Artículo de método

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

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DOI:

10.3791/52408

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17 de febrero de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Resumen

Aquí describimos un protocolo para generar un co-cultivo formado por 2 poblaciones neuronales diferentes. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) se reprograman a partir de fibroblastos humanos utilizando vectores episomales. Las colonias de iPSCs pueden observarse 30 días después del inicio de la reprogramación de fibroblastos. Las colonias pluripotentes se seleccionan manualmente y se cultivan en un medio de inducción neural para permitir la diferenciación en células progenitoras neurales (NPC). Las iPSC se convierten rápidamente en células neuroepiteliales en 1 semana y conservan la capacidad de autorrenovarse cuando se mantienen a una alta densidad de cultivo. Las NPC primarias de ratón se diferencian en astrocitos por exposición a un medio que contiene suero durante 7 días y forman una monocapa sobre la que se añaden neuronas corticales de rata embrionarias de día 18 (E18) (transfectadas con canalrodopsina-2 (ChR2)). Las NPC humanas marcadas con la proteína fluorescente, el dímero en tándem Tomato (tdTomato), se siembran en el cultivo de astrocitos/neuronas corticales al día siguiente y se les permite diferenciarse durante 28 a 35 días. Demostramos que este sistema forma conexiones sinápticas entre las neuronas derivadas de iPSC y las neuronas corticales, evidentes a partir de un aumento en la frecuencia de las corrientes sinápticas tras la fotoestimulación de las neuronas corticales. Este sistema de cocultivo proporciona una plataforma novedosa para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de iPSC para crear conexiones sinápticas con otras poblaciones neuronales.

Introducción

En los últimos años, nuestra comprensión de la neurona y la función del circuito neuronal han sido revolucionada por varias herramientas optogenética que controlan la excitabilidad neuronal. Una de estas herramientas es el canal catiónico activado por la luz, canalrodopsina-2 (ChR2): las neuronas que expresan ChR2 potenciales de acción del fuego en respuesta a la estimulación de la luz 1.3. Debido a que las neuronas no son normalmente sensibles a la luz, esta notable capacidad abre nuevas vías para el control temporal y espacial precisa de la actividad de las poblaciones genéticamente definidas de neuronas 4 y ha estudios de la función cerebral acelerado enormemente. ChR2 se ha aplicado a la investigación de células madre para diferentes propósitos, desde el seguimiento del desarrollo neuronal 5 a la actividad de las redes neuronales 6 regulación.

Aquí hemos utilizado ChR2 para aumentar la utilidad de un sistema de co-cultivo neuronal. Sistemas de co-cultivo permiten la evaluación de las interacciones entre los diferentes tipos de células.Co-cultivos de neuronas y células gliales, los principales tipos de células del sistema nervioso, se utilizan comúnmente para investigar la señalización entre estos diferentes tipos de células, así como para evaluar la importancia de esta señalización para las respuestas fisiológicas, la propagación de los daños y para examinar la mecanismos moleculares que están potencialmente implicadas en esta señalización 7. Un estudio anterior reveló que iPS humanas se diferencian muy rápidamente en las neuronas de la presencia de la cultura que contiene neuronas de rata corticales primarias, los astrocitos, los oligodendrocitos y microglia 8.

En este protocolo, se demuestra un método que utiliza ChR2 en un sistema de co-cultivo para interrogar a las conexiones sinápticas entre las neuronas corticales de rata y las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs). Describimos pasos para diseccionar y tejidos cerebrales cosecha 9, así como a mantener y diferenciar ratón células progenitoras neurales (CPN) en astrocitos y NPCs humanos INTneuronas o para crear el sistema de co-cultivo. Para establecer este sistema de co-cultivo, se utilizó el método de reprogramación-integración libre descrito por Okita et al. 10 para generar células iPS humanas. Estos iPSCs fueron entonces diferenciarse eficientemente en NPC en condiciones definidas químicamente utilizando inhibidores de molécula pequeña tal como se describe por Li et al. 11

En los co-cultivos, las diferentes poblaciones de neuronas se pueden identificar a través de la detección de la expresión de ChR2 en neuronas corticales y etiquetado de neuronas derivadas de IPSC a través de la proteína fluorescente, en tándem de dímero de tomate (tdTomato). La combinación de registros electrofisiológicos de neuronas derivadas de IPSC con fotoestimulación optogenético de las neuronas corticales permite la evaluación de la capacidad de estos dos tipos de neuronas para formar circuitos entre sí. En concreto, la fotoestimulación de ChR2 que expresan las neuronas corticales evocan respuestas sinápticas en neuronas derivadas de IPSC que se han formado los circuitos sinápticoscon la red de neuronas corticales fotoestimulada. Se demuestra que el aumento de las corrientes postsinápticas están efectivamente detectados en neuronas derivadas de IPSC en tales condiciones. Este protocolo permite la evaluación de los circuitos sinápticos bajo una variedad de condiciones experimentales, incluyendo recapitulación de diferentes modelos de enfermedades neurológicas mediante el uso de células iPS derivadas de fibroblastos de pacientes con la enfermedad.

