Artículo de método

Determinación basada en el crecimiento y en la confirmación bioquímica de Requisitos Genéticos para la degradación de proteínas en Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/52428

⸱

16 de febrero de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Division of Nephrology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo describe un ensayo basado en el crecimiento de levaduras para la determinación de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas. También demuestra un método para la extracción rápida de proteínas de levadura, adecuado para la transferencia de Western para confirmar bioquímicamente los requisitos de degradación. Estas técnicas se pueden adaptar para monitorear la degradación de una variedad de proteínas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La degradación de proteínas regulado es crucial para prácticamente todas las funciones celulares. Gran parte de lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares y los requisitos genéticos para la degradación de proteínas eucariotas se estableció inicialmente en Saccharomyces cerevisiae. Los análisis clásicos de la degradación de proteínas se han basado en pulso-caza y cicloheximida-caza metodologías bioquímicas. Aunque estas técnicas proporcionan medios sensibles para la observación de la degradación de proteínas, que son laboriosos, consumen mucho tiempo, y de bajo rendimiento. Estos enfoques no son susceptibles de cribado rápido o a gran escala para las mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se describe un ensayo basado en el crecimiento de la levadura para la identificación fácil de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. En este ensayo, una enzima reportero requerido para el crecimiento bajo condiciones selectivas específicas se fusiona a una proteína inestable. Las células que carecen de la enzima reportero endógena pero que expresan la proteína de fusión puede crecer bajo selecondiciones ctive sólo cuando se estabiliza la proteína de fusión (es decir, cuando se ve comprometida la degradación de proteínas). En el ensayo de crecimiento descrito aquí, diluciones en serie de tipo salvaje y células de levadura mutantes que albergan un plásmido que codifica una proteína de fusión se manchan sobre medio selectivo y no selectivo. Crecimiento en condiciones selectivas es consistente con la degradación de deterioro por una mutación dada. El aumento de la abundancia de proteínas debe ser confirmada bioquímicamente. Un método para la rápida extracción de proteínas de levadura en una forma adecuada para la electroforesis y transferencia Western también se demuestra. Una lectura basada en el crecimiento para la estabilidad de la proteína, combinado con un protocolo sencillo para la extracción de proteína para el análisis bioquímico, facilita la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de la proteína. Estas técnicas se pueden adaptar para controlar la degradación de una variedad de proteínas de vida corta. En el ejemplo presentado, la enzima His3, que se requiere para la biosíntesis de histidina, se fusionóa Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 está destinada a la degradación después de que encaje de forma aberrante translocón retículo endoplásmico. Las células que albergan Deg1 -Sec62-His3 fueron capaces de crecer en condiciones selectivas cuando se estabilizó la proteína.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La degradación de proteínas selectiva es esencial para la vida eucariota, y la degradación de proteínas alterada contribuye a una serie de condiciones médicas, incluyendo varios tipos de cáncer, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, y la fibrosis quística 1-5. El sistema ubiquitina-proteasoma (UPS), que cataliza la degradación selectiva de proteínas, es una diana terapéutica emergente para estas condiciones 6-10. Ubiquitina ligasas unir covalentemente polímeros de la ubiquitina de ácido 76-amino de proteínas 11. Las proteínas que se han marcado con cadenas poliubiquitina son reconocidos y proteolizadas por los ~ 2.5 megadalton proteasoma 26S 12. Los estudios iniciados en el organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido fundamental en la elucidación de los mecanismos de degradación de proteínas en células eucariotas. El primer sustrato fisiológico demostrada del UPS era la levadura represor transcripcional MATα2 13, Primero se identificaron 14, y muchos componentes altamente conservadas de la UPS o caracterizadas en la levadura (por ejemplo, 15-26). Los descubrimientos hechos en este modelo versátil y manejable de forma genética organismo es probable que continúe proporcionando importantes conocimientos sobre conservados mecanismos de degradación mediada por ubiquitina.

