Grabación Luz evocó-Respuestas postsinápticos en las neuronas en adaptadas oscuro, Preparaciones ratón retina Slice Uso de técnicas Patch Clamp

Resumen

Demostraremos cómo preparar cortes de retina a partir del ojo del ratón y registrar las respuestas a la luz en las neuronas de la retina. Todo el procedimiento se lleva a cabo en condiciones adaptadas a la oscuridad.

Resumen

La retina es la puerta de entrada al sistema visual. Para entender los mecanismos de procesamiento de señales visuales, investigamos las funciones de redes neuronales de la retina. Neuronas de la retina en la red forman parte de numerosos subtipos. Más de 10 subtipos de células bipolares, células ganglionares, células amacrinas y han sido identificados por los estudios morfológicos. Múltiples subtipos de neuronas de la retina se cree que codificar distintas características de señalización visual, tales como el movimiento y el color, y formar múltiples vías neurales. Sin embargo, los papeles funcionales de cada neurona en el procesamiento de señal visual no se entienden completamente. El método de patch clamp es útil para abordar esta cuestión fundamental. Aquí, un protocolo para registrar las respuestas sinápticas luz evocadas en las neuronas de la retina de ratón utilizando grabaciones de patch clamp en condiciones adaptadas a la oscuridad se proporciona. Los ojos del ratón son adaptado a la oscuridad O / N, y el tramo preparativos de la retina son disecados en un cuarto oscuro utilizando iluminación infrarroja y los espectadores. La luz infrarroja noactivar fotorreceptores de ratón y así preserva su capacidad de respuesta luz. Patch clamp se utiliza para registrar las respuestas de luz evocadas en las neuronas de la retina. Se inyecta un tinte fluorescente durante las grabaciones para caracterizar los subtipos morfológicos neuronales. Este procedimiento nos permite determinar las funciones fisiológicas de cada neurona en la retina del ratón.

Introducción

La retina es una de las partes únicas del sistema nervioso. Como parte accesible del cerebro, su arquitectura sináptica ha sido bien caracterizada. Además, se pueden examinar las funciones de esta red neuronal con un estímulo fisiológico: la luz. Si el tejido de la retina se aísla en una habitación oscura con los procedimientos adecuados, las neuronas del tejido responderán a la luz. Esta preparación se ha utilizado para estudiar el procesamiento de señales visuales y dilucidar varios mecanismos sinápticos y funciones de la red neuronal, así como mecanismos de enfermedades.

Las respuestas a la luz en las neuronas de la retina se han registrado durante décadas. Los primeros estudios utilizaron electrodos afilados para hacer registros intracelulares^{de neuronas} retinianas de cachorro de barro. En la década de 1980, se inventó la técnica de pinza de parche², y pronto se convirtió en un método popular entre los investigadores de la visión^3,4. Las grabaciones de células individuales de vertebrados inferiores, incluidas las neuronas retinianas de cachorros de barro y peces, fueron métodos populares que contribuyeron a la elucidación de los mecanismos de procesamiento de señales visuales^5,6.

Después de que se desarrollaron las técnicas de mutación genética, la retina del ratón se convirtió en un modelo más popular para los investigadores de la visión^7-9. La retina de los mamíferos es más atractiva que la de los vertebrados inferiores porque está evolutivamente más cerca de la retina humana, y existe la oportunidad de utilizar modelos de enfermedades. Sin embargo, las células de la retina del ratón son pequeñas y frágiles¹⁰, y hacer preparaciones de la retina y realizar grabaciones de pinzas de parche en una habitación oscura es un desafío. A medida que la tecnología ha mejorado, se han puesto a disposición diversos enfoques para estudiar los mecanismos de señalización visual, como los estudios de imagen¹¹ y el electrorretinograma (ERG)¹². Sin embargo, el registro de una sola célula con el método de fijación de parche sigue siendo importante porque es muy sensible temporal y espacialmente en comparación con otros métodos. Por lo tanto, hemos realizado continuamente registros de pinzas de parche y hemos mejorado nuestros métodos para investigar el procesamiento de señales visuales en preparaciones de cortes de retina de ratón^13-15.