Protocolo

NOTA: Todos los experimentos se realizan siguiendo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en SingHealth.

1. Los cerebros de cosecha temprana postnatal Ratón

  1. Antes de la disección, preparar la solución de digestión tejido del hipocampo: 10 l papaína por solución de 1 ml de 1x de Earle salina equilibrada (EBSS) (+ 1% HEPES) con desoxirribonucleasa I (ADNasa I) (250 U / ml) y dispasa II (1 U / ml). Hacer aproximadamente 2,5 ml de la solución de digestión del tejido y filtrado usando una unidad de filtro de 0,20 micras. Mantenga la solución caliente a 37 ° C hasta su uso.
  2. Anestesiar los días postnatales 5 (P5) cachorros ratones poniéndolos en hielo durante 5 min. Eliminar de hielo y prueba para el dolor reflejo a través de los pies o pellizcar la cola. Pulverizar las crías con etanol al 70%. Decapitar a los cachorros y colocar las cabezas en una placa de Petri sobre hielo.
  3. Hacer una incisión en la piel a lo largo de la línea media, de la base del cráneo hasta la nariz, con un par de pequeñas scissors o pinzas de disección finas. Abra retirando la piel y hacer una incisión similar a través del cráneo. Hacer dos cortes horizontales adicionales en cada lado del cráneo, uno rostral (en el bregma) y un caudal (en el lambda).
  4. Peel abrir el cráneo lo largo de las líneas incisas para exponer el cerebro subyacente. Use un par de pinzas para eliminar el cráneo que cubre los bulbos olfativos, y cualquier hueso línea media entre ellos. Haga esto mientras mantiene la cabeza estable con un par de pinzas en la mano no disección.
  5. Facilidad la parte plana de una espátula entre la parte ventral del cerebro y la base del cráneo en el extremo caudal. Mantener la espátula paralelo a la base del cráneo debajo del cerebro, lo mueve hacia el extremo rostral del cráneo para cortar cualquier adherencia entre el cerebro y la base del cráneo.
    1. Saque el cerebro con la espátula y colocarlo en una placa de Petri que contiene helado 1x EBSS (+ 1% HEPES). Mantenga tejidos sumergidos en todo momento.
  6. Para todospasos micro-disección, trabajo bajo un microscopio de disección y utilizar un par de pinzas de disección finas en cada mano, uno para cortar tejido, y el otro para la celebración de tejido estable.
  7. Haga un corte justo posterior a la corteza cerebral para separarlo de la parte posterior del cerebro. Corte a lo largo de la línea media para separar la corteza cerebral en sus dos hemisferios. Retire las meninges de los hemisferios cerebrales.
  8. Coloque un hemisferio lado medial e insertar los fórceps en el ventrículo lateral debajo del hipocampo. Corte el cerebro medio.
    1. Haga cortes en los extremos superior e inferior del hipocampo, y cerca del dentado / unión corteza entorrinal para aislar el hipocampo de la corteza. Recoger el hipocampo en un plato que contiene enfriado con hielo 1x EBSS (+ 1% HEPES).

2. Hipocampo Tissue Disociación

  1. Transferir el hipocampos a un plato que contiene la solución de digestión tejido del hipocampo pre-calentado. Mince tél hipocampal tejidos a lo más fina posible y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
  2. Disociar suavemente los tejidos en células individuales de células de pipeteado y de transferencia mecánica en un tubo de centrífuga de 15 ml.
  3. Centrifugar a 200 xg durante 5 min y separar el sobrenadante.
  4. Resuspender pellet de células en 20 ml 0.5x Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene sacarosa (0,9 M) y se centrifuga a 200 xg durante 10 min.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de mantenimiento NPC (Tabla 1), colocado en la parte superior de 10 ml de 4% albúmina de suero bovino (BSA) en solución 1X EBSS y se centrifuga a 200 xg durante 5 min.
  6. Eliminar el sobrenadante y añadir medio de mantenimiento NPC ratón (Tabla 1) al sedimento celular. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 5-10 veces para asegurar sedimento celular se divide en células individuales.
  7. Transferencia de las células que contienen el medio en placas de pre-recubierto con Matrigel y añadir el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y fibroblafactor de crecimiento st 2 (FGF2) (ambos de 20 ng / ml) en heparina (5 mg / ml). Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2.