El reconocimiento y la degradación de la mayoría de los sustratos de UPS requieren la acción concertada de múltiples proteínas. Por lo tanto, un objetivo importante en la caracterización de la degradación regulada de una proteína dada es inestable para determinar los requisitos genéticos para la proteólisis. Los enfoques clásicos (por ejemplo de pulso-caza y experimentos cicloheximida-caza 27) para el seguimiento de la degradación de proteínas en células de mamífero o de levadura son laborioso y consume mucho tiempo. Si bien estos tipos de metodología proporcionan medios altamente sensibles para la detección de la degradación de proteínas, que no son adecuados para el análisis rápido de la degradación de proteína o Prueba de detección a gran escalang para mutaciones que impiden la degradación de proteínas. Aquí, se presenta un ensayo basado en un crecimiento de la levadura para la rápida identificación de los requisitos genéticos para la degradación de las proteínas inestables.

En el método basado en el crecimiento de la levadura para el análisis de la degradación de proteínas, una proteína inestable de interés (o señal de degradación) se fusiona, en marco, a una proteína que se requiere para el crecimiento de la levadura bajo circunstancias específicas. El resultado es un sustrato artificial que puede servir como una herramienta de gran alcance para determinar los requisitos genéticos de degradación de las proteínas de la proteína inestable de interés. Convenientemente, las cepas de levadura de laboratorio más comúnmente utilizados albergan un panel de mutaciones en genes que codifican enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de aminoácidos particulares o bases nitrogenadas (por ejemplo, 20,28-30). Estas enzimas son esenciales para la proliferación celular en ausencia de proporcionadas exógenamente metabolitos en cuya síntesis las enzimas participan. Talenzimas metabólicas pueden así funcionar como reporteros basadas en el crecimiento de la degradación de las proteínas inestables a las que se fusionan. Los requisitos genéticos para la degradación de la proteína pueden ser dilucidado fácilmente, ya que las mutaciones que impiden la proteolisis se permitir que las células que albergan el reportero de la degradación crezcan bajo condiciones selectivas.

Una ventaja de crecimiento es una indicación indirecta de que una mutación particular aumenta la abundancia de la proteína de interés. Sin embargo, se requiere un análisis bioquímico directo a confirmar que una mutación permite el crecimiento mediante el aumento de los niveles de proteína en lugar de a través de las causas indirectas o artefactos. El efecto de una mutación en la abundancia de proteínas puede ser confirmado por Western blot de los niveles de proteína en estado de equilibrio en las células que hacen y no albergan la mutación particular. Un método para la extracción rápida y eficiente de las proteínas de levadura (incubación secuencial de células de levadura con hidróxido de sodio y tampón de muestra) en una forma adecuadapara el análisis por transferencia de Western también se presenta 31. En conjunto, estos experimentos facilitar la rápida identificación de los reguladores candidatos de la degradación de proteínas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ensayo de crecimiento de la levadura para identificar mutantes candidatos defectuosos en la degradación de proteínas

