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Artículo de método

Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra

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DOI:

10.3791/52460

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17 de febrero de 2015

 , 
1Cardiovascular Research Institute, University of California

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un método para crear una lesión mecánica en un vaso en embriones de pez cebra. Este modelo de lesión proporciona una plataforma para estudiar la hemostasia, la inflamación relacionada con la lesión y la cicatrización de heridas en un organismo ideal para la microscopía en tiempo real.

Resumen

Los embriones de pez cebra (Danio rerio) han demostrado ser un poderoso modelo para estudiar una variedad de procesos de desarrollo y enfermedades. El desarrollo externo y la transparencia óptica hacen que estos embriones sean especialmente susceptibles a la microscopía, y se dispone de numerosas líneas transgénicas que etiquetan tipos específicos de células con proteínas fluorescentes, lo que convierte al embrión de pez cebra en un sistema ideal para visualizar la interacción de los tipos de células vasculares, hematopoyéticas y de otro tipo durante la lesión y la reparación in vivo. La genética directa e inversa en el pez cebra está bien desarrollada y es posible la manipulación farmacológica. Describimos un modelo de lesión vascular mecánica utilizando técnicas de micromanipulación que explota varias de estas características para estudiar las respuestas a la lesión vascular, incluyendo la hemostasia y la reparación de vasos sanguíneos. Utilizando una combinación de microscopía de video y timelapse, demostramos que este método de lesión vascular da como resultado respuestas medibles y reproducibles durante la hemostasia y la reparación de heridas. Este método proporciona un sistema para estudiar la lesión vascular y la reparación en detalle en un modelo animal completo.

Introducción

pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar una variedad de temas en biología vascular, incluyendo el desarrollo vascular, la angiogénesis y el desarrollo y patología hematopoyética1-3. Los embriones desarrollan una circulación funcional, así como leucocitos y otros componentes del sistema inmune innato 1 día después de la fertilización (dpf) 1,4,5. La conservación de la respuesta inflamatoria y leucocitaria a la lesión ha convertido al embrión de pez cebra en un modelo informativo para procesos inflamatorios tan diversos como la infección tuberculosa, la enterocolitis y la regeneraciónde tejidos 6-9. Los embriones de pez cebra se han utilizado para estudiar la inflamación relacionada con lesiones, particularmente en el contexto de la herida epitelial y la respuesta de los neutrófilos10,11. La lesión del embrión da lugar a una respuesta celular altamente conservada de las células en el sitio de la lesión y de las células inmunitarias innatas reclutadas para responder a la lesión y regular su resolución11,12. Otros modelos de lesiones han utilizado pulsos láser enfocados para localizar espacialmente la lesión en tipos específicos de células, incluidas las neuronas, las células musculares y los cardiomiocitos13-15.

Los embriones de pez cebra se han utilizado como modelo para estudiar la hemostasia y la trombosis en condiciones de manipulación farmacológica y genética, utilizando la formación de trombos tanto mecánicos como inducidos por láser16-19. Los componentes de la cascada de coagulación parecen estar bien conservados y los transgénicos han permitido estudios detallados de la deposición de trombocitos y fibrina en el sitio de coagulación17,20,21. El procedimiento presentado en este artículo complementa estos métodos al proporcionar un sistema para estudiar las lesiones mecánicas de los vasos que resultan en la ruptura del vaso, la formación y resolución de trombos y la reparación de los vasos.

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Protocolo

NOTA: Procedimientos utilizando el pez cebra fueron aprobados por Institutional Animal Care de UCSF y el empleo.

1. Preparación de Herramientas

  1. Inserte el pasador de minucias en un soporte de pasador y sujete el pasador.
  2. Con unas pinzas de punta fina, doble cuidadosamente la punta del pasador para crear un ligero gancho.
  3. Para la manipulación y la estabilización del embrión durante la lesión, doblar el extremo de un calibre 28 ½ pulgadas aguja montada en una jeringa de insulina con unos alicates de punta fina.

2. Preparación de embriones de pez cebra para Lesiones

  1. Configure parejas reproductoras de pez cebra y recoger los huevos en el agua de huevo (sales acuario 60ug / mL) como se muestra previamente 22.
  2. Añadir 0,003% N-feniltiourea (PTU) al agua de huevo cuando los embriones son aproximadamente 8 horas después de la fecundación (HPF) para evitar melanization.
  3. Dechorionate dos día después de la fertilización (dpf), los embriones antes del experimento utilizando unas pinzas de punta fina.
    NOTA: Los embriones se pueden lesionar en cualquier momento después de que comience la circulación. Los datos presentados aquí es para 2 dpf embriones, pero la técnica se ha aplicado con éxito en embriones hasta 5 dpf.
  4. Anestesiar a los embriones con 0,02% tamponada de ácido 3-aminobenzoico (tricaína) aproximadamente 10 minutos antes de las manipulaciones.