3. Mantenimiento de Adherente ratón hipocampo NPCs

  1. Preparar las placas recubiertas / frascos al menos una hora antes de los pases de ratón NPCs hipocampo. Añadir suficiente Matrigel para cubrir el área de superficie de cada placa o matraz y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr.
  2. Retire el medio de las culturas de la APN confluente ratón 90% y lavar una vez con 1x Tampón fosfato salino (PBS) y luego aspirar PBS apagado.
  3. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C.
  4. Asegúrese de que todas las células se han desprendido mirando en un microscopio de campo claro invertido a 10 aumentos. Si todavía hay células unidas, incubar recipiente de cultivo para una ulterior 1-2 minutos y verificar si las células de nuevo. Añadir el doble de la cantidad de F-12 Modificado mezcla de nutrientes medio Eagle / de Ham por Dulbecco (DMEM / F-12)como la de solución de desprendimiento de las células a los pocillos / matraces una vez que todas las células se han desprendido.
  5. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio de mantenimiento NPC ratón (Tabla 1). Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales.
  7. Placa tercio del total de células en nuevos pozos de cultivo / frascos y rellene medio de cultivo suficiente suplementadas con EGF y FGF2. Incubar recipientes de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2. Reponer medio cada segundo día y dividir celdas 1: 3 de cada 3 a 4 días. Evite el crecimiento excesivo de las culturas de la APN ratón para evitar la agregación y el desapego.

4. Diferenciación de ratón NPCs en astrocitos

  1. Preparar poli-L-lisina (PLL) / laminina recubierto 12 mm cubreobjetos al menos un día de antelación antes de iniciar la diferenciación de los NPCs de ratón en los astrocitos. Añadir coverslips en una placa de 24 pocillos y cubrir toda la superficie de los pozos con suficiente PLL (1 mg / ml en tampón de borato).
    1. Incubar la placa durante la noche a 4 ° C. Al día siguiente, eliminar PLL y lavar una vez con PBS 1x.
  2. Añadir laminina (1 mg / ml en DMEM frío de hielo / F-12), de nuevo cubriendo toda la superficie de cada pocillo, a continuación, se incuba durante al menos 4 horas a 37 ° C.
  3. Retire el medio de las culturas de la APN ratón y lavar una vez con PBS 1x luego aspirar PBS apagado.
  4. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C.
  5. Asegúrese de que todas las células se han desprendido a continuación, añadir el doble de la cantidad de DMEM / F-12 como el de la solución de desprendimiento de las células de los pozos / frascos.
  6. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  7. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml medio de diferenciación de astrocitos (Tabla 1). Suavemente suspensio celular pipetan arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro.
  8. Células de la placa en 5 x 10 4 células / cm 2 en 500 l de medio de cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. Reemplace la mitad del medio por medio fresco cada dos días. Ratón NPC diferenciar rápidamente en astrocitos dentro de 2 días y se diferencian por una semana antes de comenzar otros experimentos.

5. Brains cosecha embrionarias de rata y la disociación del tejido cortical

  1. Retire medio de diferenciación de astrocitos (Tabla 1) a partir de cultivos de astrocitos y reemplazar con medio neurona primaria (Tabla 1) al menos 4 horas antes de comenzar la cosecha de los cerebros de ratas embrionarias.
  2. Antes de la disección, preparar la solución de digestión del tejido cortical: 10 l papaína por 1 ml de 1x EBSS (+ 1% HEPES) con 12,1 mg / ml L-cisteína. Realiza aproximadamente 20,5 ml de la solución de digestión de los tejidos y filtrarla usando una unidad de 0,20 micras filtro. Mantenga la solución caliente a 37 ° C hasta su uso.
  3. La eutanasia a la presa embarazada por asfixia con dióxido de carbono usando gas comprimido. Prueba de dolor reflejo a través de los pies o pellizcar la cola.
  4. Coloque la cara ventral de los animales sobre una almohadilla absorbente y disfrutar de su zona abdominal con etanol al 70%. Pellizcar la piel con un par de pinzas y hacer una incisión lateral con un par de tijeras quirúrgicas, lo suficientemente amplia como para exponer el abdomen. Agarre el peritoneo con las pinzas y cortar abrir la cavidad abdominal.
  5. Levante el cuerno uterino con las pinzas y cortarla libre a lo largo del mesometrio. Coloque el útero diseccionado en un plato de Petri sobre hielo. Separar cada embrión cortando el tejido uterino entre ellos.
    1. Hacer una incisión en el saco embrionario. Shell suavemente el feto a través de la abertura. Decapitar al feto y colocar la cabeza en una placa de Petri sobre hielo.
  6. Para cosechar embryonlos cerebros de ratas ic, siga la descripción de los pasos 1.3 a 1.5.
    1. Para diseccionar los tejidos corticales, coloque un hemisferio cerebral lateral arriba. Cortar el hemisferio en dos lateralmente desde el centro. Desechar el medio más cerca de la base del cerebro. Recorte el tejido extirpado para eliminar el cerebro medio.
  7. Transferir los tejidos corticales a un plato que contiene la solución de digestión del tejido cortical pre-calentado. Picar los tejidos corticales a lo más fina posible y se incuba durante 30 minutos a 37 ° C.
  8. Transferir los tejidos corticales a partir de la solución de digestión del tejido a un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 10 ml de medio neurona primaria pre-calentado (Tabla 1). Disociar los tejidos corticales pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo en una pipeta serológica, hasta que se obtiene una solución homogénea sin piezas de tejido.
  9. Pasar la solución de los tejidos a través de un filtro de células de 70 micras para filtrar los restantes grumos de tejido. Alícuota de la solución de tejido en 15 mltubos de centrífuga, añadiendo aproximadamente 3 ml en cada tubo.
  10. Añadir 800 l 7,5% de BSA en PBS 1x a la parte inferior de cada tubo, formando dos capas con la solución de tejido en la parte superior y BSA en la parte inferior.
  11. Centrifugar a 200 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante, la aspiración desde la interfaz de las dos capas. Evitar alterar el sedimento celular en la parte inferior del tubo.
  12. Resuspender cada sedimento celular en 1 ml de medio neurona primaria (Tabla 1) y combinarlos en un tubo de centrífuga de 15 ml. Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro.

