Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica

Resumen

Se presenta un protocolo para acoplar una gran variedad de moléculas individuales covalentemente en una punta AFM. Se proporcionan procedimientos y ejemplos para determinar la fuerza de adhesión y la energía libre de estas moléculas sobre soportes sólidos y bio-interfaces.

Resumen

Espectroscopia de fuerza atómica es una herramienta ideal para estudiar moléculas en superficies e interfaces. Se presenta un protocolo experimental para acoplar una gran variedad de moléculas individuales de forma covalente a una punta de AFM. Al mismo tiempo la punta del AFM se pasiva para evitar interacciones no específicas entre la punta y el sustrato, que es un requisito previo para estudiar moléculas individuales unidos a la punta del AFM. Los análisis para determinar la fuerza de adhesión, la longitud de la adhesión, y la energía libre de estas moléculas en superficies sólidas y bio-interfaces son poco presentaron y se proporcionan referencias externas de lectura adicional. Moléculas ejemplo son los politirosina poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas son desorbidos de diferentes superficies como CH ₃ -SAMs, hidrógeno terminado diamante y apoyaron bicapas lipídicas en diversas condiciones de disolvente. Por último, laventajas de la fuerza espectroscópicas única molécula de experimentos se discuten incluyendo medios para decidir si realmente una sola molécula se ha estudiado en el experimento.

Introducción

Durante los últimos 30 años, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha resultado ser una técnica de formación de imágenes valiosa para estudiar biológicos y sintéticos ^{1,2 3} materiales y superficies, ya que proporciona una resolución espacial molecular en las tres dimensiones y puede ser operado en varios disolvente ambientes. Además, AFM-fuerza única molécula de espectroscopia (SMF) permite medir las fuerzas que van desde la pN a μN régimen y ha dado una visión sin precedentes, por ejemplo, en el plegamiento de proteínas ^4,5, física de polímeros ^6-8, y la interacción molécula-superficie solo ^{9 - 12} .La razón detrás de estudio de las moléculas individuales en lugar de un conjunto de moléculas es evitar los efectos que a menudo enmascaran eventos raros o estados moleculares promedio ocultos. Además, una multitud de parámetros moleculares, tales como la longitud de contorno, la longitud Kuhn, la energía libre de adherencia, etc. puede serobtenido. Esto se detalla en los ejemplos siguientes. En un experimento típico de AFM-SMFS, la molécula de sonda se acopla a una punta muy afilada a través de una molécula de engarce. La punta en sí está situado en el extremo de un voladizo flexible. Si la punta se pone en contacto con la superficie de la molécula de sonda va a interactuar con esta superficie. Mediante la observación de la deflexión del voladizo después de la retracción de la punta, la fuerza, y por lo tanto la energía libre, para separar la molécula de la superficie puede ser determinada. Para obtener estadísticas significativas, un gran número de las llamadas curvas de fuerza-distancia tienes que estar adquirida. Además, para tener una verdadera experimentos sola molécula (es decir, utilizando una y la misma molécula de sonda sobre la duración de todo el experimento) la molécula sonda debe estar acoplado de forma covalente a la punta del AFM. Aquí, se presenta un protocolo experimental para funcionalización en voladizo con una sola molécula a través de un enlace covalente. La molécula sola o bien se puede acoplar a través de un amino o un tiol grupo a la punta del AFM. El proceso de conjugación se puede realizar en una amplia variedad de disolventes (orgánica y acuosa) para tener en cuenta las propiedades de solvatación de los polímeros utilizados.

En la primera parte, un protocolo general para unir covalentemente una molécula única ("molécula de sonda") a través de una molécula de unión a una punta de AFM se describe. Para este fin, NHS orgánico o maleimida-química se utiliza ^13. Junto con el protocolo de tres moléculas ejemplo, los procesos de adquisición de datos y análisis de datos se describen y se proporcionan referencias para lectura adicional. Los ejemplos de moléculas son: la (lineal) tirosina polímero, el polímero de injerto PI- g-PS y el Papa de los lípidos. Esto incluye ligeras variaciones del protocolo, por ejemplo para unir covalentemente cisteínas. Además, una sección está dedicada a la preparación de diferentes superficies tales como una superficie de diamante, un CH ₃ monocapa -placas, montado y bicapas lipídicas. Estas interfaces tienen proven ser buenas referencias y ejemplos.

Protocolo

NOTA: Consulte la Figura 2 para una visión general del flujo del proceso que comprende la preparación, las medidas de adquisición de datos y análisis de datos.