En este video tutorial, se presentan los protocolos con consejos importantes. Las buenas grabaciones solo se pueden lograr con una buena preparación. La práctica de la disección de animales y la construcción de un equipo de sujeción de parche resistente permitirá a la mayoría de los investigadores lograr grabaciones exitosas.

Protocolo

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne.

1. Preparación de la solución Experimental

1. Prepare la solución de disección 1 día a 1 semana antes del experimento real. Use una solución tampón HEPES para la disección de la retina debido a su gran capacidad de amortiguación a temperaturas más bajas ^16. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 115 NaCl, 2,5 KCl, _CaCl2 2,5, 1,0 _MgCl2, 10 HEPES, 28 glucosa. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Conservar la solución en el refrigerador hasta por 1 semana.
2. La solución de registro es medio de Ames, que es un líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) diseñado para preparaciones de la retina ^17. Por el día del experimento, pesar polvo Ames '(4,4 g por 500 ml de solución) en un tubo. Además, pesar _NaHCO3 (0,95 g por 500 ml de solución) y mezclar con la Apolvo mes.
3. Prepare la solución de la pipeta intracelular para las grabaciones de patch clamp por el día del experimento. Mezclar todos los productos químicos de la siguiente manera (en mM): 111 K-gluconato, 1,0 _CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 de NaCl, 1,0 MgCl _2, 5 ATP-Mg y 1,0 GTP-Na. Ajustar el pH a 7,2 con KOH. Se filtra la solución de la pipeta con un filtro de jeringa convencional. Haga ~ 500 ml de alícuotas y almacenarlos en un congelador o un congelador.

2. Preparación para el Día del Experimento

1. La noche antes del experimento, coloca un ratón en una jaula (C57BL / 6J o antecedentes similares, 4-8 semanas de edad, macho) en un espacio oscuro de O / N adaptación a la oscuridad.
2. Preparación para la disección:
   1. Rellene disección solución (100 - 200 ml) en un vaso de vidrio, colóquelo sobre hielo, y la burbuja de oxígeno durante al menos 10 min.
   2. Iniciar la oxigenación de la caja oscura para el almacenamiento de preparación de la retina.
   3. Preparar cubreobjetos de plástico con rieles de engrase para rerebanada preparativos intes- y colocar cada uno de ellos en un plato de plástico de 35 mm.
   4. Adjunte una nueva hoja de afeitar para un helicóptero (máquina de cortar el tejido).
   5. Cortar una membrana de filtro en dos mitades. Esto es para el corte en lonchas de la retina.
   6. Alinear las herramientas de disección y pipetas de transferencia cerca del microscopio de disección. El área de trabajo debe estar bien organizado para que cada herramienta se puede acceder fácilmente en la oscuridad.
3. Preparación para las grabaciones de patch clamp:
   1. Disuelva el polvo de Ames y _NaHCO3 en agua destilada (4,4 g Ames y NaHCO ₃ 0,95 g / 500 ml ddH ₂ O). Medio de la burbuja el Ames 'con oxígeno mixta (95% O ₂ y 5% de CO ₂₎ durante al menos 30 min mientras se calienta a un nivel de temperatura de grabación (~ 35 ° C). Ajustar el pH a 7,4 con NaHCO ₃ mientras que todavía burbujeante.
   2. Descongelar la solución de la pipeta interna durante la disección. Después de que se haya descongelado, añadir 0,01% sulforodamina B para la tinción intracelular.