6. La electroporación y Chapado de Primaria neuronas corticales

NOTA: La transferencia de genes se puede lograr usando varios métodos, incluyendo electroporación, transfección de fosfato de calcio y transducción viral. En este protocolo, se describe la electroporación para entregar ChR2 construir en neuronas corticales primarias.

  1. Centrifugar 6 x 10 6 neuronas corticales de rata unaT 200 xg durante 5 min y separar el sobrenadante. Se requieren al menos 6 x 10 6 neuronas corticales para la electroporación para asegurar la formación de una red neuronal por neuronas supervivientes.
  2. Añadir 100 l de solución de electroporación a la celda de pellets y resuspender suavemente. Combinar 100 l de la suspensión celular con 6 g de PLENTI-Synapsin-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE 4 plásmido y transferir en una cubeta certificado. Evitar la producción de burbujas de aire durante la transferencia.
  3. Seleccionar y aplicar programa apropiado para la electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  4. Después de la electroporación, añadir 500 l de MEM para suspensión de células / ADN a la cubeta. Transferir la muestra en 11,5 ml de medio neurona primaria (Tabla 1) y resuspender suavemente. El importe total de los medios de comunicación es suficiente para una placa entera de 24 pocillos. Alícuota de 500 l de medio de cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 ° C y 5% de CO 2.

7. Generación de células madre pluripotentes inducidas

NOTA:. Este método ha sido adaptado de Okita et al 10

  1. Cultura fibroblastos humanos en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) en placas de 6 pocillos.
  2. Antes de iniciar una reprogramación de fibroblastos, capa 6 pocillos con Matrigel y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. Al 80% de confluencia, quitar el medio de cultivos de fibroblastos y lavar una vez con PBS 1x.
  3. Añadir suficiente 0,25% de tripsina-EDTA para cubrir toda la placa y se incuba a 37 ° C durante 10 min.
  4. Una vez que las células han desalojado de pozos, añadir el doble de la cantidad de DMEM con 10% de SFB como la de la tripsina para calmar la digestión con tripsina. Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper las células. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro.
  5. Transferencia de 7 x 10 5 células en un tubo de centrífuga de 15 ml y la suspensión de células a 200 xg durante 5 centrífugamin.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender sedimento de células en solución de electroporación. Electroporar los fibroblastos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resuspender las células en 100 l de tampón de electroporación y añadir 1 g de cada vector episomal. Células electroporar con ajustes de 1.650 V, 10 ms y 3 pulsos de tiempo.
  7. Transferencia de suspensión de células en DMEM suplementado con 10% FBS y la placa 5 x 10 4 células por pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2.
  8. Después de 48 horas, quitar el medio de cultivos de fibroblastos transfectadas y reemplazar con medio mTeSR. Reemplace los medios de cultivo diariamente hasta celulares madre pluripotentes inducidas (IPSC) colonias están listos para ser aislado. colonias IPSC pueden observarse después de 28 a 35 días.
  9. Cuando esté listo para el aislamiento, cortar mecánicamente una colonia de IPSC y sembrar de nuevo en un medio mTeSR con 10 asociada a Rho mu M proteína quinasa (ROCK) inhibidor (Y-27632) en una placa de 6 pocillos recubiertos con Matrigel 12. Reemplazar medio de cultivo diariamente.