1. Reactivo de instalación

NOTA: Todos los productos químicos deben ser manejados con cuidado, y por lo tanto una bata de laboratorio, se deben usar guantes y protección para los ojos. Todas las operaciones deben realizarse en una campana de laboratorio. En particular, guantes especiales deben ser usados ​​en caso de uso cloroformo.

1. Utilice productos químicos con bajo contenido de agua como el cloroformo seco rápidamente y almacenar en seco, pero no más de una semana. Almacenar tanto los productos químicos a -20 ° C y bajo gas nitrógeno o argón porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (véase la Tabla 1) y PEG (polietilenglicol) son higroscópicos y PEG está sujeta a la oxidación en el aire.
2. Para evitar la exposición frecuente de las existencias al oxígeno atmosférico y la humedad, preparar alícuotas más pequeñas, idealmente dentro de un sistema guantera con un atmosphe nitrógenore.

2. Equipo de instalación

NOTA: Para evitar una posible contaminación cruzada, utilice vasos fresca y limpia para cada paso.

1. Cristalería limpia y pinzas en una solución de detergente durante 30 minutos en un baño de ultrasonidos a 60 ° C.
2. Enjuague y equipos sonicado desde el paso 2.1 dos veces a fondo con agua ultrapura.
3. Equipos de calor desde el paso 2.1 en solución RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno y amoniaco (5: 1: 1)) a 75 ° C en un horno durante 45 min y posteriormente enjuagar con agua ultrapura.
4. Por último, secar el material de vidrio y pinzas bajo una corriente de nitrógeno seco o en un horno (100 ° C, 3 h).

3. Sugerencia funcionalización

NOTA: Use pinzas, vasos, etc. hecho de acero inoxidable, PTFE, vidrio o cualquier otro material que es químicamente estable en soluciones orgánicas si es aplicable. A menos que se especifique lo contrario, llevar a cabo todos los pasos en RT. La cantidad de solución de incubación necesarios depende del número de chips en voladizo. Asegúrese de que los voladizos se sumergen en las respectivas soluciones en todos los tiempos.

NOTA: Use una campana para evitar la inhalación de los vapores orgánicos.

