La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Resumen

Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

Resumen

Las células madre neurales (NSC) son capaces de auto-renovación y diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos bajo microambientes locales específicas. Aquí, presentamos un conjunto de métodos utilizados para la diferenciación de tres dimensiones (3D) y el análisis de miRNA de una línea clonal de células madre neurales humanas (HNSC), actualmente en ensayos clínicos para la discapacidad accidente cerebrovascular (NCT01151124 y NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs se derivan de un primer trimestre corteza fetal humano aprobado ético y condicionalmente inmortalizadas usando la integración retroviral de una sola copia de la c-MycER ^TAM construir. Describimos cómo medir proceso axón resultado de hNSCs diferenciados en andamios en 3D y la forma de cuantificar los cambios asociados en la expresión de los genes miARN utilizando variedad de PCR. Además, damos ejemplos de análisis computacional con el objetivo de seleccionar miARN putativo objetivos. SOX5 y NR4A3 fueron identificados como adecuados miARN putativo objetivo del seleccionado significativamente las regulanmiRNAs d en HNSC diferenciada. Validación miARN se realizó en SOX5 y NR4A3 3'UTRs por doble transfección del plásmido reportero y ensayo de luciferasa dual.

Introducción

Investigación de células madre juega un papel central en la medicina regenerativa, que también se extiende por las disciplinas de ingeniería de tejidos, biología celular de desarrollo, la terapia celular, la terapia génica, y los biomateriales (andamios y matrices). Las células madre son importantes en tanto órgano reparación de tejidos developmentand; la comprensión de cómo funcionan las células madre es fundamental para el desarrollo de tratamientos basados ​​en células madre nueva ^1. CTX0E03 es un condicionalmente inmortalizada de células madre neurales humanas (HNSC) línea clonal, ² aislados del primer trimestre corteza fetal humano. CTX0E03 ha definido las características de calidad que son esenciales para la banca celular clínica bajo buenas prácticas de fabricación (GMP) ^3. HNSCs pueden diferenciarse espontáneamente en neuronas, células gliales, y oligodendrocitos y se han demostrado para mejorar los déficits neurológicos cuando se trasplantan en un modelo de roedor de ^2,4,5 isquemia focal. El CTX0E03 hNSCs están actualmente en ensayos clínicos para el accidente cerebrovascular Invalidezdad (NCT01151124 ⁶ y NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNAs tienen un promedio de 22 nucleótidos de longitud y son probados moléculas reguladoras ^7, que no codifican proteínas, sino más bien unirse región no traducida 3 prime (3'UTR) de mRNAs, la regulación de su estabilidad y la traducción en proteínas. MiRNAs se reportan para participar en la regulación de una serie de procesos celulares, incluyendo el desarrollo, la proliferación y la diferenciación ^8. Varios miRNAs se han implicado en la regulación de la suerte y la especificación de las células madre neurales ^9.

En dos dimensiones (2D) ambiente de cultivo estándar de la complejidad del entorno in vivo no se corresponde, en consecuencia, la inducción y regulación de la diferenciación HNSC no es óptima. In vivo, las células están rodeadas por un microambiente tres dimensiones (3D) compuesta por otra células y ligandos extracelulares, incluyendo muchostipos de colágenos, laminina, y otras proteínas de la matriz (matriz extracelular, ECM). Estudios previos han informado de que la topografía arquitectónica de los materiales que imitan ECM y su fenotipo celular influencia geometría y el destino ^10-15. Un número de andamios 3D disponibles comercialmente están disponibles; se utilizó un andamio de poliestireno altamente poroso diseñado con una arquitectura bien definida y uniforme en una membrana de espesor de 200 micras que proporciona un espacio 3D en el cual las células pueden invadir y diferenciar ^16-18.

Ensayos de diferenciación en el presente documento en 2D y 3D se utilizan para evaluar consecuencia axonprocess. Además, se describe un método para el perfil de expresión de miRNA de una línea HNSC grado clínico para investigar más a fondo los efectos de miRNA en su diferenciación. Los métodos en aquí ilustradas se basan en las descritas originalmente en ^19.

Protocolo

1. Diferenciación HNSC en Tridimensional Cultura (3D)

NOTA: Aislar y derivar hNSCs, a partir de un tejido ético aprobado, descrito en una publicación anterior ^2. Por favor, siga los lineamientos éticos e institucionales, mientras que después de este procedimiento.