8. Neural la inducción y mantenimiento de NPCs Humanos

NOTA:. Este método ha sido descrito por Li et al 11

  1. Cuando los cultivos IPSC son alrededor de un 20% de confluencia, retire medio mTeSR y reemplazar por medio de inducción neural (Tabla 1). Reponer medio cada dos días.
  2. Después de 7 días, retire el medio de inducción neural y reemplazar con medio humano mantenimiento NPC (Tabla 1). Reponer medio cada dos días hasta 7 días antes de pases culturas.
  3. Antes de pases culturas, placas cubren / frascos con Matrigel a temperatura ambiente durante al menos una hora.
  4. Retire el medio de la APN culturas humanas confluentes y lavar una vez con PBS 1x luego aspirar PBS apagado.
  5. Agregue suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos pocillos y se incuban durante 5 minutos a 37 ° C.
  6. Asegúrese de que todas las células se han desprendido. Añadir el doble de la cantidad de DMEM /F-12 como el de la solución de desprendimiento de las células a los pocillos / frascos.
  7. Transferencia de DMEM / F-12 células que contienen en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  8. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio de mantenimiento NPC humana (Tabla 1). Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper las células.
  9. Placa tercio del total de células en Matrigel recubiertos cultura pozos / frascos y rellene medio suficiente suplementado con 10 mM Y-27632. Incubar recipientes de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2.
    1. Culturas divididas 1: 3 cada 3 o 4 días y reponer medio cada dos días. Mantener culturas NPC humanos en alta densidad para evitar la diferenciación.

9. Diferenciación de NPCs Humanos en neuronas en co-culturas

  1. Añadir el vector lentiviral Synapsin1-tdTomato a la cultura de la APN humana antes de iniciar la diferenciación en neuronas. Preparar astrocito / neurona cortical co-cultivosun día de antelación antes de diferenciarse NPCs humanos.
  2. Lávese las culturas NPC humanos una vez con PBS 1x y añadir suficiente solución desprendimiento de las células para cubrir todos los pozos / frascos luego incubar durante 5 minutos a 37 ° C.
  3. Asegúrese de que todas las células se han desprendido. Añadir el doble de la cantidad de DMEM / F-12 como el de solución desprendimiento de las células a los pocillos / frascos. Transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  4. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 5 ml de medio de diferenciación neuronal (Tabla 1). Suavemente pipeta suspensión de células arriba y hacia abajo para romper sedimento celular en células individuales. Contar el número de células individuales con un hemocitómetro.
  5. Aspirar cuidadosamente medio de cultivos de neuronas corticales de astrocitos /. Placa NPCs humanos a 5 x 10 3 células / cm 2 en 500 l de medio de diferenciación neuronal (Tabla 1) suplementado con 10 mM Y-27632 para cada 24 pocillos. Añadir con cuidado medio que contiene NPCs humanos en cada pocillopara evitar molestar a los astrocitos y neuronas corticales.
  6. Incubar las placas a 37 ° C y 5% de CO 2. Reemplazar la mitad del medio con medio fresco cada dos a tres días durante al menos 28 días.

10. Registros electrofisiológicos de las neuronas derivadas de IPSC

  1. Confirme si iPSCs humanos se comportan como neuronas maduras.
    1. Encuentra células diferenciadas a partir de células iPS humanas de visualización de tdTomato utilizando un microscopio confocal vertical equipado con un 60X (0,9 NA) lente de inmersión en agua.
    2. Tire grabación pipeta para una resistencia de 4 a 6 células de M. perfundir a temperatura ambiente en una solución externa (Tabla 1) burbujeó constantemente con 95% de O2 / 5% de CO 2. Llene la micropipeta de grabación con solución interna (Tabla 1).
    3. Celular Patch tdTomato + en el modo de célula completa y la acción récord potencial de disparo en respuesta a la inyección de corriente (1 segundos de duración, incrementos de 10 Pa) en curalquilar abrazadera.
  2. Confirme si el potencial de acción de las células corticales que expresan ChR2 se evoca de forma fiable por estimulación de la luz.
    1. Encuentra células corticales que expresan ChR2 por la visualización de las buenas prácticas agrarias con un microscopio confocal. Realice la grabación de patch clamp de células enteras en las células corticales siguiendo los pasos 10.1.2 a 10.1.3.
    2. Comprobar potencial de acción se evoca de forma fiable por una iluminación de luz con lámpara de arco de mercurio (100 W). La longitud de onda de filtro de excitación es 480/40 nm.
  3. Realice la estimulación optogenética.
    1. TdTomato Patch + celular en modo de célula completa y fijación de voltaje fijado en -70 mV. Filtra señales de corriente a 2 kHz y digitalizar a 10 kHz. Monitor de resistencias en serie que van desde 10 a 20 m para la consistencia durante las grabaciones.
    2. Estimular todo terreno por 100 W filtro lámpara de mercurio con 480/40 nm de excitación durante 30 segundos.
    3. Postsináptica corrientes de Registros (PSC) de células parcheado inducida por fotoestimulación de ChR2 expresan cor presinápticaneuronas ticos. Detectar y medir PSC. El umbral de la amplitud y la zona de las corrientes a las 5 y 20 pA PC, respectivamente. Inspeccionar manualmente estos eventos para descartar cualquier rastro no PSC.

