Artículo de método

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

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DOI:

10.3791/52475

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19 de febrero de 2015

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1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.

Resumen

La degeneración de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (mesDA) es el sello patológico de la enfermedad de Parkinson. El estudio de los procesos biológicos implicados en las funciones fisiológicas y en la vulnerabilidad y muerte de estas neuronas es fundamental para comprender las causas subyacentes y desentrañar la cura de este trastorno neurodegenerativo común. Los cultivos primarios de neuronas mesDA proporcionan una herramienta para la investigación de las propiedades moleculares, bioquímicas y electrofisiológicas, con el fin de comprender el desarrollo, la supervivencia a largo plazo y la degeneración de estas neuronas durante el curso de la enfermedad. Aquí presentamos un método detallado para el aislamiento, cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón E12.5 (o rata E14.5). Las condiciones optimizadas de cultivo celular en este protocolo dan como resultado la presencia de proyecciones axonales y dendríticas, conexiones sinápticas y otras propiedades morfológicas neuronales, lo que hace que los cultivos sean adecuados para el estudio de las características fisiológicas, biológicas y moleculares de esta población neuronal.

Introducción

La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), el dopaminérgica línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, la línea celular híbrida de ratón dopaminérgica MN9D y mesencefálico humana LUHMES células se han utilizado para estudios mecanísticos bioquímicos y limitadas 1 -5. Para el estudio de la pérdida específica de neuronas Mesda, varios neurotoxina y basados ​​en modelos genéticos se han desarrollado 6-8. Culturas mesencéfalo ventral primaria, Proporcionar una herramienta indispensable para el estudio de las propiedades neuronales y sinápticas de las neuronas dopaminérgicas y las vías implicadas en la patogénesis de esta enfermedad común.

Aquí presentamos un protocolo detallado para el aislamiento de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que contiene modificaciones resultantes en una mayor capacidad de supervivencia y el aumento de rendimiento de cubreobjetos por embrión. El uso del mesencéfalo E12.5 ratón prematuro (E14.5 en rata) mejora la supervivencia. A esta edad las neuronas no se han desarrollado todavía los axones, lo que deja las células intactas durante la disección y minimiza el estrés aumentando así significativamente la viabilidad. Además, la disección cuidadosa del mesencéfalo ventral, como se describe en la sección 2 de este protocolo, mejora aún más la capacidad de supervivencia. Para aumentar el número de cubreobjetos por embrión, una técnica de siembra alternativa se presenta en la sección 4 de este protocolo. Esto conduce a un rendimiento de hasta 10 cubreobjetos por embrión en comparación con 4 cubreobjetos bajocondiciones de chapado estándar reduciendo así la cantidad de animales por experimento.

Las neuronas en la cultura de exposiciones consecuencia de los axones y dendritas, forman conexiones sinápticas y revelan la presencia de marcadores neuronales y sinápticas que hacen estas culturas adecuado para imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y estudios electrofisiológicos. Además, el uso de cultivos neuronales facilita la manipulación genética y farmacológica. Excrecencia de neuritas a partir del día 2 in vitro permite estudios de desarrollo. Por otra parte, la supervivencia a largo plazo de las culturas (hasta seis semanas) hace que sean adecuadas para el estudio de la degeneración progresiva y lenta de estas neuronas.

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Protocolo

NOTA: Los animales fueron mantenidos y manejados de acuerdo con las directrices institucionales y de todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Bienestar Animal del Colegio Imperial y Órgano de Examen de Ética (AWERB) y el Ministerio del Interior y la Universidad de Harvard Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), de conformidad con los reglamentos federales y estatales.

1. Reactivo y Configuración del equipo

  1. Thaw, alícuota y almacenar 1 mg / ml solución laminina a -80 ºC. Disolver 2 l en 1 ml de DMEM / F12, resultando en una concentración de recubrimiento de 1-2 g / cm 2.
    NOTA: Descongelar Laminin lentamente en hielo y se disuelve en frío DMEM / F12 y de inmediato añadir a los platos / cubreobjetos.
  2. Diluir 75 ml de 0,01% de poli-L-ornitina en 425 ml de PBS y se almacena a 4 ºC.
    NOTA: La vida útil de la solución de trabajo es de hasta un mes.
  3. Disolver 25% (p / v) de BSA en PBS, pH 7,4, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de un year.
  4. Preparar 50% de FBS (en HBSS) medios de desactivación.
  5. Preparar medio completo mediante la adición de 50 U / ml de penicilina y estreptomicina, 1x suplemento N2, 5% (vol / vol) de FBS, 0,36% D - (+) - glucosa (peso / vol), 0,25% de BSA (peso / vol) a DMEM / F12 y almacenar a 4 ºC.
    NOTA: La vida útil es de hasta 10 días.
  6. Coloque los cubreobjetos en ebullición 70% (vol / vol) de etanol durante al menos 30 min para eliminar los restos de grasa y autoclave.
  7. Coloque los cubreobjetos en placas de 24 pocillos y añadir 500 l solución de poli-L-ornitina a cada pocillo. Incubar 1 hr bajo la campana de cultivo de tejido a TA y después, lavar 3 veces con 500 l de agua. Añadir solución de laminina 500 l a cada placa y se incuba O / N en la incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 ºC.
    NOTA: Si bien no hay lavados son necesarias después del tratamiento laminina, lavar los poli-L-ornitina menos de tres veces resulta en la muerte de las células 24 h después del cultivo.
  8. Pulir las puntas de pipetas de vidrio más de gas natural o antorcha fcojo.
    NOTA: Después de este paso, el diámetro de la punta debe ser aproximadamente la mitad de su tamaño normal.
  9. Cortar las tapas de 1,5 ml tubos de microcentrífuga, utilizando una tijera autoclave y autoclave.