3. Recipiente Mecánica Lesión de embriones

  1. Transferencia de embriones anestesiados a una diapositiva depresión en un microscopio estereoscópico de disección utilizando una pipeta de transferencia.
  2. Usando el lado plano corto de la aguja de la jeringa para manipular el embrión con la mano dominante, posicionar el embrión en su lado con la superficie ventral de espaldas a la aguja.
  3. Coloque el pasador de minucias con la punta apuntando directamente contra la superficie ventral de la posterior peces a la abertura urogenital. Coloque el pasador de minucias en un ligero ángulo tal que la punta curvada es capaz de perforar a través de la peridermis directamente en la vena caudal (Figura 1 </ Strong>).
  4. Uso de la aguja de la jeringa para manipular el embrión, perforar la vena caudal con el pasador de minucias tocando el embrión en el pasador para enganchar el pasador ligeramente en la vena.
  5. Uso de la aguja de la jeringa, tire el embrión lejos de la clavija de minucias para crear un pequeño desgarro en el recipiente.
    NOTA: Una lesión éxito dará lugar a sangrado inmediato de la vena.

4. Análisis de la hemostasia

  1. Elija sólo los embriones con visiblemente células sanguíneas circulantes para este procedimiento.
  2. Preparar para iniciar el temporizador, tan pronto como el pasador de minucias se tira desde el recipiente.
  3. Inicie el temporizador tan pronto como la pérdida de sangre puede ser visualizada de la herida. Cuando la pérdida de sangre de la herida cesa, detener el cronómetro y registrar el tiempo total como el tiempo de sangrado. Si se inhibe la coagulación, registrar el tiempo para cuando hay ya no visiblemente las células sanguíneas circulantes.

5. Análisis de Curación de Heridas

  1. Pos de Transferenciaanimales camiseta de lesiones en placas de formación de imágenes de fondo de vidrio para microscopía.
  2. Eliminar la mayor parte del agua del huevo.
  3. Cubra los embriones en 0,3 a 1,2% de baja fusión de agarosa disueltos en el agua de huevo, se calentó a entre 42 y 45 ºC y suplementadas con 0.02% tricaína.
  4. Posición embriones en sus lados con fórceps.
  5. Después de la agarosa se enfría, llenar el plato con un 0,02% tricaína en agua huevo.
  6. Adquirir imágenes con campo claro, epifluorescencia, o microscopía confocal.
  7. Retire embrión de la agarosa utilizando pinzas y traslado de regreso al agua huevo.

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Resultados

Lesión de los vasos mecánica se realizó el 2 de fdd embriones (Figura 2A - C). Lesión resulta en una respuesta rápida y fiable de la coagulación como medidas por el tiempo hasta el cese de la hemorragia (Figura 2D). Para determinar si o no diferencias en la respuesta de coagulación se podrían medir, la hirudina anticoagulante se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de Cuvier inmediatamente antes de heridas (5-10 nl de 1 unidad por l hirudina disu...

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Discusión

El pez cebra se han utilizado con éxito como un modelo para diferentes tipos de heridas incluyendo lesiones láser 13-15, trombosis inducida por láser 16, y epitelial hiriendo a 10. Se presenta un método de la herida mecánico que es fácil de ejecutar y produce una lesión controlada en un modelo in vivo que es altamente susceptible a la microscopía en tiempo real. Lesión resulta en una respuesta hemostática rápido y medible y un programa de reparación de heridas reproduci...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los Dres. Stephen Wilson y Lisa Wilsbacher por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH HL054737.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Minutia PinsFine Science Tools26002-10 Diámetro depunta 0,0125 mm, diámetro de la varilla 0,1 mm
Soporte de alfileresFine Science Tools26016-12
Dumont #5 Pinzas de punta finaFine Science Tools11254-20
Corredera de depresión de vidrioAquatic Eco-SystemsM30
Low Melting AgaroseLonza 50081Precalentado a 42 º C
N-feniltiourea (PTU)Sigma AldrichP7629
Ácido 3-aminobenzoico (tricaína)Sigma AldrichE10521
HirudinSigma AldrichH7016
Platos de imagen con fondo de vidrioMattekP35G-1.5-14-C
Microscopio de disecciónOlympusSZH10
Microscopio de fluorescenciaZeissAxio Observer
Sales de acuarioJeringa
con aguja de 28,5 GBecton Dickinson 
la de insulina instantánea Ocean 329461

Referencias

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