Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

Touraj Shokati; Nicholas Bodenberger; Holly Gadpaille; Björn Schniedewind; Alexander A. Vinks; Wenlei Jiang; Rita R. Alloway; Uwe Christians

doi:10.3791/52424

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Cuantificación del inmunosupresor tacrolimus en gotas de sangre seca mediante LC-MS/MS

16.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/52424

⸱

8 de noviembre de 2015

Touraj Shokati¹ , Nicholas Bodenberger¹ , Holly Gadpaille¹ , Björn Schniedewind¹ , Alexander A. Vinks² , Wenlei Jiang³ , Rita R. Alloway⁴ , Uwe Christians¹

¹iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, ²Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, ³Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, ⁴Transplant Clinical Research, University of Cincinnati

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) para cuantificar el inmunosupresor tacrolimus en manchas de sangre seca utilizando un paso simple de precipitación manual de proteínas y extracción en columna en línea.

Resumen

El inhibidor de calcineurina tacrolimus es la piedra angular de la mayoría de los protocolos de tratamiento inmunosupresor después del trasplante de órganos sólidos en los Estados Unidos. El tacrolimus es un fármaco de índice terapéutico estrecho y, como tal, requiere un seguimiento terapéutico del fármaco y un ajuste de la dosis en función de sus concentraciones mínimas en sangre total. Para facilitar el seguimiento de la adherencia y la farmacoterapia terapéutica en el hogar, la recolección de gotas de sangre seca es un concepto atractivo. Después de una punción en el dedo, el paciente recoge una gota de sangre en papel de filtro en casa. Una vez que la sangre se seca, se envía por correo al laboratorio analítico donde se cuantifica el tacrolimus mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) en combinación con un simple paso manual de precipitación de proteínas y extracción en columna en línea.

Para el análisis de tacrolimus, se perfora un disco de 6 mm desde el centro saturado de la mancha de sangre. La gota de sangre se homogeneiza utilizando un mezclador de bala y luego las proteínas se precipitan con metanol/0,2 M ZnSO₄que contiene el estándar interno D_2,13 C-tacrolimus. Después del vórtice y la centrifugación, se inyectan 100 μl de sobrenadante en una columna de extracción en línea y se lavan con 5 ml/min de ácido fórmico/acetonitrilo 0,1 (7:3, v:v) durante 1 min. A continuación, se activa la válvula de conmutación y los analitos se retrolavan en la columna analítica (y se separan mediante un gradiente de ácido fórmico/acetonitrilo del 0,1%). El tacrolimus se cuantifica en el modo de reacción múltiple positiva (MRM) utilizando un espectrómetro de masas en tándem.

El ensayo es lineal de 1 a 50 ng/ml. La variabilidad entre ensayos (3,6%-6,1%) y la precisión (91,7%-101,6%) evaluadas durante 20 días cumplen con los criterios de aceptación. La recuperación media de la extracción es del 95,5%. No hay arrastre relevante, interferencias de matriz ni efectos de matriz. El tacrolimus es estable en las gotas de sangre seca a RT y a +4 °C durante 1 semana. Las muestras extraídas en el muestreador automático son estables a +4 °C durante al menos 72 horas.

Introducción

Tacrolimus es un potente immonosupresor^1-7 que tiene una estructura de macrólidos⁸ (Figura 1). Debido a la isomería cis-trans de los enlaces CN, forma dos rotámeros en la solución ⁹ que se pueden separar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa El tacrolimus es lipofílico y soluble en alcoholes (metanol: 653 g/L, etanol: 355 g/L), hidrocarburos halogenados (cloroformo: 573 g/L) y éter. Es escasamente soluble en hidrocarburos alifáticos (hexano: 0,1 g/L y agua (pH 3: 0,0047 g/L)⁹. La molécula no contiene ningún cromóforo y su máxima de absorción de rayos UV es....