Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.
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Artículo de método
Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp
En este artículo
Resumen
Resumen
La retina es la puerta de entrada al sistema visual. Para entender los mecanismos de procesamiento de señales visuales, investigamos las funciones de redes neuronales de la retina. Neuronas de la retina en la red forman parte de numerosos subtipos. Más de 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y han sido identificados por los estudios morfológicos. Múltiples subtipos de neuronas de la retina se cree que codificar distintas características de señalización visual, tales como el movimiento y el color, y formar múltiples vías neurales. Sin embargo, los papeles funcionales de cada neurona en el procesamiento de señal visual no se entienden completamente. El método de patch clamp es útil para abordar esta cuestión fundamental. Aquí, un protocolo para registrar las respuestas sinápticas luz evocadas en las neuronas de la retina de ratón utilizando grabaciones de patch clamp en condiciones adaptadas a la oscuridad se proporciona. Los ojos del ratón son adaptado a la oscuridad O / N, y el tramo preparativos de la retina son disecados en un cuarto oscuro utilizando iluminación infrarroja y los espectadores. La luz infrarroja noactivar fotorreceptores de ratón y así preserva su capacidad de respuesta luz. Patch clamp se utiliza para registrar las respuestas de luz evocadas en las neuronas de la retina. Se inyecta un tinte fluorescente durante las grabaciones para caracterizar los subtipos morfológicos neuronales. Este procedimiento nos permite determinar las funciones fisiológicas de cada neurona en la retina del ratón.
Introducción
La retina es una de las partes únicas del sistema nervioso. Como parte accesible del cerebro, su arquitectura sináptica ha sido bien caracterizada. Además, se pueden examinar las funciones de esta red neuronal con un estímulo fisiológico: la luz. Si el tejido de la retina se aísla en una habitación oscura con los procedimientos adecuados, las neuronas del tejido responderán a la luz. Esta preparación se ha utilizado para estudiar el procesamiento de señales visuales y dilucidar varios mecanismos sinápticos y funciones de la red neuronal, así como mecanismos de enfermedades.
Las respuestas a la luz en las neuronas de la retina se han regist....
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Protocolo
Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne.
1. Preparación de la solución Experimental
- Prepare la solución de disección 1 día a 1 semana antes del experimento real. Use una solución tampón HEPES para la disección de la retina debido a su gran capacidad de amortiguación a temperaturas más bajas 16. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, CaCl2 2,5, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glucosa. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH.....
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Resultados
Una rodaja de preparación representativo se muestra en la Figura 1. La preparación rebanada está en una posición recta, mostrando fotorreceptores a las células ganglionares en una superficie plana, y no hay desprendimiento del papel de filtro. Si se inclina una rebanada, sólo una parte de la preparación está en foco, lo que hace difícil identificar una célula apropiada para la sujeción del parche. Para las grabaciones, es importante seleccionar una buena soma, que generalmente tiene una superficie brill.......
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Discusión
Las buenas grabaciones solo se pueden lograr con buenas preparaciones retinianas y configuraciones de pinzas de parche bien diseñadas. Aunque todos los pasos descritos anteriormente son importantes, la discusión destaca algunos pasos críticos tanto para la disección como para las grabaciones.
Para la disección, dos cosas son especialmente importantes: enfriamiento y oxigenación. Después de enuclear el ojo, retire rápidamente la parte frontal del ojo en una cámara de disección con una solución.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund y RPB.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones (28-60 días de edad, macho) | Laboratorio Jackson | C57BL/6J cepa | |
| Polvo medio de Ames | Sigma | A1420 | excelente |
| Microscopio estereoscópico | Nikon | SMZ745 | excelente |
| Herramienta de disección: pinzas | Dumont | # 4, # 5, # 55 | excelente |
| Herramienta de disección: tijeras | Roboz | RS-5605 | excelente |
| Herramienta de disección: bisturí de cirugía | Surgistar | 7514 | excelente |
| hoja de afeitar (para picador) | EMS | 71970 | excelente |
| Chopper | hecho a mano | ||
| Visor infrarrojo | Owl Optics | NOBG1 | Muestra una vista brillante. Enfocar objetos pequeños es un problema. |
| Extractor | Sutter | P-1000 | excelente; hace pipetas de tamaño consistente. |
| Caja oscura | Pelican | caja oscura | excelente |
| Sistema de sujeción de parche | Scientifica | Visor de corte 2000 | Excelente configuración. La mayoría de los componentes clave están incluidos en un paquete. Los micromanipuladores son excelentes. |
| Amplificador | Molecular Devices | multiclamp 700B | Excelente y fácil control. |
| Adquisición de software | Molecular Devices | software pClamp | Excelente y fácil control. |
| Fuente de luz (LED) | Cool LED | pE-2 Sistema de 4 canales | Excelente |
| cámara CCD | Q-imaging | Retiga 2000 | Excelente |
| jaula de Faraday | hecha |
Referencias
- Werblin, F. S., Dowling, J. E. Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording. J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excita....
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Reimpresiones y permisos
