,2. Estos incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias infiltrantes, células estromales, células endoteliales y células tumorales³. Estudios ex vivo de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL; Las células CD45⁺ o leucocitos, que son predominantemente linfocitos en los tumores de mama) de muestras frescas de tejido humano se ven dificultadas por su baja frecuencia, los pequeños tamaños de muestra a menudo disponibles para la investigación y la posibilidad de pérdida de viabilidad durante la extracción. Debido a que las células inmunitarias que infiltran los tumores suelen estar presentes como pasajeros en lugar de residentes permanentes, en general son más fáciles de liberar de la matriz tisular.

Disociar el tejido tumoral mientras se mantiene la integridad celular es técnicamente desafiante y tradicionalmente se ha realizado utilizando una combinación de pasos mecánicos y enzimáticos para preparar suspensiones unicelulares^4-8. Este enfoque implica largos períodos de incubación y se asocia con una reducción significativa de la viabilidad celular, así como con la pérdida de receptores de la superficie celular por escisión enzimática. Los estudios de citometría de flujo de alta calidad que caracterizan el TIL en el microambiente tumoral, así como las purificaciones limpias de las subpoblaciones de CD45⁺ mediante citometría de flujo o perlas recubiertas de anticuerpos, son más difíciles de lograr a partir de tejido tumoral digerido por enzimas. Además, el sobrenadante (SN) del homogeneizado tumoral resultante no es susceptible de análisis adicionales, incluida la cuantificación de las proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas o antígenos tumorales) o el tratamiento experimental de las células normales, debido al potencial de degradación de proteínas en los digestos enzimáticos.

En nuestra búsqueda de un método para preparar homogeneizados de células individuales a partir de tejidos mamarios [incluyendo tejidos mamarios tumorales, no tumorales no adyacentes (NANT) y normales (a partir de reducciones mamarias)] sin digestión enzimática, probamos una variedad de técnicas de homogeneización mecánica. Los homogeneizados preparados utilizando un disociador mecánico aumentaron la viabilidad celular (2 veces) y la recuperación total de células (2 veces), al tiempo que preservaron la expresión del receptor de superficie. La digestión enzimática del material insoluble restante no recuperó células CD45⁺ adicionales, lo que sugiere que todas se liberaron en el homogeneizado inicial. Por lo tanto, este enfoque rápido y simple permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las subpoblaciones CD45⁺ presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Una ventaja añadida de este enfoque es que el SN del homogeneizado inicial (SN de tejido primario) puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.

Protocolo

NOTA: Todos los especímenes fueron adquiridos utilizando un protocolo aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Jules Bordet con el consentimiento informado por escrito obtenido de cada paciente.