  1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica una proteína inestable fusionado, en cuadro, a una enzima metabólica reportero.
  2. Inocular los transformantes en 5 ml de sintético definido (SD) medio mínimo que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
  3. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD 600) de cada cultivo de una noche.
    NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células en cultivo puede estar en fase de crecimiento logarítmico o estacionario, pero deberá haber alcanzado una OD 600 de 0,2 mínimo. Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
  4. Preparar seis veces diluciones en serie de células de levadura transformadas en una placa de 96 pocillos estériles, a partir de células diluidas a unan OD 600 de 0,2. Coloque cada transformante de levadura a ensayar en una fila diferente en la placa de 96 pocillos.
    1. Para cada transformante, calcular el volumen de cultivo de una noche requerido para diluir las células hasta una DO 600 de 0,2 en un volumen final de 200 microlitros. Añadir este volumen de cultivo durante la noche al pocillo correspondiente en la columna 1. Añadir la cantidad apropiada de agua estéril para llevar el volumen a 200 l.
    2. Para cada fila de la levadura, añadir 125 l de agua estéril a los pocillos en las columnas 2, 3, y 4.
      NOTA: placas de 96 pocillos estériles envueltas individualmente pueden envasarse con tapas estériles. Las tapas pueden ser utilizados como depósitos para el agua estéril que se distribuye en este paso. Esto permite la transferencia simultánea de agua estéril a todos los pocillos en una columna dada con una pipeta multicanal.
    3. Mezclar el contenido de la primera columna (levadura diluida a un OD 600 de 0,2) pipeteando arriba y abajo con una pipeta multicanal.
    4. Transfer 25 l de levadura de la Columna 1 Columna 2, utilizando una pipeta multicanal. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Transferencia de 25 l de la Columna 2 a columna 3, y 25 l de la columna 3 a la columna 4 (mezclando bien en cada paso).
  5. Mezclar cada muestra con una pipeta multicanal. Partiendo de más diluido para diluir menos columnas de levadura, pipeta de 4 l de cada muestra en dos placas que contenían el medio selectivo apropiado. Utilice una placa con medio que mantiene la selección del plásmido (Esta placa sirve como un manchado levadura y el control del crecimiento). Utilice una segunda placa con medio que selecciona para el mantenimiento del plásmido y la expresión de la proteína inestable fusionado a la enzima informadora. Debido a que la levadura resolver rápidamente, mezclar células pipeteando arriba y abajo a intervalos regulares.
    NOTA: Secador placas serán más fácilmente absorber líquidos que los platos recién preparados y por lo tanto se recomienda para estos experimentos. Placas húmedas se pueden secar por incubación a temperatura ambiente en low humedad durante 1-2 días o incubaciones cortas en una campana de flujo laminar. Las placas pueden secar de forma desigual si el flujo de aire laminar es paralelo a la mesa. El uso de una plantilla hace que sea más fácil de detectar células de levadura a distancias regulares. Dos plantillas de ejemplo se proporcionan en la Figura 1. Estos pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa.
  6. Permita que las placas se sequen en la parte superior del banco.
  7. Incubar las placas a 30 ° C durante 2-6 días.
  8. Fotografiar cada placa después de la incubación.

figure-protocol-1
Figura 1. Las plantillas para la detección de células de levadura en placas de agar de 100 mm. Estas plantillas se pueden usar para facilitar la detección de la levadura a distancias regulares con una pipeta multicanal. Las plantillas pueden ser impresas, cortadas y colocadas en el interior de un plato de Petri tapa. Coloque placa de Petri con el crecimientointerior de la tapa medio con plantilla fija. Plantillas están marcados con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Se recomienda que las placas utilizadas en los ensayos de crecimiento ser marcados de manera similar con una muesca para realizar un seguimiento de la orientación. Plantillas para la detección de cuatro (A) o cinco (B) se proporcionan diluciones seriadas de células de levadura. Haga clic aquí para ver una versión imprimible de esta figura con plantillas de 100 mm.