1.1) Cultura 3D Usando 12 pocillos Placa

1. Utilice una técnica aséptica durante el procedimiento. En una cabina de seguridad biológica, andamios rehidratar añadiendo 2 ml / pocillo de etanol al 70% preparadas utilizando agua para riego (WFIr). Evite tocar los andamios dispensando el etanol al 70% por la pared de cada pozo.
2. Aspirar con cuidado el 70% de etanol y lavar inmediatamente los andamios con 2 ml / pocillo DMEM: F12 durante 1 min. Repita el procedimiento de lavado dos veces. Aspirar con cuidado la DMEM: F12 después del último lavado.
3. Andamios Coat por la adición de 2 ml / pocillo de laminina (10 mg / ml) en DMEM: F12. Incubar la placa a 37 ° C en un CO ₂ hum 5%idified incubadora durante un mínimo de 2 horas. Lave la placa con DMEM caliente: F12.
4. Semillas cada andamio con aproximadamente 500.000 hNSCs en un volumen de 150 l de RMM + FG.
5. Incubar la placa durante 3 horas a 37 ° C en un incubador de _CO2 humidificado 5% para permitir que las células se asienten en los andamios.
6. Añadir 3,5 ml de RMM a cada pocillo con cuidado de no desalojar a las células de los andamios.
7. Incubar la placa durante 7 días; reemplazar medio RMM (3,5 ml / pocillo) después de 1 día (primera alimentación) y de nuevo después de 2-3 días a partir de la primera alimentación.
8. Después de 7 días, retire medio y fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) para inmunocitoquímica (CPI) o añadir 500 l / pocillo de reactivo de lisis para la extracción de ARN total (placa de tienda a ≤ -80 ° C o proceder a la extracción de ARN total) .

1.2) Medición de axón resultado de procesos

1. Mancha PFA al 4% fijado hNSCs diferenciadas de acuerdo con un protocolo estándar ICC ²⁰ utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticuerpo primario se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo. Núcleos celulares Contratinción con Hoechst (1 M).
2. Captura de imágenes representativas de las células teñidas-β3 tubulina utilizando un microscopio de fluorescencia; guardar imágenes como tiff o jpeg. Medida del crecimiento de proceso axón mediante una herramienta de medición del software (por ejemplo, Image-Pro Plus).
3. Abra la imagen, seleccione la opción de mediciones en la barra de herramientas y seleccione característica rastro.
4. Para iniciar el rastreo, seleccione el punto de inicio en el axón haciendo clic en el botón del ratón. Seguir la pista a lo largo de toda la longitud de la axón; haga clic derecho para terminar cada traza. Repita para medir todo outgrowthswith axón en el campo de visión.
5. Exprese mediciones como píxeles o micras (pendiente de calibración establecido). Mediciones de la longitud de exportación a un programa de hoja de cálculo para el análisis comparativo y estadístico de la muestra.

2. Mirna expresión usando una Células Madre yLas vías de desarrollo enfocada matriz miARN PCR

2.1) extracción de RNA total miARN

1. Realizar la extracción miRNA en andamios y muestras crecidas 2D (diferenciado e indiferenciado, control HNSC).
2. Descongele los andamios, insertados en una placa de 12 pocillos, si es necesario. Combinar el contenido de reactivo de lisis (500 l) de 2 pocillos en el mismo 1,5 ml tubo Eppendorf, volumen final 1 ml de reactivo de lisis. Tenga cuidado de dejar el andamio en el pozo.
3. Para muestras recogidas previamente como secas celulares se sedimentaron 2D crecido (cultivos HNSC 2D diferenciados y de control indiferenciada) añadir 1 ml de reactivo de lisis y transferir contenido en 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
4. Homogeneizar cada muestra de prueba utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja corta de calibre 20 a 25. Pasar el lisado a través de la aguja utilizando una jeringa de 1 ml hasta 5 veces hasta que se logre un lisado homogénea.
5. Añadir 200 l de cloroformo a cada tubo Eppendorf y tape firmemente. Invertir y tubos de vórtice amezclar el contenido.
6. Centrifugar cada 1,5 ml tubo de microcentrífuga que contiene homogeneizado durante 15 min a ≥12,000 x g.
7. Pasar la fase acuosa superior de cada muestra (evitar la transferencia de cualquier interfase, líquido rosa color) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo que contenía 750 l de etanol al 100%. Mezclar bien por inversión.
8. Pipetear hasta 700 l de cada muestra de prueba, incluyendo cualquier precipitado, en una mini columna en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a ≥8,000 xg durante aproximadamente 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el flujo directo. Repita este paso con el resto de la muestra.
9. Realizar una digerir el ADN durante 15 min.
10. Añadir 700 l RWT tampón a la mini columna y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo.
11. Lave la mini columna añadiendo 500 l de tampón RPE y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo. Repita wash.Centrifuge en ≥12,000 xg durante 1 min para secar la membrana más.
12. Eluir el ARN total en un tubo Eppendorf de 1,5 ml mediante la adición de 40 l de agua libre de RNasa a la mini columna y centrifugación durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir la concentración de ARN total con la ayuda de un espectrofotómetro apropiado.