1. Preparación del homogeneizado de tejido

1. Diseccionar tejidos resecados (tejido maligno y normal resecado de la sala de operaciones) están en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomada la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normal se procesan de forma rutinaria plazo de 1 - 3 horas de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 usando procedimientos de bioseguridad estándar para los tejidos humanos. Un diagrama de flujo del protocolo se ilustra en la Figura 1.
2. Pesar todos los fragmentos de tejido (normal, NANT y tumorales) y medir la longitud, anchura y altura (largo x ancho x alto). Este es un paso importante para la posterior normalización de las subpoblaciones de células, el ARN extraído, etc.
   NOTE: El rango de tamaño de la muestra es de 100 a 10.000 mm ³ con nada de grasa si es posible.
3. Pie de imprenta el fragmento del tumor en un portaobjetos de vidrio para tinción H & E para verificar que el tejido es en realidad parte del tumor.
   1. Para ello, pulsando un microscopio portaobjetos de vidrio en el fragmento del tumor y aplicar una suave presión con los dedos durante unos segundos.
   2. Fijar el portaobjetos con isopropanol durante 2 min seguido de una etapa de lavado en agua. Contratinción el tejido durante 30 segundos con hematoxilina de Mayer.
   3. Lave la diapositiva en seis baños de agua. Teñir en Floxina B 2% durante 15 s.
   4. Lave en un baño de agua, seguido de cuatro baños de isopropanol y terminar con un baño de agua.
   5. Incubar en isopropanol durante 1 min y de drenaje. Claro en dos baños de xileno.
   6. Montar con medio de montaje basado xileno. Examine para celularidad tumoral (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, las células tumorales se adhieren a la diapositiva improntado - el estroma, linfoide o adipose células raramente permanecen, dejando espacios entre las células tumorales (Figura 2).
4. Coloque el fragmento de tejido en un pequeño plato de cultivo que contiene 1 ml de la, medio de células hematopoyéticas libre de suero definido químicamente (en lo sucesivo denominado medio) a temperatura ambiente y trocea en pedazos pequeños (~ 1 - 2 mm ²⁾ utilizando un estéril bisturí.
5. Transferir todo (fragmentos de tejido + medio) a un tubo disociador C mecánica.
6. Enjuague la placa de Petri y el bisturí con 2 ml de medio con una pipeta Pasteur y añadir esta al tubo C (volumen de medio para la disociación = 3 ml).
7. Utilice la A.01 programa disociador mecánico para tubos C (el programa más suave) para homogeneizar los fragmentos de tejido en una suspensión de células individuales. Coloque el tubo de C en el aparato y ejecutar el programa dos veces seguidas (un ciclo = 25 segundos).
   NOTA: Este procedimiento de homogeneización se ha establecido y validado por el tejido mamario humano, otra tumo tejido o tipos pueden necesitar usar un programa diferente y debe ser probado primero.
8. Retire el tubo C del aparato y decantar el homogeneizado directamente en un filtro de células de 40 micras sentado en un tubo de 50 ml. Usando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, transferir cualquier líquido restante en el tubo C para el filtro de células.
9. Transferir el líquido filtrado en un tubo de 15 ml con una punta de micropipeta 1 ml. Temporalmente mantener el filtro de células y su tubo 50 ml.
10. Enjuague el tubo C con un adicional de 3 ml de medio y transferir este, de nuevo utilizando la misma pipeta Pasteur como en el paso 1.6, para el filtro de células todavía sentado en el tubo de 50 ml. Exprima una cantidad máxima del líquido residual atrapado en el tejido no homogeneizada en el tubo de 50 ml moviendo suavemente alrededor del filtro con una pipeta Pasteur limpia o 1 ml punta que posteriormente desechado para evitar contaminar el eluido.
11. Coloque el colador celular al revés de tél tubo C original y enjuague con 3 ml de medio para que el tejido no homogeneizada cae de nuevo en el tubo C.
12. Vuelva a homogeneizar como en el paso 1.7 para dos ciclos del programa A.01.
13. Verter esta segunda homogeneizado a través del filtro de células sentado en el tubo de 50 ml, lavar el tubo C de nuevo con medio de 3 ml (como en el paso 1,10) y transferir con la pipeta Pasteur para el filtro de células sentado en el tubo de 50 ml de nuevo apretando un máximo cantidad de líquido desde el tejido conectivo residual atrapado en el filtro de células.
14. En este punto, un volumen de ~ 2,5 ml es en el tubo de 15 ml y ~ 9 ml en el tubo de 50 ml.

2. La separación del sobrenadante de tejidos y células

1. Centrifugar los homogeneizados en los 15 ml y 50 ml tubos durante 15 min a 600 xg a temperatura ambiente.
2. Decantar el SN desde el tubo de 15 ml en un tubo limpio y almacenar temporalmente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primario, NANT o Ti normalesDICIÓN SN (volumen final de 2,5 ml) se precisó y alicuotó antes de su almacenamiento a -80 ° C para análisis futuros (ver más abajo).
3. Desechar el sobrenadante del tubo de 50 ml.
4. Resuspender suavemente ambos sedimentos celulares en un volumen final de 1 ml de medio. Brevemente, primero romper suavemente el sedimento celular en ambos tubos (tocando el tubo sobre una superficie dura). Resuspender el sedimento celular suelta en los 50 ml con 500 l de medio y transferir la suspensión celular al tubo de 15 ml para resuspender el pellet segundos. Repita este paso una vez con los segundos 500 l de medio para la recuperación máxima de las células.
5. Transferencia de 10 l de la suspensión celular a un tubo pequeño, mezcle con 10 l de azul de tripano (dilución 1: 1) y contar el número de células viables utilizando un hemocitómetro.
   NOTA: En este punto una fracción de la suspensión celular puede también ser analizada por citometría de flujo para evaluar el tamaño celular, granularidad y si se desea un número limitado de marcadores subpoblación para más precise evaluación de la distribución relativa de célula en el homogeneizado antes de extenso análisis o experimentación. Todos los análisis por citometría de flujo incorporan etiquetado CD45 para la normalización de las subpoblaciones.
6. Sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Las células del tumor, NANT, o tejido normal están ahora listos para la purificación adicional o análisis. Estos pasos adicionales son mejores cuando se realizan en el mismo día de la cirugía.
   NOTA: Para el análisis de citometría de flujo pero no de clasificación de células de las células rojas de la sangre residual debe ser lisadas después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de sangre roja tampón de lisis celular al sedimento celular, inmediatamente agitación durante 1 seg y la incubación de un mínimo de 10 min en la sala de temperatura (protegido de la luz) antes del análisis.