3. Disección de retina

1. En un cuarto oscuro, la eutanasia con el ratón utilizando dióxido de carbono y el neumotórax bilateral. Al cabo de 2 - 3 minutos de usar el dióxido de carbono, el ratón perder el conocimiento.
2. Cuando el ratón ya no responde a una pizca de cola, enuclear rápidamente los ojos y colocarlos en una solución de disección fría en un plato de plástico. Realice el neumotórax bilateral para asegurar la muerte del animal. Almacenar rápidamente el ojo en el plato en la caja oscura. Utilice un visor de infrarrojos para llevar a cabo el procedimiento en la oscuridad.
   NOTA: Como alternativa, isoflurano, la decapitación o dislocación cervical se pueden utilizar para la eutanasia. El método de la eutanasia debe seguir las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) y / o el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional.
3. En una habitación oscura, ajuste el microscopio de disección y la iluminación infrarroja. Bajo el microscopio, transferir un ojo de su plato en un plato de plástico de 10 cm wITH la solución de disección enfriado. Continuamente burbuja de oxígeno a través de la tubería colocada en la parte inferior del plato de plástico. Ajustar el volumen de flujo por lo que no es demasiado baja, pero asegurarse de que no es lo suficientemente alta como para perturbar la disección.
4. Córnea y el cristalino eliminación:
   1. Hacer una incisión en la parte superior de la córnea con un cuchillo micro-quirúrgica. Sosteniendo el nervio óptico en el otro extremo del globo ocular evita que el ojo se mueva. Extienda el corte con un par de tijeras quirúrgicas. Recorta la córnea con algunos esclerótica alrededor.
   2. Coge la lente con una pinza fina y tire lentamente el objetivo. Si el vítreo es demasiado pegajosa para quitar la lente, cortar el vítreo con un par de tijeras.
   3. Una vez que se hace el ojo-taza, vierta suavemente solución de disección fría y oxigenada en el ocular con una pequeña pipeta de transferencia.
      NOTA: El globo ocular se desinfla rápidamente después se hace una incisión en la córnea. Es importante para mantener la forma del ojo como deformar el ojo durante este proprocedimiento daña la retina y causar desprendimiento de retina.
5. La identificación de las partes dorsal y ventral de la retina:
   NOTA: Debido a la desigual distribución de la verde y la luz ultravioleta (UV) conos ^18, la identificación de un área específica de la retina que es importante para las grabaciones de respuesta de luz.
   1. Identificar la línea que va a través del ocular de la retina que pasa cerca de la cabeza del nervio óptico. Esta línea pasa sobre todo a través de la parte ventral del nervio óptico; el lado incluyendo el nervio óptico es el lado dorsal, mientras que el otro es ventral ^19. Ver este hito claramente bajo espectadores infrarrojos.
   2. Dependiendo del propósito del experimento, hacer un corte en el lado innecesario. Esto será útil después de aislar la retina de la copa para el ojo.
6. Eliminación Vítreo:
   1. Opcionalmente, se incuba el ojo-taza con hialuronidasa (0,5 mg / ml) durante 15 min.
   2. Retire el vítreo con pinzas extra-finas. El humor vítreo es principalmenteunido a la parte inferior y el borde exterior del ojo-cup. Retire con cuidado sin tocar o meter la retina. Como el vítreo podría estar estrechamente unida a la ojera, retire con cuidado para evitar el desprendimiento de retina del ojo taza. Continúe tirando hasta que no sienta la tensión.
      NOTA: Este paso es especialmente importante para la disección de la retina del ratón; Sin embargo, no es un problema para las retinas de otras especies, tales como la rata o salamandra.
7. Aislar la retina del ojo taza. Coge la esclerótica y pelar suavemente de la retina utilizando la parte trasera de fórceps.
   NOTA: Todo el montaje preparativos de la retina se puede hacer de la retina aislada. Hacer tres y cincuenta y siete cortes en los bordes y aplanar la retina, o cortar la retina en varios pedazos.
8. Recortar la retina y deseche el medio innecesario de la retina (paso 3.5). En el mismo plato de plástico, cortar la retina restante en dos piezas. Por cada pieza de la retina, cortar los bordes para hacer unalosa de la retina, y recortar los bordes plegables.
9. Transferir una losa de la retina en una placa de vidrio usando una pipeta de transferencia de gran tamaño (~ 2 ml). Aspirar el exceso de solución con una pequeña pipeta, usar un trozo de papel de filtro para aplanar la losa, y luego colocar rápidamente una pieza de la membrana de filtro en la parte superior del tejido.
   1. Utilizando una pequeña pipeta de transferencia, colocar una gota de solución en la disección de la membrana de filtro. Espere ~ 15 seg hasta que la solución se extiende sobre la membrana. Durante este tiempo, el tejido de la retina se adhieren a la membrana de filtro.
   2. Verter solución de disección más fría debajo y alrededor del filtro. El tejido de la retina con la membrana de filtro flotará. Coge la membrana de filtro con una pinza y colocarla en la cámara de corte. Vierta la disección de solución sobre el tejido, y almacenar la preparación en la caja oscura.
      NOTA: El procedimiento descrito aquí es fundamental. Es importante para llevar a cabo estos pasos con rapidez para garantizar que los palos tejido de la retina a los filtros de membrana y no se seque.
10. El uso de un interruptor, cortar el tejido de la retina en rodajas. Alrededor de 200 micras de espesor es factible para los estudios de patch clamp.
11. Coloque un cubreobjetos de plástico con rieles de grasa en la cámara de corte. Transferir una rebanada de la retina en la parte superior de los carriles de grasa en un cubreobjetos de plástico. Girar la rebanada 90 ° de modo que la sección transversal es visible. Presione la membrana de filtro hacia abajo sobre el cubreobjetos, a continuación, cubrir los lados del papel de filtro con grasa.
    1. Después de la rebanada se inmoviliza sobre un cubreobjetos de plástico, agarrar el cubreobjetos y la transfiere a un plato de plástico de 35 mm. Vierta la solución de disección fría en la preparación de la retina y sumergir la preparación. Almacenar cada plato en la caja oscura, que debe ser oxigenada continuamente.
       NOTA: Todo el procedimiento que se debe hacer con cuidado para que la membrana de filtro no se deforma. De lo contrario, la rebanada de la retina se separa fácilmente de la membrana de filtro.