1. Formación de grupos OH en la superficie en voladizo ("activación") (aproximadamente 0,5 horas):
   1. Use pinzas para colocar las fichas frescas en voladizo (materiales: SiN, constantes de primavera: 10 a 100 pN / nm) en un portaobjetos de vidrio limpio y los puso en una cámara de plasma (100 W).
   2. Evacuar cámara (~ 0,1 mbar).
   3. Cámara de inundación con gas oxígeno y evacuar de nuevo.
   4. Activar el proceso de plasma (potencia: 20%, duración: 15 min, presión de proceso: 0,25 mbar).
2. Amino-silanización de voladizos (aproximadamente 1 hora):
   1. Preparar los 2,5 ml de solución APTES (ver Tabla 1) en una placa de Petri de vidrio - hacer esto muy bien durante el proceso de plasma.
   2. Immediately después del proceso de plasma, sumerja cada voladizo durante 1 segundo en acetona y colóquelos inmediatamente después en la solución APTES.
   3. Incubar durante 15 min a TA.
   4. Enjuagar cuidadosamente las fichas en voladizo dos veces en 10 ml de acetona y una vez en 10 ml de cloroformo.
   5. Opcional finales paso: Virutas Place voladizo desde el paso anterior en un portaobjetos de vidrio limpio y hornear durante 30 minutos a 70 ° C. Tenga en cuenta que también hay estrategias alternativas para la activación de la superficie, por ejemplo, tratamiento UV ^12.
3. PEGilación (aproximadamente 2 horas):
   NOTA: Realizar pasos 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanización. NHS y grupos maleimida están sujetas a la hidrólisis en ambientes acuosos y la propia PEG está sujeto a la oxidación en el aire. Por lo tanto temporización (especialmente entre los pasos) es un parámetro crítico. Consulte ¹³ para más información.
   1. Preparar la solución de cloroformo (ver Tabla 1).
   2. Para evitar la condensación, Cálido PEG empolva hasta RT antes de abrir la alícuota y pesando la cantidad apropiada.
   3. Para el acoplamiento de los polímeros o lípidos con grupos amino, por separado resolver NHS-PEG-NHS (6 kDa) y metil-PEG-NHS (5 kDa) en la solución de cloroformo por agitación hasta que se disuelvan completamente. Consulte la Tabla 1 para las concentraciones.
      1. Alternativamente. para el acoplamiento de polímeros con grupos tiol resolver por separado Mal-NHS-PEG y metil-PEG-NHS en la solución de cloroformo.
   4. Mezclar las soluciones según sea necesario para ajustar una cierta relación entre el número de NHS o la maleimide- y las moléculas de PEG terminado en metilo (típicamente 1: 500). Tenga en cuenta que la proporción ideal tiene que ser determinada de forma iterativa en una serie de ciclos de preparación-experimento.
   5. Incubar las virutas en voladizo en la solución de PEG durante 1 hora en una atmósfera cloroformo saturado para evitar la evaporación del cloroformo.
4. Sonda Conjugación molécula(> 1 hora):
   NOTA: En el siguiente 3.4.1-3.4.3, se describen tres ejemplos para el acoplamiento covalente de diferentes moléculas de la sonda a la punta del AFM. Para cada molécula el protocolo tiene que ser ajustado. Nota además, que en el ejemplo 1 y 3 NHS-química se utiliza mientras que en el ejemplo 2 el tiol funcionalizado polímero PI- g -PS está acoplado a la PEG-maleimida a través de la química. Para más detalles ver ^14.
   1. Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
      1. Disolver el politirosina conjugado molécula sonda en 1 M NaOH. Ajustar la concentración de 1 mg / ml.
      2. Cambie el NaOH para tampón de borato de sodio (pH 8,1) utilizando columnas de desalación giro (7 kDa MWCO) inmediatamente antes de la funcionalización
      3. Enjuagar los voladizos primero con 5 ml de cloroformo, después con 5 ml de etanol y finalmente con 5 ml de tampón de borato.
      4. Incubar las fichas en voladizo durante 1 hora en la solución tampón de borato politirosina y luego enjuague con tampón de boratoy agua ultrapura. Almacene en agua ultrapura hasta que la medición.
   2. Para los polímeros con un esqueleto lineal (poliisopreno, 119 kDa) que tienen cadenas laterales injertadas (poliestireno, 88 kDa) ¹⁴
      1. Se disuelve el PI g-PS en cloroformo seco. Ajustar la concentración de la solución de la conjugación a 4 mg / ml.
      2. Enjuagar los voladizos con 5 ml de cloroformo y se incuba durante al menos 1 hr en la solución de conjugación.
      3. Enjuague de nuevo en 5 ml de cloroformo y almacenar en cloroformo en un entorno de cloroformo-saturado (para evitar la evaporación de cloroformo) hasta que la medición.
   3. Para el Papa lípidos
      1. Disolver PAPA en cloroformo seco. Ajustar la concentración de 20 mM.
      2. Enjuagar los voladizos con 5 ml de etanol y 5 ml de agua ultrapura antes de la incubación de los voladizos de 1 hr en la solución de lípidos.
      3. Después de la incubación, enjuague voladizos con 5 ml de cloroformo, 5 ml de etanol y 5 ml de agua tibia y ultrapura (en este orden) para eliminar las moléculas de sonda sin unir y para deshacerse de los residuos de cloroformo. Utilice consejos funcionalizados inmediatamente. Alternativamente, guárdelos en cloroformo hasta que se necesite.

Figura 1. (A) Esquema que muestra el proceso de funcionalización punta utilizando el ejemplo de la química NHS. De conexión (B) Química empleado para unir una molécula de sonda a la punta a través de un grupo amino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Preparación 4. Superficie

1. Autoensamblada monocapa (SAM)
   NOTA: Como superficie para el primer ejemplo, se eligió una capa monomolecular auto-ensamblada. Consulte la literatura ¹⁵
2. Portaobjetos de vidrio limpios con una solución de detergente y luego dos veces en agua ultrapura en un baño ultrasónico durante 30 minutos cada uno. Entonces, como un paso adicional de limpieza, colóquelos en la solución RCA (véase el paso 2.3) a 75 ° C durante 15 minutos.
3. Cubra las diapositivas con 10 níquel cromo nm y 100 nm de oro en un dispositivo de recubrimiento de vacío. Entonces almacenar en la nevera y limpio de nuevo en la solución de RCA directamente antes de la siguiente etapa.
4. Incubar las diapositivas de la etapa anterior en solución 2 mM 1-dodecanthiol / etanol durante 12 h. Los grupos tiol se unen a la superficie de oro y una auto monocapa hidrófobo ensambla. Enjuagar los portaobjetos con etanol y agua ultrapura y luego seca mediante una corriente de gas nitrógeno. Confirmar la hidrofobicidad de la superficie preparada con las mediciones de ángulo de contacto estático en un goniómetro con una cámara CCD ^10.

Hidrógeno diamante terminado
NOTA: Como una superficie para el segundo ejemplo, se eligió un diamante terminado hidrógeno. La preparación de la superficie se realizó como se ha descrito previamente ^16.