2.2) miARN Preparación de ADNc

1. Preparar la mezcla maestra de transcripción inversa. Cada muestra requiere 4 l de tampón 5x miScript Hispec, 2 l de 10x energía atómica mezcla, 2 l miScript revertir mezcla transcriptasa.
2. Alícuota 8 l de mezcla maestra en un tubo de PCR, añadir volumen requerido de ARN total (250 ng), y agregue el agua libre de RNasa a un volumen final de 20 l.
3. Incubar durante 60 min a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript de la transcriptasa inversa Mix.
4. Añadir 200 RNasa libre de agua l de cada reacción de 20 l de transcripción inversa, almacenar a -20 ° C, o proceder con verdadero-time PCR inmediatamente.

2.3) Células Madre y las vías de desarrollo Enfocado matriz miARN PCR

1. Preparar los componentes de la mezcla PCR en un tubo de 15 ml mediante la adición de 1.375 l de 2x mezcla maestra SYBR verde, 100 l preparación de ADNc de los genes miARN, 275 l de 10x miScript universal Primer, y 1.000 l de agua libre de RNasa (volumen total de 2.750 l).
2. Transferencia PCR componentes de la mezcla en un depósito de carga PCR. Retire con cuidado el 96 pocillos gama placa de PCR de su envase.
3. Añadir 25 l componentes de la PCR de la mezcla a cada pocillo de la matriz de PCR usando una pipeta de 8 canales, o una pipeta de 12 canales utilizando sólo 8 consejos. Cambie puntas de pipeta después de cada paso de pipeteado para evitar la contaminación cruzada entre los pozos.
4. Sellar la placa con película de adhesivo óptico, y centrifugar durante 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) para eliminar las burbujas. Inspeccione visualmente la placa de debajo para asegurar que no hay burbujas en los pocillos.
5. Coloque la placa de 96 pocillos matriz de PCR en el termociclador en tiempo real.
6. Programe el tiempo real termociclador en consecuencia: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y 45 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C establece una sola (la recolección de datos de fluorescencia).
7. Exportar los valores de Ct para todos los pozos a una hoja de cálculo de Excel en blanco para su uso con matriz PCR análisis de datos Plantilla Excel y el software basado en la web.
   NOTA: El software está disponible en www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. Análisis Computacional para miARN predicción y validación de objetivos de la meta ARNm por el reportero plásmido transfección y Ddual ensayo de luciferasa.

3.1) Análisis Computacional para la Predicción del miRNA Target

1. Navegar PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) ^21, algoritmo disponible en línea para la identificación de miRNA objetivo mRNAs de predicción.
2. Haga clic en "haga clic aquí para la predicción PicTar en los vertebrados". Una nueva página se abrirá.
3. En la nueva página, la interfaz web PicTar, elegir especies en el menú desplegable e introduzca miARN de interés en el cuadro de miRNA ID. Haga clic en la búsqueda de objetivos de un miRNA.
4. Observar una lista de mRNAs objetivo clasificados según su puntuación aPicTar.
   NOTA: PicTar calcula una puntuación que refleja la probabilidad de que un determinado UTR estará dirigido por el miRNA seleccionado, y se basa en la complementariedad de la semilla, la termodinámica y una predicción combinatoria de objetivos comunes en juegos de co-expresó miRNAs ^22.
5. Del mismo modo recuperar la lista de los ARNm diana utilizando DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) ^23, y TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) ^24, alternativa en línea disponible algoritmos.
6. Compilar un cuadro comparativo de mIRNAS basado en el ranking obtenido utilizando diferentes herramientas de software. PicTar clasifica por puntuación, DianaLab por la precisión (basado en la relación señal a ruido y una puntuación de precisión para la evaluación de la significación de los resultados predichos), y por TargetScan PCT total (basado en la complementariedad de la semilla, la energía libre termodinámica de la unión, sobre la conservación diferentes especies), véase la Tabla 1.