2. Ensayo de confirmación bioquímica de crecimiento de la levadura

  1. El crecimiento de células de levadura y Post-alcalina proteína Extracción (modificado de 31)
    1. Transformar de tipo salvaje y células de levadura mutante con un plásmido que codifica la proteína inestable.
    2. Inocular los transformantes en 5 ml de medio SD que es selectivo para células que albergan moléculas de plásmido. Incubar durante la noche a 30 ° C, en rotación.
    3. Mida el diámetro exterior 600 de cada cu nochelture.
      NOTA: Después de la incubación durante la noche, las células pueden estar en cualquier fase de crecimiento logarítmico o estática, pero han llegado a un OD 600 que permita la dilución a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco (etapa 2.1.4). Cepas de levadura de crecimiento muy lento pueden requerir tiempos de incubación más de una noche, o la inoculación de un mayor número de células, tal como se determina empíricamente.
    4. Diluir las células de levadura a un OD 600 de 0,2 en 10 ml de medio selectivo fresco.
    5. Continuar incubar las células a 30 ° C, rotación o agitación, hasta que los cultivos alcancen un OD 600 entre 0,8 y 1,2 (es decir, están en crecimiento semilogarítmica).
      NOTA: Si la proteína inestable de interés está bajo el control de un promotor regulable, el momento óptimo de la inducción de la expresión de la proteína y la cosecha de células puede variar de acuerdo con estudios previos u observaciones empíricas.
    6. Recoger 2,5 OD 600 unidades de cultivo en un 15 ml cónicaal tubo por centrifugación a 5000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
      NOTA: Una OD 600 unidad se define como la cantidad de levadura presente en 1 ml de cultivo a una DO 600 de 1,0. El volumen de cultivo (en ml) requerida para cosechar 2,5 OD 600 unidades (V) se puede determinar usando la siguiente ecuación: V = 2,5 OD 600 unidades / OD Medido 600
    7. Resuspender las células en 1 ml de agua destilada. Transferencia de células suspendidas a un tubo de microcentrífuga.
    8. Sedimentar las células por centrifugación a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
    9. Resuspender las células en 100 l de agua destilada con la pipeta hacia arriba y abajo o vórtice, y añadir 100 l de 0,2 M de NaOH. Mezclar pipeteando arriba y abajo. Incubar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente.
    10. Células de pellets (la mayoría de los cuales aún no han lanzado proteínas y son todavía viables) por centrifugación a 18.000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con la pipeta o aspiración.
    11. Resuspender pellet en 50 - 100 l de tampón de muestra Laemmli 1x, el cual lisar las células, pipeteando arriba y abajo o agitación con vórtex.
      NOTA: La eliminación del sobrenadante después de la centrifugación alcalina y posterior resuspensión de las células en tampón de muestra Laemmli extrae proteínas a un pH compatible con sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando un sistema de tampón de Tris-glicina y Western Blot.
    12. Para desnaturalizar completamente proteínas, se incuban los lisados ​​a 95 ° C durante 5 min.
      NOTA: Las proteínas de agregación propensos (por ejemplo, proteínas con varios segmentos de transmembrana) pueden llegar a ser insolubles cuando se incuba a 95 ° C. Por lo tanto, los lisados ​​deben incubarse a temperaturas más bajas (por ejemplo 37 ° C - 70 ° C) durante 10 a 30 min, determinado como empíricamente, para el análisis de tales proteínas.
    13. Super lisados ​​mediante la colocación en hielo durante 5 min.
    14. Centrifugar a lisados ​​18000 xg durante 1 min a temperatura ambiente para sedimentar el material insoluble. Separar el sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes del análisis de transferencia de western posterior (sección 2.2). Como alternativa, las tiendas lisados ​​a -20 ° C.
  2. Representante Protocolo de Transferencia Western
    1. Cargar empíricamente determinado volumen de lisados ​​en un gel de SDS-PAGE.
    2. Ejecutar gel a 200 V hasta el frente de colorante ha alcanzado la parte inferior del gel.
    3. Transferencia de proteínas a partir de gel de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de la membrana por transferencia en húmedo a 20 V para 60 a 90 min a 4 ° C.
    4. Bloquear la membrana por incubación en leche descremada al 5% en Tris-solución salina tamponada (TBS), oscilación, durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
    5. Decantar la solución de bloqueo.
    6. Incubar la membrana con el anticuerpo primario específico para la proteína de interés (o etiqueta de epítopo de los mismos) en 1% de leche desnatada en TBS con 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 h en la sala de temperatura, meciéndose.
    7. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    8. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