Apoyado bicapa lipídica
NOTA: En el último ejemplo, se usó una superficie soportada bicapa lipídica (SLB) como una superficie. Para obtener una superficie tal, una solución (0,1 mg / ml) de las vesículas unilamelares grandes (LUVs) consistentes en la POPC fosfolípido se formaron por el método de extrusión. A continuación, 50 l de la solución LUV fueron puestos en una hoja de mica recién escindido (A = 1 cm²) y se incubaron durante 30 min. Finalmente la solución se lavó con 20 ml de agua ultrapura. Ver ^17,18 para una descripción detallada de la preparación de SLBS.

5. Adquisición de Datos

NOTA: Para los experimentos, utilizar un AFM, que proporciona la capacidad de medir en líquidos. Los procedimientos de adquisición de datos y análisis de datos son aplicables independientemente del modelo utilizado AFM. Además, en algunos experimentos que es ventajoso tener la posibilidad de controlar la temperature dentro de la célula líquida. Deflexión Cantilever se detectó mediante el método de desviación del rayo láser ^19. Constantes de resorte se determinaron con el método de ruido térmico ^20.

1. Introduce el voladizo funcionalizado en un soporte en voladizo AFM que es adecuado para medir en los fluidos.
2. Ponga la superficie (preparación véase arriba) para tomar muestras en el AFM y cubrir con líquido. Ambos, de consola y la superficie ahora deben sumergirse en el líquido con la punta en voladizo que apunta hacia la superficie. Tenga en cuenta que en muchos casos una gota de líquido es suficiente. En cualquier caso la evaporación del fluido debe ser evitado, por ejemplo, mediante el uso de una célula de fluido cerrada.
3. Si procede, ajustar la temperatura deseada en el controlador.
4. Deje que el sistema se equilibre durante al menos media hora.
5. Registrar un espectro de ruido térmico del voladizo con el voladizo lejos de la superficie a fin de excluir cualquier superficie efectos de amortiguación. Tenga en cuenta que por lo general 10 o más espectros tienen que ser acumulada para obtener una relación suficiente de señal a ruido.
6. Acércate a la superficie. Tenga en cuenta que con el fin de conservar la geometría de la punta y la punta funcionalización el proceso de enfoque tiene que ser llevado a cabo cuidadosamente. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, se aproxima en modo de contacto intermitente.
7. Determinar la sensibilidad óptica inversa palanca (InvOLS) medida en nm / voltios. Para ello, empujando la punta en voladizo contra una superficie dura.
   1. Determinar los InvOLS mediante la medición de la pendiente de la distancia de recorrido piezo vs. el cambio en la tensión de fotodiodo. Se ajusta una línea a la parte de la curva de fuerza-distancia donde la punta en voladizo está en contacto con la superficie. En experimentos con una superficie blanda como bicapas lipídicas, llevar a cabo este paso en las zonas que no están cubiertas con una bicapa lipídica ("puntos de defectos ').
8. Determinar la constante de resorte (pN / nm) mediante el ajuste de un oscilador armónico con el espectro de ruido térmico. Usofunción de software automatizado para la determinación de la constante de muelle; o consulte la literatura ^20.
9. Inicie el experimento.
   1. Curvas numerosa fuerza Récord de distancia en cada condición experimental. Por lo general, utilice los siguientes valores para los parámetros experimentales: Frecuencia de muestreo de 5 kHz, la velocidad punta de 1 m / seg, retraer distancia de 1 m.
      NOTA: A veces, dependiendo de la dinámica del experimento estudiado, podría ser necesario esperar una cierta cantidad de tiempo con la punta en contacto con la superficie ("tiempo de permanencia ').
      NOTA: El experimento parámetros específicos puede desviarse sustancialmente de los valores indicados anteriormente.
   2. Durante las mediciones a largo plazo, cero la posición del láser en el fotodiodo de vez en cuando por el reposicionamiento del fotodiodo.
   3. Opcional: Después de cada curva de la fuerza, la ubicación de la AFM-punta a otra posición xy.
   4. Al final del experimento, determinar la sensibilidad y el resorte CONSTAnt de nuevo para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema.
      NOTA: La comparación de la constante de resorte y la sensibilidad antes y después del experimento es también un medio para asegurar que las propiedades del sistema y de las propiedades de la punta se mantuvo sin cambios en el transcurso del experimento. Si la diferencia de las constantes de resorte no es demasiado grande (<= 15%), que se pueden promediar, ya que la incertidumbre intrínseca de la determinación de la constante de muelle es también alrededor de 15%. Para las diferencias más grandes, es aconsejable encontrar primero y eliminar la causa para el cambio constante aparente de primavera antes de continuar con otros experimentos.