3.2) Validación de Target ARNm por el reportero plásmido transfección y Dual ensayo de luciferasa.

NOTA: 3 'UTR reporteros luciferasa para la validación de ARNm objetivo ha sido descrito previamente ^25.

1. La transfección
   1. Semilla células HeLa a una densidad de 10 ⁵ células / pocillo en placas de 24 pocillos.
   2. Después de 24 horas, co-transfectar células HeLa con 1,5 l de reactivo de transfección y, o bien 100 ng de plásmido NR4A3 3 UTR 'Utror SOX5 3', así como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, y hsa-miR-7-5p y hsa-miR-17-5p para NR4A3 3 'UTR, respectivamente) por pocillo.
   3. Pocillos de control cotransfectar con NR4A3 3 'Utror SOX5 3' UTRplasmid y fluorocromo marcado siRNAs control negativo. La transfección de los pocillos de control con fluorocromo etiquetados siRNAs control negativo permite la evaluación de la eficacia de transfección y representa el imitador especificidad se unen miARN 3'UTR.
2. Medición de doble luciferase Actividades
   1. Mida actividades luciferasa de luciérnaga y Renilla después de la transfección 24 horas. Retire medio de crecimiento celular.
   2. Preparar la solución de trabajo I mediante la adición de 50 l de sustrato I en 10 ml de Solución I; mezclar bien. Añadir 300 l de solución de trabajo que en cada uno de 24 pocillos.
   3. Transferir el contenido de cada 24 pocillos en 3 pocillos de una placa blanca 96, 100 l cada uno. Espere 10 minutos y medir luciferasa de luciérnaga en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia.
   4. Preparar solut trabajoion II mediante la adición de 50 l de sustrato II en 10 ml de solución II; mezclar bien. Añadir 100 l de solución de trabajo que en cada 96 así que ya contiene 100 l de solución de trabajo I.
   5. Espere 10 minutos y medir Renilla luciferasa en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia. Calcular la relación de la luminiscencia de la luciferasa de la luciérnaga de la luciferasa de Renilla.

Resultados

En la Figura 1 se visualiza la investigación y cuantificación de HNSC diferenciación en andamios 3D en comparación con cultivos tradicionales superficie plana (2D) y expressedas mediciones excrecencia proceso de axón. En la Figura 2 es representedthe flujo de trabajo y los resultados de la cuantificación miARN utilizando células madre y las vías de desarrollo se centraron gama miARN PCR para investigar la expresión diferencial de miRNAs en hNSCs diferenciadas en 2D y 3D en comparación con el control indiferenciada. Siguiendo miARN análisis comparativo entre hNSCs diferenciadas y no diferenciadas y análisis computacional para la predicción de destino, SOX5 y NR4A3 (NOR1) fueron identificados como los ARNm putativo objetivo. Para estudiar la interacción directa entre los miRNAs y su sitio putativo en el 3'UTR de ARNm se utilizó 2 plásmidos disponibles comercialmente que contienen ya sea SOX5 o secuencia 3'UTR NR4A3 insertados aguas abajo del gen reportero de la luciferasa de luciérnaga, una nd contiene en el mismo gen de la luciferasa Renilla plásmido para la normalización. Los resultados representativos de la actividad de luciferasa 3 'UTR baja regulación se presenta en la figura 3.