4. Patch Clamp Grabaciones de retina Preparación rebanada

1. Grabación de preparación:
   1. Prime los tubos de perfusión con medio de Ames. Permitir todas las burbujas que atraviesan al llenar el tubo.
   2. Haga pipetas de registro patch clamp con un extractor. Para llenar una pipeta con la solución de la pipeta, baño en la parte trasera de una pipeta de 1 min hasta que se rellena la punta de la pipeta. A continuación, llenar ~ 1/3 de la pipeta usando una carga micro-pipeta. Guarde cada pipeta en una caja pipeta húmedo.
   3. Encienda el equipo para patch clamp grabaciones; incluyendo la computadora, un amplificador, cámara CCD, y el microscopio.
2. Apague la luz de la habitación. Coloque una rebanada preparación de la retina en la cámara de platina del microscopio utilizando un visor de infrarrojos. Después de que se inmoviliza, comenzar la perfusión continua. Ajuste la temperatura de perfusión a 33 a 37 ° C.
3. Ver la superficie rebanada con la cámara CCD. Centrarse en la ubicación de destino donde el objetivo cetipos ll residen. Seleccione una celda de aspecto saludable para la grabación de patch clamp (es decir, debe tener la superficie de aspecto suave y una buena forma de la célula).
4. Coloque una pipeta de grabación en un soporte de pipetas. Avanzar en la pipeta para la preparación rebanada. Cuando se está cerca de la rebanada preparación (~ 2 mm por encima), encontrar la punta de la pipeta con el microscopio. Una vez que la punta de la pipeta es visible bajo el microscopio, mover la punta hacia abajo, hacia la célula diana.
5. Ajuste el amplificador. Ajustar la pipeta a 0 mV / 0 pA (puesta a cero) y comenzar un pulso eléctrico continuo de ~ 5 mV a ~ 10 Hz. Compruebe la resistencia de la pipeta; resistencia ideal está entre 5 y 10 MΩ para la mayoría de las neuronas de la retina.
6. Comience soplando desde la punta. Utilice una boquilla, o utilizar una jeringa, para aplicar presión positiva cuando la pipeta se sumerge en la solución del baño. Continuamente soplar la solución interna hasta que la punta está en la superficie de la célula diana.
   1. Cuando la presión positiva hace un pequeño hoyuelo en el thsuperficie celular e, avanzar en la punta ligeramente y dejar de soplar. Compruebe la resistencia de la pipeta, que debería aumentar. Si está aumentando continuamente, déjelo y vigilar la resistencia hasta que llegue> 1 GΩ (gigaseal). Si la resistencia no aumenta de forma espontánea, aplicar suavemente presión negativa hasta que se convierte en un gigaseal.
7. Después de lograr la gigaseal, cambie el potencial de mantenimiento de -70 mV. A continuación, aplicar intermitentemente presión negativa para romper la membrana dentro de la punta de la pipeta. Cuando se realiza la configuración de célula completa, la resistencia de la pipeta puede estar entre 500 MΩ y 1 GΩ, y la corriente capacitiva se ve. A veces las corrientes postsinápticas espontáneas se pueden observar.
8. Anote la relación IV -80-40 mV. Los diferentes tipos de canales dependientes de voltaje se activan dependiendo del tipo de célula.
9. Evocó luz corrientes o tensiones sinápticas Record.