Resultados

Aquí, un protocolo que describe los varios pasos implicados en la generación de un co-cultivo que consiste en astrocitos, neuronas corticales y neuronas humanas se ilustra. CMPI humanas se obtuvieron mediante la reprogramación de fibroblastos usando vectores episomales de 10 y especificados en un linaje neuronal con un cóctel de inhibidores de molécula pequeña, por lo que NPC 11 que se mantuvieron a alta densidad (Figura 1A). Se requieren varios pasos para generar el co-cultivo: diferenciación de los NPCs de ratón en los astrocitos, chapado de neuronas corticales de rata que expresan ChR2, y la siembra de NPCs humanos etiquetados con tdTomato (Figura 1B). En el día 2 de diferenciación, glial fibrilar ácida de la proteína (GFAP) + astrocitos pueden ser fácilmente observados en nuestros cultivos (Figura 1C). Ratón NPC se les permitió diferenciarse por lo menos una semana antes de chapado neuronas corticales que expresan ChR2 sobre la monocapa de astrocitos (Figura 1D). Después de 34 semanas de diferenciación NPC humana, se detectaron las neuronas tdTomato + en las culturas (Figura 1E).

Este sistema de co-cultivo permite la detección coherente de las corrientes postsinápticas de neuronas derivadas de IPSC individuales en respuesta a la estimulación de luz (Figura 2). Cuando son estimulados por la luz, los potenciales de acción se generaron en las neuronas corticales que expresan ChR2 (Figura 2B). IPSC derivado de las neuronas también son excitables (Figura 2C), que muestra el aumento de potencial de acción disparando como la amplitud de la despolarización de pulsos de corriente se incrementó (Figura 2D). Por lo tanto, estas células exhiben propiedades neuronales maduros. En la ausencia de luz, neuronas derivadas de IPSC recibieron entradas sinápticas espontáneas (Figura 2E). Estas corrientes hacia el interior postsinápticos se mediada principalmente por los receptores AMPA, porque las corrientes a través de los receptores GABA serían hacia fuera y los receptores NMDA no llevan una corrientet el potencial de mantenimiento de -70 mV. Al menos algunas de estas entradas eran de neuronas corticales presinápticos que expresan ChR2, debido a la estimulación de luz se incrementó en gran medida la frecuencia de las corrientes postsinápticas (Figura 2E). El curso temporal de este aumento de la entrada sináptica se muestra en la Figura 2F: fotoestimulación de las neuronas corticales se mantuvo a lo largo del 30 seg destello de luz larga. Si bien la frecuencia de PSC fue elevado cuando ChR2 que expresan las neuronas corticales fueron fotoestimuladas (Figura 2G), su amplitud no fue afectado (Figura 2H). En resumen, estos resultados indican que las neuronas derivadas de IPSC exhiben propiedades neuronales maduros y podrían formar conexiones sinápticas con las neuronas corticales presinápticas.

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Figura 1: Diagramas esquemáticos para la generación de co-cultivosistema. (A) Línea de tiempo para reprogramar fibroblastos humanos en células iPS y la inducción neural a los NPCs. (B) Plazo para la diferenciación terminal de NPCs humanos en neuronas maduras en cultivos de neuronas y astrocitos corticales. (C) Ratón NPCs diferenciar rápidamente en GFAP + astrocitos después de 2 días in vitro. (D) Después de una semana, las neuronas corticales que expresan ChR2 se sembraron en GFAP + astrocitos. (E) A las 4 a 5 semanas después de la diferenciación de los NPCs humanos, registros electrofisiológicos se realizaron en tdTomato + neuronas. Las barras de escala representan 100 micras.

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Figura 2: Análisis optogenética de conectividad sináptica funcional. derivados de IPSC (A) células etiquetadas con tdTomato (rojo) fueron co-cultivadas con neuronas corticales que expresa la luz-activadocanal, ChR2 (verde). Las grabaciones de neuronas derivadas de IPSC revelaron actuales (PSC) respuestas postsinápticas, que podrían provenir de cualquiera de las neuronas corticales u otras neuronas derivadas de IPSC. (B) Iluminación (barra azul) evoca una serie de potenciales de acción en las neuronas corticales que expresan ChR2. ( derivados de las células IPSC C) son evocados por inyección de corriente. (D) La cocción frente a la curva actual de las células derivadas de IPSC. (E) Fotoestimulación de las neuronas corticales ChR2 expresan (barra azul) aumentaron la frecuencia de las ventanillas únicas en las neuronas derivadas de IPSC . Por supuesto (F) Tiempo del aumento en la frecuencia PSC producido por fotoestimulación. Barra azul indica el tiempo de fotoestimulación. (G, H) mientras que la frecuencia PSC se incrementó por la fotoestimulación (G), la amplitud PSC no se vio afectada (H). * Indica p <0,05 en comparación con el control con la prueba t de Student.