      NOTA: Debido a fluoróforos son sensibles a la luz, las diluciones de anticuerpos fluoróforo conjugado deben prepararse en la oscuridad. Además, la incubación de las membranas en la presencia de anticuerpos conjugado con fluoróforo debe ocurrir en recipientes a prueba de luz. Esto puede lograrse envolviendo las bandejas de incubación en papel de aluminio.
    9. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    10. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
    11. Después de la formación de imágenes de la membrana, se incuba la membrana con un anticuerpo primario específico para una cargaing proteína de control en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, meciéndose.
    12. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    13. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado en 1% de leche desnatada en TBS / T durante 1 hora a temperatura ambiente, de balanceo.
    14. Decantar la solución de anticuerpo, y lavar la membrana 3 x 5 min con TBS / T a temperatura ambiente, de balanceo.
    15. Adquirir imagen de membrana utilizando Li-Cor Odyssey CLx y el software Image Studio (o equipos de imagen comparable y software), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para ilustrar esta metodología, la enzima His3 se ha fusionado con el extremo carboxi-terminal del modelo de retículo endoplásmico (ER) la degradación -Associated (ERAD) sustrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para crear Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa uno de los fundadores de una nueva clase de sustratos ERAD que están dirigidos siguiente persistente, asociación aberrante con la translocon, el canal de los principales responsables de las proteí...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metodología que aquí se presenta permite la determinación rápida y la confirmación bioquímica de los requisitos genéticos para la degradación de proteínas en células de levadura. Estos experimentos ponen de relieve la utilidad y el poder de la levadura como un organismo eucariota modelo (varios excelentes críticas de la biología de la levadura y compilaciones de protocolos para el manejo, almacenamiento y manipulación de células de levadura (por ejemplo 41-44) están disponibles para los investigad...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Damos las gracias a los miembros actuales y anteriores del laboratorio Rubenstein para proporcionar un entorno de investigación y de apoyo entusiasta. Agradecemos a Ryan T. Gibson para la ayuda en la optimización del protocolo. Damos las gracias a Marcos Hochstrasser (Universidad de Yale) y Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para las cepas de levadura y plásmidos. Agradecemos a nuestros revisores anónimos por su ayuda en la mejora de la claridad y la utilidad de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio de investigación del capítulo de la Universidad Ball State de Sigma Xi a SGW, los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R15 GM111713) para EMR, un premio de investigación de la Universidad Ball State aspirar a EMR, y los fondos de la Universidad Ball State Oficina del Rector y del Departamento de Biología.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cepas de levadura deseadas, plásmidos, medio estándar y componentesLas cepas de levadura con las mutaciones deseadas pueden generarse en el laboratorio del investigador. La levadura de tipo salvaje y una variedad de mutantes también están disponibles comercialmente ( ejemplo de GE Healthcare). Los plásmidos que codifican proteínas de fusión pueden generarse en el laboratorio del investigador.
3-amino-1H-1,2,4-triazolFisher ScientificAC264571000Inhibidor competitivo de la enzima His3. Se puede incluir en el ensayo de medio para aumentar la rigurosidad del crecimiento utilizando construcciones reporteras His3.
Endoglicosidasa H (forma recombinante de Streptomyces plicatus)Roche11088726001Puede utilizarse para evaluar la N-glicosilación de proteínas; compatible con las concentraciones de SDS y beta-mercaptoetanol encontradas en 1x tampón de muestra Laemmli.
Tubos de vidrio de borosilicato desechablesFisher Scientific14-961-32Disponible en una variedad de fabricantes
Incubadora con regulación de temperatura (p. ej. Incubadora Heratherm modelo IMH180)Dot Scientific51028068Disponible en una variedad de fabricantes
New Brunswick Tambor intercambiable para tubos de 18 mm (rodillo de tubo)New BrunswickM1053-0450Se recomienda el rodillo de tubo para mantener durante la noche los cultivos iniciadores de levadura de células de levadura en suspensión. Se puede usar un agitador de plataforma o un rodillo de tubo para mantener cultivos más grandes en suspensión.
New Brunswick TC-7 Tambor de rodillos 120V 50/60 HNew BrunswickM1053-4004Para uso con rodillo de tubo
SmartSpec Plus EspectrofotómetroBio-Rad170-2525Disponible en una variedad de fabricantes Placas de
microprueba estériles de fondo plano de 96 pocillos con tapa envuelta individualmenteSarstedt82.1581.001Disponible en una variedad de fabricantes
Pipetman Neo P8x20N, 2-20 y mu; lGilsonF14401Disponible de una variedad de fabricantes
 
