Este artículo describe un método para crear una lesión mecánica en un vaso en embriones de pez cebra. Este modelo de lesión proporciona una plataforma para estudiar la hemostasia, la inflamación relacionada con la lesión y la cicatrización de heridas en un organismo ideal para la microscopía en tiempo real.
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Artículo de método
Lesiones Embarcaciones mecánica en embriones de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Los embriones de pez cebra (Danio rerio) han demostrado ser un poderoso modelo para estudiar una variedad de procesos de desarrollo y enfermedades. El desarrollo externo y la transparencia óptica hacen que estos embriones sean especialmente susceptibles a la microscopía, y se dispone de numerosas líneas transgénicas que etiquetan tipos específicos de células con proteínas fluorescentes, lo que convierte al embrión de pez cebra en un sistema ideal para visualizar la interacción de los tipos de células vasculares, hematopoyéticas y de otro tipo durante la lesión y la reparación in vivo. La genética directa e inversa en el pez cebra está bien desarrollada y es posible la manipulación farmacológica. Describimos un modelo de lesión vascular mecánica utilizando técnicas de micromanipulación que explota varias de estas características para estudiar las respuestas a la lesión vascular, incluyendo la hemostasia y la reparación de vasos sanguíneos. Utilizando una combinación de microscopía de video y timelapse, demostramos que este método de lesión vascular da como resultado respuestas medibles y reproducibles durante la hemostasia y la reparación de heridas. Este método proporciona un sistema para estudiar la lesión vascular y la reparación en detalle en un modelo animal completo.
Introducción
pez cebra se han utilizado ampliamente para estudiar una variedad de temas en biología vascular, incluyendo el desarrollo vascular, la angiogénesis y el desarrollo y patología hematopoyética1-3. Los embriones desarrollan una circulación funcional, así como leucocitos y otros componentes del sistema inmune innato 1 día después de la fertilización (dpf) 1,4,5. La conservación de la respuesta inflamatoria y leucocitaria a la lesión ha convertido al embrión de pez cebra en un modelo informativo para procesos inflamatorios tan diversos como la infección tuberculosa, la enterocolitis y la regeneraciónde tejidos 6-9. Los embriones de pez ceb....
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Protocolo
NOTA: Procedimientos utilizando el pez cebra fueron aprobados por Institutional Animal Care de UCSF y el empleo.
1. Preparación de Herramientas
- Inserte el pasador de minucias en un soporte de pasador y sujete el pasador.
- Con unas pinzas de punta fina, doble cuidadosamente la punta del pasador para crear un ligero gancho.
- Para la manipulación y la estabilización del embrión durante la lesión, doblar el extremo de un calibre 28 ½ pulgadas aguja montada en una jeringa de insulina con unos alicates de punta fina.
2. Preparación de embriones de pez cebra para Lesiones
- ....
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Resultados
Lesión de los vasos mecánica se realizó el 2 de fdd embriones (Figura 2A - C). Lesión resulta en una respuesta rápida y fiable de la coagulación como medidas por el tiempo hasta el cese de la hemorragia (Figura 2D). Para determinar si o no diferencias en la respuesta de coagulación se podrían medir, la hirudina anticoagulante se administró a los embriones mediante inyección en el conducto de Cuvier inmediatamente antes de heridas (5-10 nl de 1 unidad por l hirudina disu.......
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Discusión
El pez cebra se han utilizado con éxito como un modelo para diferentes tipos de heridas incluyendo lesiones láser 13-15, trombosis inducida por láser 16, y epitelial hiriendo a 10. Se presenta un método de la herida mecánico que es fácil de ejecutar y produce una lesión controlada en un modelo in vivo que es altamente susceptible a la microscopía en tiempo real. Lesión resulta en una respuesta hemostática rápido y medible y un programa de reparación de heridas reproduci.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los Dres. Stephen Wilson y Lisa Wilsbacher por sus útiles discusiones. Este trabajo fue apoyado en parte por los NIH HL054737.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 Diámetro de | punta 0,0125 mm, diámetro de la varilla 0,1 mm |
| Soporte de alfileres | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Pinzas de punta fina | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Corredera de depresión de vidrio | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Precalentado a 42 º C |
| N-feniltiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Ácido 3-aminobenzoico (tricaína) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Platos de imagen con fondo de vidrio | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Microscopio de disección | Olympus | SZH10 | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss | Axio Observer | |
| Sales de acuario | Jeringa | ||
| con aguja de 28,5 G | Becton Dickinson |
Referencias
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684(2012).
- Boatman, S., et al. Assaying hematopoiesis using zebrafish. Blood Cells Mol Dis. 51 (4), 271-276 (2013).
- Ellett, F., Lieschke, G. J.
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Reimpresiones y permisos