Discusión

La optogenética proporciona precisión temporal y espacial para la activación de las poblaciones definidas de neuronas 13. En nuestros experimentos, todo el campo de el objetivo del microscopio se iluminó durante 30 segundos a sólo neuronas corticales foto-estimular expresan ChR2. Esto nos permitió determinar si las conexiones sinápticas se formaron entre diferentes poblaciones de neuronas dentro del co-cultivo. Nuestros resultados revelaron que la fotoestimulación aumenta la frecuencia PSC en neuronas derivadas de IPSC, lo que demuestra que estas neuronas reciben entrada sináptica de las neuronas corticales presináptica expresan ChR2. Esto, a su vez, estableció que las neuronas derivadas de IPSC incorporado con éxito en circuitos con las neuronas corticales.

Hay varios pasos críticos para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que los cultivos de astrocitos derivados de NPC ratón son saludables, con la muerte celular mínima, antes de proceder con el chapadode otros tipos de células. Las neuronas corticales y NPCs humanos atribuyen bien en astrocitos sanos y registros electrofisiológicos dependen en gran medida de las condiciones de cultivo. Los otros pasos clave en este protocolo son la electroporación y chapado de neuronas corticales en cultivos de astrocitos. Como un gran número de células mueren después de la electroporación, es importante asegurarse de que al menos 6 millones de neuronas corticales se electroporación para placas en cultivos de astrocitos en placas de 24 pocillos. Hemos observado que cuando se sometieron a electroporación menos de 6 millones de células, el número de neuronas que sobreviven no forman una red neuronal densa, que afectó registros electrofisiológicos. El número de neuronas corticales electroporación también debe ser coherente para cada experimento de co-cultivo para permitir la comparación entre los diferentes estudios. Para todas las etapas que implican la digestión enzimática, es esencial no dejar las células en solución digestivo durante demasiado tiempo ya que puede conducir a la muerte celular.

Esteenfoque puede ser utilizado para detectar la capacidad de las neuronas derivadas de fibroblastos de pacientes específicos para formar contactos sinápticos con otras neuronas. Las neuronas derivadas de fibroblastos de pacientes que padecen el trastorno del desarrollo neurológico Síndrome de Rett (RTT) exhiben defectos de la transmisión sináptica: RTT neuronas muestran una disminución significativa en la frecuencia de PSC y la amplitud en comparación con las neuronas sanas, presumiblemente debido a la menor conectividad sináptica 14. Nuestro sistema de co-cultivo permite el examen de los efectos del fármaco sobre las neuronas que muestran defectos de desarrollo. Esto puede llevarse a cabo mediante la adición de compuestos de interés durante la siembra de NPC humanos enfermos, así como durante la exposición continua a los compuestos a lo largo del tiempo de la diferenciación neuronal.

Si bien este sistema de co-cultivo también se puede utilizar como un modelo para las pruebas de drogas, una limitación de este enfoque es que el proceso de investigación de los efectos de cada compuesto candidato puede ser largo y tedioso comono es un método de cribado de alto rendimiento. Tras el tratamiento con los compuestos candidatos, neuronas derivadas de IPSC tienen que ser parcheado individualmente para determinar los efectos de cada compuesto sobre PSC. Por otra parte, en estos momentos no hay muchos disponibles fibroblastos y células iPS de pacientes. Por lo tanto, será de interés en el futuro próximo para tener más células del paciente y también para adaptar este protocolo para la selección de alto rendimiento. Por ejemplo, por marcación de neuronas derivadas de IPSC con un indicador de actividad, tales como sensores genéticamente codificados de iones o el potencial de membrana, sería posible aumentar la tasa de rendimiento sustancialmente por el procedimiento electrofisiológico tiempo-escalonamiento lado. Como todo el proceso de generación de este sistema de co-cultivo, desde la reprogramación de fibroblastos para la realización de registros electrofisiológicos, requiere más de 90 días, se recomienda que, o bien las células iPS o NPCs humanos ampliarse, después de la reprogramación y pasos de inducción neural, respectivamente,y criopreservados para reducir el tiempo necesario para futuros experimentos.

En nuestros experimentos, expresamos ChR2 en neuronas corticales bajo el promotor synapsin1. Debido a que este promotor es pan-neuronal, que presumiblemente estaban photostimulating ambas neuronas corticales inhibidoras y excitadoras. Si el objetivo de los experimentos futuros es interrogar específicamente circuitos inhibitorios o excitatorios o bien, se podrían utilizar los promotores más específicos. Alternativamente, las neuronas corticales podrían obtenerse a partir de transgénicos (o virus inyectado ratones) donde la expresión ChR2 se dirige específicamente a las subpoblaciones genéticamente definidas de neuronas. Por ejemplo, los tejidos corticales de cosecha de un ratón que tiene la recombinasa Cre expresan en interneuronas que contiene parvalbúmina (interneuronas PV) que se cruza con un ratón con floxed ChR2 dará lugar a una situación en la que las únicas neuronas corticales que expresan ChR2 serán interneuronas PV 15. El uso de tales ChR2 interneuronas que expresan en nuestros co-culture sistema permitirá a la determinación de si una neurona parcheado derivados de IPSC es capaz de incorporar en un circuito con interneuronas PV.