6. Preparación de datos

NOTA: En esta sección general de los pasos de preparación de datos que se realizan normalmente independiente del tipo específico de experimento para convertir las unidades de Newton y nanómetro, así como para corregir los datos se describen. Los análisis de datos específicos experimento se briefly describe más adelante en la respectiva sección de ejemplo representativo.

1. Típicamente, llevar a cabo toda la preparación y análisis de datos los pasos automáticamente mediante un algoritmo de casa-escrita, por ejemplo, basado en el software IGOR Pro 6.
2. Convertir la señal de deflexión prima (DEFL) [V] en vigor multiplicándolo con los InvOLS [nm / V] y la constante elástica [nN / nm].
3. Offset la fuerza de tal manera que la fuerza sobre el voladizo en una distancia suficiente desde la superficie (en voladizo sin carga) se convierte en 0 nN.
4. Calcular la posición de la punta real (también llamado de separación cuando se mide con relación a la superficie) * z, que toma la flexión del voladizo en cuenta:
   
5. Offset z * de una manera tal que z * = 0 corresponde a la posición z de la superficie.
   NOTA: Aquí, F es la fuerza que actúa sobre la punta y por lo tanto dobladaEs el voladizo (determinado en el paso 6.2.), z es la posición z-sensor de medición (directa dada por el instrumento) y k representa la constante del resorte (determinado en el paso 5.8).

Figura 2. Proceso de diagrama de flujo que muestra la preparación de la muestra, la adquisición de datos y el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

En lo siguiente, los resultados para el ejemplo de arriba describen moléculas, a saber, la politirosina polímeros de poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido, se presentan. En primer lugar para cada ejemplo, experimentar detalles específicos de adquisición de datos y preparación de datos se proporcionan. A continuación, se muestran los resultados ejemplares para experimentos en los que estas moléculas se desorbe de diferentes superficies (CH ₃ -SAMs, hidrógeno terminado ...

Discusión

Durante las últimas décadas, los experimentos de una sola molécula han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y que resultó ser un enfoque muy valiosa en ciencias de la vida y más allá. Para lograr buenas estadísticas y significativas de los experimentos SMFS, idealmente una y la misma molécula se utiliza en todo el curso del experimento. En contraste con los experimentos con conjuntos de moléculas, los experimentos SMFS son capaces de detectar eventos raros y estados moleculares ocul...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales
Concentrado líquido alcalino Hellmanex III (solución detergente)	Hellma
RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno (35%), amoníaco (32%); 5:1:1(v/v/v))Sigma
Vectabond reactivo / APTES (3-Aminopropil)trietoxisilano	Vectorlabs
seca (< 50 ppm H< sub>2O)	Sigma
Cloroformo seco (> 99.9%)	Sigma
Trietilamina	Sigma
Agua ultrapura	Biochrom, Alemania
Tetraborato de sodio (>  99.5%)	Biochrom, Alemania
Ácido Bórico	Biochrom, Alemania
Monofuncional &alfa;-metoxi-ω-NHS PEG, 5 kDa, " metil-PEG-NHS"	Rapp, Alemania
Heterobifuncional α,ω-bis-NHS PEG, 6  kDa, " NHS-PEG-NHS"	Rapp, Alemania
Heterobifuncional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, " Mal-PEG-NHS"	Rapp, Alemania
Molécula de sonda (polímero, lípido, etc.)
Equipment
Cantidad suficiente de placas de cristalización de vidrio con boquilla (10  ml), placas de Petri de vidrio (500 y micro; l) y tapas de vidrio	VWR International GmbH, Alemania
[header]
Horno de laboratorio modelo UF30	Memmert, Alemania
Sonicador de temperatura controlada	VWR International GmbH, Alemania
Sistema de plasma "Femto", 100 W	Diener, Alemania
Una jeringa de vidrio separada para cada disolvente orgánico	VWR International GmbH, Alemania
Vortex mezclador	VWR International GmbH, Alemania
Tubos de microcentrífuga (0,5 ml o 1,5 ml)	Pipetas Eppendorf
: 10-100 y micro; l, 50-200 y micro; l y 100-1.000  y micro; l	Eppendorf
AFM con celda de fluido controlada por temperatura ( p. ej., MFP-3D con BioHeater)	Asylulm Research, Santa Bárbara
Voladizos de SiN blando, típicamente hechos de nitruro de silicio (SiN) (constante de resorte inferior a 100 pN/nm, por ejemplo MLCT)	Bruker AXS, Santa Bárbara