Describimos un protocolo para monitorizar la movilidad radial de las células inmunitarias no adherentes in vitro utilizando un aparato de sedimentación celular. La migración celular se rastrea en monocapas de células tumorales o en proteínas de la matriz extracelular. El examen por microscopía óptica y fluorescencia permite observar la movilidad celular y la funcionalidad citotóxica.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Presentamos una adaptación de la novela del ensayo de migración celular Radial monocapa, informó por primera vez para medir la migración radial de las células tumorales adherentes en las proteínas de la matriz extracelular, para la medición de la motilidad de las células marcadas con fluorescencia, humanos no adherente o efectoras inmunes murino. Esta técnica emplea un colector de acero inoxidable y 10 pocillos deslizante de Teflon para depositar focalmente células T no adherentes en los pocillos preparadas con monocapas confluentes de células tumorales o proteínas de la matriz extracelular. Microscopía de fluorescencia de luz y / o multi-canal se utiliza para seguir el movimiento y comportamiento de las células efectoras con el tiempo. Los colorantes fluorescentes y / o vectores virales que codifican para transgenes fluorescentes se utilizan para etiquetar diferencialmente los tipos de células para la imagen. Este método es distinto del de tipo similar en ensayos in vitro que el seguimiento de la migración / invasión horizontal o vertical utilizando cámaras de diapositivas, agar o transwell placas. El ensayo permite que los datos detallados de imagen para Be recogido con diferentes tipos de células que se distinguen por marcadores fluorescentes específicos; incluso subpoblaciones específicas de células (es decir, transducidas / nontransduced) pueden ser monitoreados. Parcelas de superficie intensidad de fluorescencia se generan utilizando canales específicos de fluorescencia que se corresponden con el tipo de célula que migra. Esto permite una mejor visualización de la movilidad de las células inmunes no adherente en momentos específicos. Es posible reunir pruebas de otras funciones de células efectoras, tales como la citotoxicidad o la transferencia de vectores virales de efector a células diana, también. Por lo tanto, el método permite a los investigadores documentan microscópicamente-célula a célula interacciones de diferencialmente marcado con, no adherente con células adherentes de diferentes tipos. Dicha información puede ser especialmente relevante en la evaluación de tipos de células inmunes biológicamente manipuladas o activados, cuando se desea una prueba visual de la funcionalidad con las células diana tumorales antes de su uso para la terapia del cáncer.
Introducción
El ensayo de migración de células Radial monocapa se desarrolló originalmente para medir las propiedades infiltrantes de células tumorales adherentes 1-4 en portaobjetos recubiertos con matriz extracelular (ECM), las proteínas 5-7 o con componentes de ECM individuales, tales como fibronectina o laminina 1,2. La técnica involucrada sembrar una suspensión de células individuales de células tumorales en el centro de pozos utilizando un colector de células de sedimentación de acero inoxidable (CSM). Después de la sedimentación, las células tumorales se adherirá a la parte inferior del pozo y el cambio en el diámetro de la población celula....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. Preparación de los portaobjetos
- Insertar diapositivas colector de sedimentación celular en bolsas de esterilización y selle con cinta de autoclave. Oriente el lado recubierto de teflón de la corredera del lado del papel de la bolsa para evitar los depósitos de plástico en los pozos.
- Bolsas de autoclave durante 15 min a 121 ° C.
- Saque los portaobjetos de la bolsa de esterilización dentro de una cabina de bioseguridad y colocar en un 150 x 15 mm placa de Petri estéril estéril. Hasta cuatro diapositivas puede caber por plato. Colocar una placa de 35 x 10 mm Petri junto a las diapositivas. Añadir 2-3 ml de H2O estéril para pro....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los vectores virales que codifican para las proteínas fluorescentes se pueden utilizar además de, o en lugar de, tinte fluorescente. Transducción viral se debe realizar antes de el ensayo de motilidad. Ambos tipos de células adherentes y no adherentes pueden ser marcados de forma diferencial. El protocolo para la transducción dependerá del tipo de vector utilizado. Aquí, transduced la alloCTL en las figuras 3, 5 y 6 con RRV-EMD al menos dos días de anticipación de la prueba utilizando e.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Las células tumorales en una suspensión de células se pipetearon en los pocillos de un portaobjetos de Teflon-enmascarado. Las células se dejaron adherir y luego formaron monocapas en un humidificado 5% de CO 2, 37 ° C incubadora (Figura 1A). Monocapas establecidas o proteínas ECM derivados de la monocapa pueden ser cosechadas para estos ensayos (Figura 1B). Linfocitos T efectores marcados con colorantes fluorescentes vitales o transducidas con vectores que codifican para EMD.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Apoyado en parte por el NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI la subvención Número UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, y el Fondo de Investigación Joan S. Holmes Memorial. MJH y GCO recibieron el apoyo de la Joan S. Holmes Memorial beca posdoctoral en la UCLA. El dispositivo CSM se obtuvo de métodos científicos creativos: www.creative-sci.com. El vector lentiviral se recibió de la UCLA Vector Core, que es apoyado por DK041301 CURE / P30.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Portaobjetos de microscopio enmascarados de teflón | Métodos Científicos Creativos | CSM002 | |
| Colector de sedimentación celular | Métodos Científicos Creativos | CSM001 | |
| Placa de Petri, Corning de 150 mm | Placa | 430597 | |
| Corning | 35 mm | 430588 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μ l Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μ l Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μ l puntas de pipeta | VWR | 89003-060 | |
| Agua destilada y desionizada (estéril) | Mediatech | 25-055 | |
| Tripsina | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (opcional) | Gibco | 12604 | |
| Medios de cultivo de células tumorales (p. ej. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V medios sin suero | Invitrogen | 12055-083 | |
| Suero fetal bovino | Omega Scientific | FB-02 | |
| Microscopio | |||
| de diagnóstico | avanzados | ||
| Poly-D-Lisina | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectina | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Bolsas para autoclave | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Proliferación celular eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
Referencias
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