2. Disección de Embryonic ventral mesencéfalo

  1. Narcotizar oportuna embarazadas (E12.5) presas por inhalación de CO2 y luego practicar la eutanasia por dislocación cervical.
  2. Pulverizar el abdomen con etanol al 70% y hacer una incisión abdominal hasta los sacos uterinos están expuestos. Utilizando unas pinzas cortan la fijación vaginal y eliminar útero. Coloque el útero en HBSS enfriado en hielo, en un 100 mm placa de Petri.
  3. Retire embriones del útero y el saco amniótico, utilizando pinzas (Figura 1C). Coloque los embriones en fresco HBSS helada.
    NOTA: El rectángulo en la Figura 1D indica la ubicación del mesencéfalo ventral embrionario.
  4. Coloca los embriones bajo un microscopio de disección (10 aumentos) y diseccionar el mesencéfaloarco cortando el cerebro en el istmo y la región frontera mesencefálico-diencefálica, utilizando el bioscissor y pinzas (Figura 1E, por favor refiérase a la Figura 1A para las líneas de incisión).
  5. Después de sacar todo el cerebro medio, hacer un corte en el mesencéfalo mediodorsal (Figura 1F).
  6. Eliminar meninges, utilizando dos pinzas (Figura 1H).
    NOTA: PASO CRÍTICO: Este paso es esencial para el rendimiento óptimo neuronal y la supervivencia. Dado que las condiciones de cultivo son óptimos para las células del cerebro, la mayoría de las células del tejido circundante mueren después de la siembra y la señal apoptótica partir de este tejido puede dañar la integridad de las culturas.
  7. Acoplar el tejido del cerebro medio en la placa de Petri para observar la forma de mariposa y corte aproximadamente la mitad de cada ala, utilizando una cuchilla de afeitar esterilizada (Figura 1 H, I).
    NOTA: Figura 1J representa el mesencéfalo ventral aislado.
  8. Transferir elpieza de mesencéfalo ventral en HBSS enfriado con hielo en un tubo cónico de 15 ml y proceder con el siguiente embrión.
    NOTA: Los pasos 2.1 a 2.8 no deben tomar más de 1 hora. Mantener los embriones más allá de este marco de tiempo en hielo disminuye significativamente la viabilidad celular.

3. La disociación de las células ventral mesencéfalo

  1. La transferencia de los trozos de cerebro medio ventral bajo una campana de flujo laminar. Retire la HBSS y añadir 1 ml precalentado (37 ºC) 0,05% de tripsina-EDTA en el tubo cónico (volúmenes suficientes para un máximo de 12 piezas de mesencéfalo ventral). Incubar el tejido a 37 ºC durante 5-10 minutos.
  2. Eliminar tripsina-EDTA bajo el capó y se añade medio de la activación de-1 ml (el suero se desactivará tripsina) para el tejido.
  3. Retire el medio de desactivación y lavar el tejido en 1 ml de medio completo dos veces.
    NOTA: evitar la eliminación de todo el medio del tubo y pipetear el tejido, para evitar desechar las células disociadas.
  4. Añadir 1 ml de medio completo y triturato el tejido con una pipeta de vidrio pulida al fuego. Evitar la formación de burbujas y seguir triturando hasta que se logre la suspensión de células individuales.
    NOTA: Por lo general, 8-10 pasa por la punta restringido son necesarios para la disociación completa.
  5. Centrifugar las células a 400 xg durante 5 min a temperatura ambiente y eliminar el medio.
  6. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio completo por lentamente la pipeta hacia arriba y hacia abajo para un máximo de cuatro veces.