3. Aclaración del sobrenadante de Tejidos

1. Centrifugar los tubos de 1,5 ml con SN tejido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
2. Retire con cuidado tél sobrenadante sin tocar o alterar el sedimento. Transferir a un tubo limpio (o tubos) dependiendo del número y volumen de alícuotas deseados.
3. Almacenar el sobrenadante a -80 ° C para uso futuro.

4. sangre del paciente

1. Se recoge una muestra de sangre de cada paciente como un control por punción venosa en tubos heparinizados el día antes de la cirugía. Centrifugar la sangre a 400 xg durante 10 min a 20 ºC con el freno para obtener el plasma y la capa leucocitaria.
2. Retire el plasma y clarificar por centrifugación a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alícuota y almacenar plasma a -80 ° C para uso futuro. Se diluye la capa leucocitaria en medio
3. Separar las células mononucleares utilizando estándar de centrifugación en gradiente de Ficoll-Hypaque antes del análisis inmediato, el aislamiento subpoblación, ADN / ARN / extracción de la proteína o la criopreservación.

5. Citometría de Flujo

1. Las células de la etiqueta según fabricacióninstrucciones del r a 4 ° C, protegido de la luz. Lisar las células rojas de la sangre en las suspensiones de células a partir de fragmentos de tejido después del marcaje de anticuerpos mediante la adición de 0,4 ml de tampón de lisis celular al sedimento celular.
2. Vortex inmediatamente durante 1 segundo e incubar un mínimo de 10 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Pasar las células marcadas en un citómetro de flujo para la adquisición de datos sin lavar.

Resultados

La digestión enzimática de fragmentos de tejido, ya sea con soluciones disponibles en el mercado de disociación de tejido o diversas mezclas de laboratorio de colagenasa, DNasa y / o inhibidores de hialuronidasa, escinden una amplia variedad de receptores en la superficie de las células. Nuestros estudios, se centró inicialmente en las células T CD4 ⁺ que infiltran los tumores de mama, se presentaron rápidamente con un problema técnico importante debido a la escisión de los receptores de CD4 de la superficie ...

Discusión

Este estudio describe un método optimizado para la rápida preparación de los homogeneizados de tejidos normales y malignos de mama sin digestión enzimática para la clasificación posterior de células, la extracción, la criopreservación y / o análisis fenotípico de CD45 ⁺ subpoblaciones. El objetivo de este enfoque experimental es para producir imágenes de la TIL que refleja de cerca su estado in vivo y compararlos con los tejidos normales con mínima manipulación de los tejidos frescos de la sala de op...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
GentleMacs Disociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine es algo equivalente
centrífuga 5810	R Eppendorf		u otra centrífuga de mesa estándar
Centrífuga 5417	R Eppendorf		u otra microcentrífuga estándar
Esco Clase II A2 Gabinete de bioseguridad	ESCO global		u otra campana
estándar BSL2Microscopio invertido	Nikon eclipse TS100		u otro microscopio compatible para un hemacitómetro
Bü rker Cámara	Marienfield	640210	u otro hematitómetro estándar
Citómetro de flujo Navios	Beckman Coulter		u otro citómetro de flujo (se recomiendan 8-10 colores)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine utiliza Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	u otros artículos de plástico no pirogénicos
Bisturí desechable	Swann-Morton	0510	o bisturí estéril estándar de un solo uso
BD Cell Strainer 40 µ m	Becton Dickinson	734-0002	u otros artículos de plástico no pirogénicos
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	u otros artículos de plástico no pirogénicos
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	u otros artículos de plástico no pirogénicos
BD FACS Tubo 5 ml	Becton Dickinson	352008	u otros artículos de plástico no pirogénicos
Pasteur estéril Pipeta 5 ml	VWR	612-1685	u otros artículos de plástico no pirogénicos
Tubo de microfuga 1,5 ml	Eppendorf	7805-00	u otros artículos de plástico no pirogénicos
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	medio sin suero recomendado
Solución salina tamponada con fosfato	Lonza	BE17-516F	PBS fisiológico estándar
Azul de tripán	VWR	17942E	u otra mancha vital
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	para experimentos de citometría de flujo
Viabilidad fijable Tinte eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	para experimentos de citometría de flujo
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	para experimentos de citometría de flujo