Figura 1:. La diferenciación de hNSCs en andamios 3D, y la medición del crecimiento de proceso axón es (A) Después de la tinción ICC estándar para β3-tubulina (verde) y núcleos counterstained con Hoechst (azul) microfotografías representativas fueron adquiridas y medición de los procesos de los axones fueron realizado con la ayuda de un software de análisis de imagen. (B) Diagramas de informes de la medición del crecimiento de axón proceso realizado en hNSCs diferenciados en 2D y 3D para 1 (1W) o 3 semanas (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2:. Workflow esquemática de miARN perfiles en hNSCs diferenciadas ARN total, incluyendo miRNAs, fue extraído de cualquiera hNSCs diferenciadas en andamios 3D y culturas 2D estándar, o el control indiferenciada. 250 ng de ARN total fueron transcritas-retro con un método que facilita la conversión selectiva de miRNAs maduros en ADNc adecuado para la cuantificación miRNA con la diferenciación celular y el desarrollo humanos matriz miScript miARN PCR. La geo-media de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A y RNU6-2 se utilizó para el análisis de datos basado en el método 2 ^-ΔΔct. Cambios significativos se definieron como +/- 1.5 doblar y regulación a la baja a un stagrado estadísticamente significativo. Los datos fueron analizados mediante el software basado en web disponible en los resultados se expresan como clustergram. Modificado de la Figura 3 ^19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Validación de miARN predijo mRNA utilizando un ensayo informe luciferasa dual. (A) Diagrama de Representante de un plásmido informador de luciferasa dual utilizado como una herramienta para validar secuencia 3'UTR como un objetivo directo de un miARN. (B) Micrografía Representante mostrando la eficacia de transfección. (C)   Señales, expresados ​​como actividad luciferasa relativa, de humano 3 y #39; genes reporteros UTR ofSOX5 y NR4A3 fueron eliminados de manera significativa en la presencia de hsa-miR-96 y HSA-miR-7 y 17 imita miARN respectivamente. Modificado de la Figura 5 ^19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

		DIANALAB		PicTar	TargetScan
miRNA	Gen diana	Sitios objetivo / encontraron genes	Precisión	Puntuación	Agregada P CT
hsa-miR-96	SOX5	1214/763	1	6.74	0,94
hsa-miR-183	DUSP10	302/190	0.72	4.75	0.85
hsa-miR-302a	NR4A3	863/473	0.84	3.05	NF
hsa-miR-182	FOXN3	1358/794	0.94	NF	0.96
hsa-miR-7	NR4A3	NF	NF	1.61	0.17
hsa-miR-7	FOXN3	399/136	0.17	NF	0.88
hsa-miR-20a	NR4A3	1650/841	0.85	5.87	0.63
	NR4A3	1955/973	0.9	5.87	0.63
hsa-miR-17	NR4A3	1928/961	0.9	5.38	0,63 + 0,37
hsa-miR-20a	EIF4G3	1650/841	0.97	NF	NF
hsa-miR-20b	EIF4G3	1955/973	0.94	NF	NF
hsa-miR-17	EIF4G3	1928/961	0.94	NF	NF

Tabla 1: Lista de miARN ARNm de predicción de destino. Mesa Representante de miRNAs, meta genes predictivos y análisis de algoritmos (predecirion / partitura / agregado proporcionado usando Diana Lab, PicTar y TargetScan respectivamente). Modificado de la tabla 3 ^19.

Discusión

El desarrollo de nuevos ensayos in vitro para evaluar y mejorar la diferenciación de células madre siempre ha presentado un reto para la investigación de sus funcionalidades y capacidades terapéuticas. A largo plazo y el apego estable de hNSCs, necesaria para el desarrollo de un 3D robusto en ensayo de diferenciación in vitro, fue abordada por probar varios sustratos 3D con diferentes características en cuanto a materiales y estructuras. Como parte del desarrollo del ensayo también se evaluó la concentración óptima de siembra de células e identificamos la necesidad de los andamios que se laminina recubiertos. Aunque nuestros hNSCs pueden diferenciarse espontáneamente en 4-OHT y la eliminación del factor de crecimiento, la implementación de un sistema de cultivo 3D mostró una mejoría significativa en su capacidad de diferenciación medida por axón proceso de derivación en comparación con hNSCs 2D diferenciado estándar.

Para investigar el efecto de difere inducida 3Dntiation sobre la expresión HNSC miRNA que utiliza una matriz de PCR. En comparación con chip de micromatriz estándar de PCR matriz ofrece las ventajas de una cuantificación directa y la validación de los genes miARN de interés. Aunque la matriz de PCR se limita en términos de número total de los genes miARN por matriz, por ejemplo en menos de 96 aquí, puede ser adaptado para incluir específicamente miRNAs de interés, en nuestro caso se informó anteriormente en el desarrollo de células madre. La expresión de la vía centrado miRNAs se perfila en hNSCs diferenciados 3D y 2D en comparación con hNSCs indiferenciadas. Se seleccionaron los más significativamente las reguladas miRNAs y se analizaron para evaluar sus mRNAs putativo objetivo con la intención de determinar su funcionalidad y la interpretación biológica utilizando algoritmos disponibles en línea (DIANA Lab, PicTar, y TargetScans).

