Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.
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Artículo de método
Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica
En este artículo
Resumen
Resumen
Espectroscopia de fuerza atómica es una herramienta ideal para estudiar moléculas en superficies e interfaces. Se presenta un protocolo experimental para acoplar una gran variedad de moléculas individuales de forma covalente a una punta de AFM. Al mismo tiempo la punta del AFM se pasiva para evitar interacciones no específicas entre la punta y el sustrato, que es un requisito previo para estudiar moléculas individuales unidos a la punta del AFM. Los análisis para determinar la fuerza de adhesión, la longitud de la adhesión, y la energía libre de estas moléculas en superficies sólidas y bio-interfaces son poco presentaron y se proporcionan referencias externas de lectura adicional. Moléculas ejemplo son los politirosina poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas son desorbidos de diferentes superficies como CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado diamante y apoyaron bicapas lipídicas en diversas condiciones de disolvente. Por último, laventajas de la fuerza espectroscópicas única molécula de experimentos se discuten incluyendo medios para decidir si realmente una sola molécula se ha estudiado en el experimento.
Introducción
Durante los últimos 30 años, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha resultado ser una técnica de formación de imágenes valiosa para estudiar biológicos y sintéticos 1,2 3 materiales y superficies, ya que proporciona una resolución espacial molecular en las tres dimensiones y puede ser operado en varios disolvente ambientes. Además, AFM-fuerza única molécula de espectroscopia (SMF) permite medir las fuerzas que van desde la pN a μN régimen y ha dado una visión sin precedentes, por ejemplo, en el plegamiento de proteínas 4,5, física de polímeros 6-8, y la interacción molécula-superficie solo 9 - 12 .La razón detrás de estu....
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Protocolo
NOTA: Consulte la Figura 2 para una visión general del flujo del proceso que comprende la preparación, las medidas de adquisición de datos y análisis de datos.
1. Reactivo de instalación
NOTA: Todos los productos químicos deben ser manejados con cuidado, y por lo tanto una bata de laboratorio, se deben usar guantes y protección para los ojos. Todas las operaciones deben realizarse en una campana de laboratorio. En particular, guantes especiales deben ser usados en caso de uso cloroformo.
- Utilice productos químicos con bajo contenido de agua como el cloroformo seco rápidamente y al....
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Resultados
En lo siguiente, los resultados para el ejemplo de arriba describen moléculas, a saber, la politirosina polímeros de poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido, se presentan. En primer lugar para cada ejemplo, experimentar detalles específicos de adquisición de datos y preparación de datos se proporcionan. A continuación, se muestran los resultados ejemplares para experimentos en los que estas moléculas se desorbe de diferentes superficies (CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado .......
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Discusión
Durante las últimas décadas, los experimentos de una sola molécula han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y que resultó ser un enfoque muy valiosa en ciencias de la vida y más allá. Para lograr buenas estadísticas y significativas de los experimentos SMFS, idealmente una y la misma molécula se utiliza en todo el curso del experimento. En contraste con los experimentos con conjuntos de moléculas, los experimentos SMFS son capaces de detectar eventos raros y estados moleculares ocul.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la DFG (Hu 997/2-2) por su apoyo financiero. FS reconoce la Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr contó con el apoyo de Elitenetzwerk Bayern en el marco del programa de doctorado "Ciencia de los materiales de las interfaces complejas". SKi agradece al SFB 863 por su apoyo financiero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales | |||
| Concentrado líquido alcalino Hellmanex III (solución detergente) | Hellma | ||
| RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno (35%), amoníaco (32%); 5:1:1(v/v/v))Sigma | |||
| Vectabond reactivo / APTES (3-Aminopropil)trietoxisilano | Vectorlabs | ||
| seca (< 50 ppm H< sub>2O) | Sigma | ||
| Cloroformo seco (> 99.9%) | Sigma | ||
| Trietilamina | Sigma | ||
| Agua ultrapura | Biochrom, Alemania | ||
| Tetraborato de sodio (> 99.5%) | Biochrom, Alemania | ||
| Ácido Bórico | Biochrom, Alemania | ||
| Monofuncional &alfa;-metoxi-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS" | Rapp, Alemania | ||
| Heterobifuncional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, " NHS-PEG-NHS" | Rapp, Alemania | ||
| Heterobifuncional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS" | Rapp, Alemania | ||
| Molécula de sonda (polímero, lípido, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Cantidad suficiente de placas de cristalización de vidrio con boquilla (10 ml), placas de Petri de vidrio (500 y micro; l) y tapas de vidrio | VWR International GmbH, Alemania | ||
| [header] | |||
| Horno de laboratorio modelo UF30 | Memmert, Alemania | ||
| Sonicador de temperatura controlada | VWR International GmbH, Alemania | ||
| Sistema de plasma "Femto", 100 W | Diener, Alemania | ||
| Una jeringa de vidrio separada para cada disolvente orgánico | VWR International GmbH, Alemania | ||
| Vortex mezclador | VWR International GmbH, Alemania | ||
| Tubos de microcentrífuga (0,5 ml o 1,5 ml) | Pipetas Eppendorf | ||
| : 10-100 y micro; l, 50-200 y micro; l y 100-1.000 y micro; l | Eppendorf | ||
| AFM con celda de fluido controlada por temperatura ( p. ej., MFP-3D con BioHeater) | Asylulm Research, Santa Bárbara | ||
| Voladizos de SiN blando, típicamente hechos de nitruro de silicio (SiN) (constante de resorte inferior a 100 pN/nm, por ejemplo MLCT) | Bruker AXS, Santa Bárbara | ||
Referencias
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy.
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Reimpresiones y permisos