Resultados

Una rodaja de preparación representativo se muestra en la Figura 1. La preparación rebanada está en una posición recta, mostrando fotorreceptores a las células ganglionares en una superficie plana, y no hay desprendimiento del papel de filtro. Si se inclina una rebanada, sólo una parte de la preparación está en foco, lo que hace difícil identificar una célula apropiada para la sujeción del parche. Para las grabaciones, es importante seleccionar una buena soma, que generalmente tiene una superficie brill...

Discusión

Las buenas grabaciones solo se pueden lograr con buenas preparaciones retinianas y configuraciones de pinzas de parche bien diseñadas. Aunque todos los pasos descritos anteriormente son importantes, la discusión destaca algunos pasos críticos tanto para la disección como para las grabaciones.

Para la disección, dos cosas son especialmente importantes: enfriamiento y oxigenación. Después de enuclear el ojo, retire rápidamente la parte frontal del ojo en una cámara de disección con una solución...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratones (28-60 días de edad, macho)	Laboratorio Jackson	C57BL/6J cepa
Polvo medio de Ames	Sigma	A1420	excelente
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ745	excelente
Herramienta de disección: pinzas	Dumont	# 4, # 5, # 55	excelente
Herramienta de disección: tijeras	Roboz	RS-5605	excelente
Herramienta de disección: bisturí de cirugía	Surgistar	7514	excelente
hoja de afeitar (para picador)	EMS	71970	excelente
Chopper	hecho a mano
Visor infrarrojo	Owl Optics	NOBG1	Muestra una vista brillante. Enfocar objetos pequeños es un problema.
Extractor	Sutter	P-1000	excelente; hace pipetas de tamaño consistente.
Caja oscura	Pelican	caja oscura	excelente
Sistema de sujeción de parche	Scientifica	Visor de corte 2000	Excelente configuración. La mayoría de los componentes clave están incluidos en un paquete. Los micromanipuladores son excelentes.
Amplificador	Molecular Devices	multiclamp 700B	Excelente y fácil control.
Adquisición de software	Molecular Devices	software pClamp	Excelente y fácil control.
Fuente de luz (LED)	Cool LED	pE-2 Sistema de 4 canales	Excelente
cámara CCD	Q-imaging	Retiga 2000	Excelente
jaula de Faraday	hecha