 
 

 
[header]
Pipetman Neo P8x200N, 20-200 μ lGilsonF14403Las pipetas monocanal y multicanal se utilizan en varias etapas del protocolo. Mientras que las pipetas multicanal reducen la carga de pipeteo en varios pasos, las pipetas monocanal se pueden utilizar en todo el protocolo. Disponible en una variedad de fabricantes.
Centrífuga 5430Eppendorf5427 000.216El rotor que se vende con unidad contiene tubos de microcentrífuga de 1,5 y 2,0 ml. El rotor se puede cambiar por uno que contenga tubos cónicos de 15 ml y 50 ml.
Sistema de imagen de placas (p. ej. Gel Doc XR+ System)Bio-Rad170-8195Se puede utilizar una variedad de sistemas para obtener imágenes de placas, incluidos sofisticados sistemas de imagen, escáneres de computadora y teléfonos con cámara.
Rotor de ángulo fijo F-35-6-30 con tapa y adaptadores para centrífuga modelo 5430/R, 15/50 ml Tubos cónicos, 6 plazasEppendorfF-35-6-30
15 ml tubo de tapón de rosca serigrafiado 17 x 20 mm cónico, polipropilenoSarstedt62.554.205Disponible en una variedad de fabricantes
Tubo flexible de 1,5 ml, PCR limpio, Tubos de microcentrífuga naturalEppendorf22364120Disponible en una variedad de fabricantes
Calentador analógico Dri-BathFisher Scientific1172011AQEl baño de agua hirviendo con placa caliente también se puede usar para desnaturalizar proteínas
SDS-PAGE aparatos de funcionamiento y transferencia, fuentes de alimentación y equipos de imágenes o cuartos oscuros para SDS-PAGE y transferencia a membranaVariará según el laboratorio y la aplicación
Sistema de adquisición de imágenes Western blot (p. ej. escáner Li-Cor Odyssey CLx y software Image Studio)Li-Cor9140-01Variará según el laboratorio y la aplicación
EMD Millipore Immobilon Membranas de transferencia de PVDFFisher ScientificIPFL00010Variará según el laboratorio y la aplicación
Anticuerpos primarios (p. ej. Fosfoglicerato quinasa (Pgk1) Anticuerpo monoclonal, ratón (clon 22C5D8))LifeTechnologies459250Variará según el laboratorio y la aplicación
Anticuerpos secundarios (p. ej. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))Life TechnologiesA-21065Variará según el laboratorio y la aplicación
tampón