Un único miARN puede reconocer cientos de objetivos y por esta razón hemos validado interacciones miARN con 3 'UTR mRNAsthat pueden ser candidatos adecuados en unregulación xonal. NR4A3, un objetivo de la HSA-miR-7, y miR-17 de la familia, es miembro de los receptores nucleares de la familia NR4A que, dependiendo de su nivel de expresión, están involucrados en la diferenciación, la supervivencia, la apoptosis y la regulación de los axones del hipocampo orientación ^26. Del mismo modo SOX5, un objetivo de hsa-miR-96, se informó a controlar la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales ²⁷ longitud axón ^28, migración, diferenciación post-migratoria, y proyecciones de las neuronas ^29. Tanto SOX5 y NR4A3 se identificaron como un ARNm diana directa de hsa-miR-96 y HSA-miR-7 y 17, respectivamente, mediante ensayos de doble reportero luciferasa. Dual luciferasa (luciérnaga y Renilla) se basa en dos genes indicadores diferentes en el mismo plásmido y ofrece un sistema mejorado permitiendo la normalización de los efectos causados ​​por la transfección subóptima y los efectos citotóxicos en comparación con un único sistema de plásmido de luciferasa. Como parte de nuestro desarrollo de ensayos también optimizamos nuestra conditi transfeccióncomplementos a fin de obtener una alta eficiencia.

El protocolsdescribed el presente documento puede ser explotado para optimizar aún más y caracterizar la diferenciación in vitro HNSC que puede beimplemented protocolos intransplantation para los estudios pre-clínicos y futuras aplicaciones clínicas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM: F12	Invitrogen	21331-020	para la preparación del medio RMM
Solución de albúmina humana	Cuidado de la salud de Baxter limitado	1501052	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de  0.03%
Transferrina, recombinante humana	Sigma	T8158	Para el medio RMM utilizado a una concentración final de  5 µ g/ml
Putrescina DiHCl	Sigma	P5780	Para medio RMM utilizado a una concentración final de   16.2 µ g/ml
de Insulina Recombinante Humana	Sigma	I9278	Para medio RMM utilizado a una concentración final de   5 µ g/ml
de progesterona	Sigma	P6149	Para medio RMM utilizado a una concentración final de  60 ng/ml
L-Glutamina	Invitrogen	25030-24	Para medio RMM utilizado a una concentración final de  2 mM
Selenito de Sodio	Sigma	S9133	Para medio RMM utilizado a una concentración final de 40 ng/ml
bFGF	Peprotech	AF-100-15	Para añadir al medio RMM, utilizado a una concentración final de 10 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-188	Para añadir al medio RMM, utilizado a una concentración final de 20 ng/ml
4-OHT	Sigma	H7904	Para añadir al medio RMM, utilizado a una concentración final de 100 nM
Laminina	AMS Biotech	3400-010-10
TrypZean/EDTA	Lonza	BE02-034E Agua
para riego	Baxter Healthcare	UKF7114
Inhibidor de tripsina definido (DTI) (almacenamiento -20° C)	Invitrogen	R007-100
Alvetex placa de 12 pocillos	Reinisterate Ltd	AVP002
Etanol	Merck	1.00986.1000
y beta; III anticuerpo de tubulina	Sigma	T8660
Hoechst	Sigma	B2261
miRNeasy mini kit	Qiagen
DNasa libre de RNasa	Qiagen	79254
Cloroformo	Sigma	C7559-5VL
miScript II RT Kit	Qiagen	218160
SYBR kit de PCR verde	Qiagen
Desarrollo de células & Diferenciación miScript miRNA PCR Array	Qiagen/ SABiosciences	MIHS-103Z
Lightcycler 480 blanco 96 placa	Roche
Lightcycler 480  lámina de sellado	Roche
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR diana clones	GeneCopeia	HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR diana clones	GeneCopeia	HmiT017632-MT01
Allstars siRNA de control negativo AF 488 (Qiagen).	Qiagen	1027284	Control de transfección de miARN
Luc-Pair miR Luciferasa Ensayo	GeneCopeia	LPFR-M010
Lightcycler 480
Luminómetro de microplaca Roche GloMax 96	Promega