Este protocolo describe la disociación rápida no enzimática de fragmentos de tejido humano fresco para la evaluación cualitativa y cuantitativa de células CD45+ (linfocitos/leucocitos) presentes en varios tejidos humanos normales y malignos. Además, el sobrenadante obtenido del homogeneizado de tejido primario puede recogerse y almacenarse para su posterior análisis o experimentación.
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Artículo de método
Un protocolo simple y rápida para no enzimáticamente disociarse Tejidos Humanos frescas para el Análisis de los linfocitos infiltrantes
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En este artículo
Resumen
Resumen
La capacidad de las células malignas para evadir el sistema inmune, caracterizado por el escape del tumor de ambos respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, se acepta ahora como un sello importante de cáncer. Nuestra investigación sobre el cáncer de mama se centra en el papel activo que desempeñan linfocitos infiltrantes de tumores en la progresión tumoral y la evolución del paciente. Hacia este objetivo, hemos desarrollado una metodología para el aislamiento rápido de células linfoides intactos de tejidos normales y anormales en un esfuerzo para evaluar los próximo a su estado nativo. Los homogeneizados preparados usando un espectáculo disociador mecánica tanto una mayor recuperación de la viabilidad celular y preservando al mismo tiempo la expresión receptor de superficie en comparación tejidos digeridos con enzima para. Por otra parte, la digestión enzimática del material insoluble restante no se recuperó células CD45 + adicionales que indican que las mediciones cuantitativas y cualitativas en el homogeneizado primaria probablemente reflejen realmente la infiltración de las subpoblaciones en la Fragm tejidoent. Las células linfoides en estos homogeneizados pueden ser fácilmente caracterizado usando inmunológica (fenotipo, la proliferación, etc.) o molecular (ADN, ARN y / o proteína) enfoques. Células CD45 + también pueden ser utilizados para la purificación subpoblación, la expansión in vitro o crioconservación. Un beneficio adicional de este enfoque es que el sobrenadante tejido primario a partir de los homogeneizados se puede utilizar para caracterizar y comparar citocinas, quimiocinas, inmunoglobulinas y antígenos presentes en tejidos normales y malignos. Este funciones de protocolo extremadamente bien para los tejidos de mama humanos y deberían ser aplicables a una amplia variedad de tejidos normales y anormales.
Introducción
El microambiente tumoral está compuesto por varios tipos de células, con numerosos estudios que demuestran que cada uno de ellos desempeña funciones distintas e importantes en la tumorigénesis1,2. Estos incluyen, pero no se limitan a, células inmunitarias infiltrantes, células estromales, células endoteliales y células tumorales3. Estudios ex vivo de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL; Las células CD45+ o leucocitos, que son predominantemente linfocitos en los tumores de mama) de muestras frescas de tejido humano se ven dificultadas por su baja frecuencia, los pequeños tamaños de muestra a menudo disponibles para la invest....
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Protocolo
NOTA: Todos los especímenes fueron adquiridos utilizando un protocolo aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto Jules Bordet con el consentimiento informado por escrito obtenido de cada paciente.
1. Preparación del homogeneizado de tejido
- Diseccionar tejidos resecados (tejido maligno y normal resecado de la sala de operaciones) están en el laboratorio de patología por personal capacitado para su recogida inmediata. Tumor, NANT (tomada la distancia más alejada del tumor como sea posible) y fragmentos de tejido normal se procesan de forma rutinaria plazo de 1 - 3 horas de la escisión quirúrgica en un laboratorio BSL2 u....
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Resultados
La digestión enzimática de fragmentos de tejido, ya sea con soluciones disponibles en el mercado de disociación de tejido o diversas mezclas de laboratorio de colagenasa, DNasa y / o inhibidores de hialuronidasa, escinden una amplia variedad de receptores en la superficie de las células. Nuestros estudios, se centró inicialmente en las células T CD4 + que infiltran los tumores de mama, se presentaron rápidamente con un problema técnico importante debido a la escisión de los receptores de CD4 de la superficie .......
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Discusión
Este estudio describe un método optimizado para la rápida preparación de los homogeneizados de tejidos normales y malignos de mama sin digestión enzimática para la clasificación posterior de células, la extracción, la criopreservación y / o análisis fenotípico de CD45 + subpoblaciones. El objetivo de este enfoque experimental es para producir imágenes de la TIL que refleja de cerca su estado in vivo y compararlos con los tejidos normales con mínima manipulación de los tejidos frescos de la sala de op.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas fromthe Fondo Belga para la Investigación Científica (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Cáncer del Plan de Bélgica, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson y Fonds Barsy.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GentleMacs Disociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | BD Medimachine es algo equivalente |
| centrífuga 5810 | R Eppendorf | u otra centrífuga de mesa estándar | |
| Centrífuga 5417 | R Eppendorf | u otra microcentrífuga estándar | |
| Esco Clase II A2 Gabinete de bioseguridad | ESCO global | u otra campana | |
| estándar BSL2Microscopio invertido | Nikon eclipse TS100 | u otro microscopio compatible para un hemacitómetro | |
| Bü rker Cámara | Marienfield | 640210 | u otro hematitómetro estándar |
| Citómetro de flujo Navios | Beckman Coulter | u otro citómetro de flujo (se recomiendan 8-10 colores) | |
| GentleMacs C-Tube | Miltenyi Biotec | 130-096-344 | BD Medimachine utiliza Filcon |
| Cell Culture Dish | Sarstedt | 72,710 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| Bisturí desechable | Swann-Morton | 0510 | o bisturí estéril estándar de un solo uso |
| BD Cell Strainer 40 µ m | Becton Dickinson | 734-0002 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| BD Falcon Tube 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| BD Falcon Tube 15 ml | Becton Dickinson | 352097 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| BD FACS Tubo 5 ml | Becton Dickinson | 352008 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| Pasteur estéril Pipeta 5 ml | VWR | 612-1685 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| Tubo de microfuga 1,5 ml | Eppendorf | 7805-00 | u otros artículos de plástico no pirogénicos |
| X-Vivo 20 | Lonza | BE04-448Q | medio sin suero recomendado |
| Solución salina tamponada con fosfato | Lonza | BE17-516F | PBS fisiológico estándar |
| Azul de tripán | VWR | 17942E | u otra mancha vital |
| VersaLyse | Beckman Coulter | A09777 | para experimentos de citometría de flujo |
| Viabilidad fijable Tinte eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD3 FITC | BD Biosciences | 345763 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD3 Vio Blue | Miltenyi Biotec | 130-094-363 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD4 PE | BD Biosciences | 345769 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD4 APC | Miltenyi Biotec | 130-091-232 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD8 ECD | Beckman Coulter | 737659 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD8 PerCP | BD Biosciences | 345774 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD19 APC-Vio770 | Miltenyi Biotec | 130-096-643 | para experimentos de citometría de flujo |
| anti-CD45 VioGreen | Miltenyi Biotec | 130-096-906 | para experimentos de citometría de flujo |
Referencias
- Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
- Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment pr....
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Reimpresiones y permisos