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  2. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiological Reviews. 92, 537-576 (2012).
  3. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circulation Research. 112, 1046-1058 (2013).
  4. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443, 780-786 (2006).
  5. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1. S11(2007).
  6. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
  7. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Current Pharmaceutical Design. 19, 3175-3189 (2013).
  8. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30, 1172-1184 (2008).
  9. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Scheffner, M., Nuber, U., Huibregtse, J. M. Protein ubiquitination involving an E1-E2-E3 enzyme ubiquitin thioester cascade. Nature. 373, 81-83 (1995).
  12. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 679-690 (2008).
  13. Hochstrasser, M., Ellison, M. J., Chau, V., Varshavsky, A. The short-lived MAT alpha 2 transcriptional regulator is ubiquitinated in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 4606-4610 (1991).
  14. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  15. Bays, N. W., Gardner, R. G., Seelig, L. P., Joazeiro, C. A., Hampton, R. Y. Hrd1p/Der3p is a membrane-anchored ubiquitin ligase required for ER-associated degradation. Nature Cell Biology. 3, 24-29 (2001).
  16. Hampton, R. Y., Gardner, R. G., Rine, J. Role of 26S proteasome and HRD genes in the degradation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, an integral endoplasmic reticulum membrane protein. Molecular Biology of the Cell. 7, 2029-2044 (1996).
  17. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes & Development. 15, 2660-2674 (2001).
  18. Goebl, M. G., et al. The yeast cell cycle gene CDC34 encodes a ubiquitin-conjugating enzyme. Science. 241, 1331-1335 (1988).
  19. Bachmair, A., Finley, D., Varshavsky, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue. Science. 234, 179-186 (1986).
  20. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74, 357-369 (1993).
  21. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, 1969-1970 (2014).
  22. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. The EMBO Journal. 10, 555-562 (1991).
  23. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365, 176-179 (1993).
  24. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273, 1725-1728 (1996).
  25. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. The EMBO Journal. 11, 3077-3080 (1992).
  26. Knop, M., Finger, A., Braun, T., Hellmuth, K., Wolf, D. H. Der1, a novel protein specifically required for endoplasmic reticulum degradation in yeast. The EMBO Journal. 15, 753-763 (1996).
  27. Zattas, D., Adle, D. J., Rubenstein, E. M., Hochstrasser, M. N-terminal acetylation of the yeast Derlin Der1 is essential for Hrd1 ubiquitin-ligase activity toward luminal ER substrates. Molecular Biology of the Cell. 24, 890-900 (2013).
  28. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, 115-132 (1998).
  29. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, 19-27 (1989).
  30. Ralser, M., et al. The Saccharomyces cerevisiae W303-K6001 cross-platform genome sequence: insights into ancestry and physiology of a laboratory mutt. Open Biology. 2, 120093(2012).
  31. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16, 857-860 (2000).
  32. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. The Journal of Cell Biology. 197, 761-773 (2012).
  33. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. The EMBO Journal. 17, 3251-3257 (1998).
  34. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. The Journal of Cell Biology. 181, 1095-1105 (2008).
  35. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. The Journal of Cell Biology. 172, 211-219 (2006).
  36. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. The Journal of Biological Chemistry. 272, 20427-20434 (1997).
  37. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. The Journal of Biological Chemistry. 276, 541-550 (2001).
  38. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35, 13843-13848 (1996).
  39. Mumberg, D., Muller, R., Funk, M. Regulatable promoters of Saccharomyces cerevisiae: comparison of transcriptional activity and their use for heterologous expression. Nucleic Acids Research. 22, 5767-5768 (1994).
  40. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10, 2763-2788 (2009).
  41. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N., Burke, D. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
  42. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, 33-48 (2014).
  43. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. , Elsevier. San Diego. (2004).
  44. Sherman, F. Getting started with yeast. Methods in Enzymology. 350, 3-41 (2002).
  45. Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes & Development. 24, 893-903 (2010).
  46. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. The EMBO Journal. 25, 533-543 (2006).
  47. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. The Journal of Biological Chemistry. 283, 32302-32316 (2008).
  48. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Reports. 5, 692-697 (2004).
  49. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. The Journal of Biological Chemistry. 283, 16374-16383 (2008).
  50. Crouse, G. F. Mutagenesis assays in yeast. Methods. 22, 116-119 (2000).
  51. Le Douarin, B., Pierrat, B., vom Baur, E., Chambon, F., Losson, R. A new version of the two-hybrid assay for detection of protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 23, 876-878 (1995).
  52. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
  53. Toyn, J. H., Gunyuzlu, P. L., White, W. H., Thompson, L. A., Hollis, G. F. A counterselection for the tryptophan pathway in yeast: 5-fluoroanthranilic acid resistance. Yeast. 16, 553-560 (2000).
  54. Schafer, A., Wolf, D. H. Endoplasmic reticulum-associated protein quality control and degradation: genome-wide screen for ERAD components. Methods in Molecular Biology. 301, 289-292 (2005).
  55. Griggs, D. W., Johnston, M. Regulated expression of the GAL4 activator gene in yeast provides a sensitive genetic switch for glucose repression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 8597-8601 (1991).
  56. Duennwald, M. L. Growth assays to assess polyglutamine toxicity in yeast. The Journal of Visualized Experiments. (61), e3791(2012).
  57. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470, 145-179 (2010).
  58. Szymanski, E. P., Kerscher, O. Budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications. The Journal of Visualized Experiments. (80), e50921(2013).
  59. Hjelm, H., Sjodahl, J., Sjoquist, J. Immunologically active and structurally similar fragments of protein A from Staphylococcus aureus. European Journal of Biochemistry. 57, 395-403 (1975).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Ensayo de crecimiento de levadurasprote na de fusi nmedio selectivoextracci n de prote nasan lisis de Western blotdiluci n seriadaubiquitina ligasaprote na inestable

Artículos relacionados