Basado en un estudio previo 9, las neuronas corticales son maduros con dendritas superposición después de 14 días in vitro. Por lo tanto, si la fotoestimulación no provoca una respuesta de un patched neurona derivada de IPSC, se debe indicar que la neurona no tiene la capacidad de hacer conexiones sinápticas con las neuronas corticales. Una neurona derivada de IPSC es capaz de recibir la entrada sináptica, tanto de otras neuronas derivadas de IPSC o neuronas corticales. Si se utilizaron grabaciones de patch clamp tradicional, no sería posible distinguir donde la entrada sináptica está viniendo. La ventaja de nuestro sistema es que las respuestas postsinápticas de entrada presináptica cortical pueden ser evocados y se identificaron selectivamente. Los procedimientos descritos aquí proporcionan un método sencillo para evaluar la capacidad de las neuronas derivadas de IPSC para integraren una red neuronal definido.

Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Damos las gracias a K. Deisseroth y S. Je para las construcciones lentiviral ChR2 y Synapsin1-tdTomato respectivamente, C. Chai para el intercambio de conocimientos y el protocolo en la generación de IPSC, WY Leong para el apoyo técnico, los miembros del laboratorio Goh para compartir reactivos y conocimientos. Este trabajo fue apoyado por Abbott Nutrición y el Centro Académico de Excelencia (ACE) premio de investigación de GlaxoSmithKline (GSK) para ELG, por la Fundación Nacional de Investigación de Singapur bajo su Programa de Investigación Competitiva (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) a ELG y GJA, y por el (WCI) Programa del Instituto de clase mundial de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea (MEST) (NRF número de concesión: WCI 2009-003) a GJA

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de proliferación Neurocult (ratón)STEMCELL Technologies5702Contiene medio basal NSC y suplemento de proliferación NSC
Epi5 Kit de reprogramación episomal iPSCInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Medio neurobasalInvitrogen
MEM sin glutaminaInvitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B27Invitrogen17504044
L-glutaminaInvitrogen25030081
GlutaMAX suplementoInvitrogen 35050061
PenStrepInvitrogen 15140122
BSASigmaA7906
Human LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542SigmaS4317
Compuesto E MerckMillipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R& D Systems233FB025
Grado de investigación FBSThermo ScientificSV30160.03Para medio de diferenciación de astrocitos
Definido FBSThermo ScientificSH30070.03Para medio neurona primario
PBSThermo ScientificSH30028.02
GlucosaSigmaG8270Para medio neuronal primario
SacarosaSigmaS0389
HeparinaEMD Millipore375095
PapainWorthington3126
HBSSInvitrogen14175095
DNasa IRoche10104159001
Dispasa IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080para cerebros de recolección
EBSSInvitrogen14155063
L-CisteínaSigmaC7352
Tripsina-EDTAInvitrogen25200056
70 µ m filtro de célulasBD Biosciences   352350
20 y micro; unidad de filtro mSartorius Stedim16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-GlucosaSigmaG7520Para estudios electrofisiológicos
K-gluconatoSigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375Para estudios electrofisiológicos
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
Capilares de vidrio de borosilicatoWorld precision instruments, Inc 1604323
tubo de centrífuga de 15 mlBD Biosciences 
tubo de centrífuga de 50 mlBD Biosciences352070
Placas de 24 pocillosCorning9761146
Placas de 6 pocillosFrascos Corning720083
T25Corning430641
12 mm cubreobjetosMarienfeld-Superior111520
AMAXA Kit de nucleoefectos de neuronas de rata& nbsp;LonzaVPG1003Para la electroporación de neuronas corticales primarias Sistema de
transfección de neón InvitrogenMPK5000Para la electroporación de fibroblastos humanos
Mini Análisis SynaptosoftMini Analysis v.6Para la medición de PSCs
Fibroblastos Humanos Dérmicos NormalesPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Lámpara de arco corto de mercurioOSRAMHBO 103 W/2
21103049352096

Referencias

  1. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  4. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Stroh, A., et al. Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation. Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).
  6. Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -C. Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).
  7. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).
  8. Braun, H., Günther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).
  9. Shivaraj, M. C., et al. Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain. PLoS ONE. 7, e42935(2012).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  12. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).
  13. Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  14. Marchetto, M. C. N., et al. A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  15. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, 160(2013).

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