4. Las células Chapado ventral mesencéfalo

  1. Mezclar 10 l de la suspensión celular con 90 l solución de azul de tripano y contar el número de células con un hemocitómetro.
    NOTA: La viabilidad de las células también se puede comprobar en esta etapa.
  2. Coloque tapas de los tubos de microcentrífuga esterilizado en 100 mm placas de Petri y transferir los / laminina cubreobjetos recubiertos de poli-L-ornitina, utilizando fórceps, uno a la vez en la parte superior de las tapas.
    NOTA: No lave los cubreobjetos y evitar el secado de la laminina, ya que esto puede causar UNEVEculturas n y disminución de la supervivencia de las células.
  3. Ajustar el volumen a 1500 células por 1 l mediante la adición de medio completo y añadir 100 l (un total de 150.000 células) de la suspensión celular en la parte superior de cada cubreobjetos (el volumen es óptimo para cubrir la superficie del cubreobjetos sin derrames). Cierre las placas de Petri y se incuba durante 1 hr ellos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado (37 ° C, 5% de CO 2).
    NOTA: PASO CRITICAL: Este paso es necesario para mejorar la unión y viabilidad de las células y para aumentar el número de cubreobjetos por embrión. Alternativamente, las células se pueden transferir directamente a los pozos (que contienen cubreobjetos), pero el número de células se debe aumentar a 350 mil por pozo (en lugar de 150.000). En otras palabras, utilizando este método, 8-10 cubreobjetos se pueden adquirir, mientras que la transferencia directa produce unos 3-4 cubreobjetos a causa de las células, que se unen a las placas (al lado o debajo de los cubreobjetos). El viabili promedioTy de los cultivos, utilizando este método fue de alrededor de 90%.

5. Crecimiento y Mantenimiento Cultura

  1. Después de 1 hora de incubación, transferir cuidadosamente el cubreobjetos incluyendo el medio en placas de 24 pocillos, que contiene 400 l de medio completo precalentado (a 37 ºC) (volumen total: 500 l). Se incuban las células O / N a 37 ºC.
  2. Dentro de 24 horas después de la incubación de los pocillos, añadir suavemente medio completo 500 l en cada pocillo.
    NOTA: Las primeras horas es la etapa más crítica para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas y el número de células supervivientes no cambia significativamente más allá de este punto.
  3. No agregue soportes adicionales a las culturas de las dos primeras semanas o hasta que el medio se convierte en amarilla. Si el cultivo durante más de dos semanas o cambios de color medio a amarillo, cambio de la mitad de los medios de comunicación (500 l) con frescos completas medios pre-calentado (normalmente cada dos semanas).
    NOTA: Las neuronas dopaminérgicas dentro de laculturas sobrevivirían durante más de 6 semanas bajo estas condiciones.

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Resultados

La inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) muestra que entre 0,5-1% de las células en cultivo son dopaminérgica. Proyecciones neuronales aparecen dentro de 2 horas después de la siembra y antes del primer día, los axones y dendritas son distinguibles (Figura 2), utilizando proteína 2 (Map2) anticuerpos asociada a los microtúbulos (Figura 3) tirosina hidroxilasa (TH) y. Las neuronas a sobrevivir durante más de seis semanas y muestran una amplia extensión. La relación neuro...

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Discusión

Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) 10, 11. Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y alteració...

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Divulgaciones

No se declara ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo se realizó utilizando los fondos de la División de Ciencias del Cerebro, Departamento de Medicina, Imperial College London para K.N.A.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco's Mezcla de nutrientes medio Eagle modificada F-12Invitrogen11330
Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS) (1X), líquidaInvitrogen24020-117
Suero fetal bovino, inactivado por calor (FBS)Invitrogen16140
N2 Suplemento (100X), líquidoInvitrogen17502-048
D-(+)-Glucosa solución (45% (peso/vol) en aguaSigmaG8769
Albúmina sérica bovina BSASigmaA9430
de Engelbreth-Holm-Swarm membrana basal para sarcoma murinoSigmaL2020
Penicilina/estreptomicinaInvitrogen15070
Tripsina (0,05% (peso/vol)Invitrogen25300
Suero bovino cultivo celular de albúmina (BSA) probadoSigma A9418
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SigmaP3813
Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (Th)Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
Poli-L-ornitina, solución al 0,01%SigmaP4957
Anticuerpo Anti-Map2 (proteína-2A y -2B asociada a microtúbulos)MilliporeMAB3418
anti-Sinapsina-1Millipore AB1543P
Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG    anticuerpoSondas molecularesA-21206
Alexa Fluor 594 burro anti-conejo IgG    anticuerpoSondas molecularesA-21207
Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas IgG    anticuerpoSondas molecularesA-11015
Alexa Fluor 594 burro anti-ovejas IgG    anticuerpoSondas molecularesA-11016
Alexa Fluor 594 burro anti-ratón IgG    anticuerpoSondas molecularesA-21203
Solución de azul de tripano (0,4% (peso/vol))Biowhittaker17-942E
Microscopio estereoscópicoCarl ZeissStemi 2000-C
Microscopio de contraste de fase invertidaCarl ZeissAxiovert 40 C
Pinzas DumontFine Scientific ToolsMay-45
Pinzas deslizantes – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
Dos pinzas Dumont #45 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
Portacuchillas/Rompedor Empuñadura Plana - 11cmFine Scientific Tools10052-11
Tijeras de Iris para Estudiantes - Rectas 11,5 cmFine Scientific Tools91460-11
Iluminador halógeno de fibra ópticaNikonMKII
Desechable Vidrio de borosilicato Pasteur Pipetas Fisherbrand13-678-20C
HemocitómetroProscitechSVZ2NIOU
0.2 y micro; m unidades de filtro estérilNalgeneNL-CE-156-4020
100x20 mm Placas de PetriBD Biosciences351005
Cubreobjetos redondos #1 Espesor Vidrio alemán 12 mmBellco Glass1943-10012 

Referencias

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