Las causas de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo durante la enfermedad de Parkinson no se comprenden completamente. Los sistemas de cultivo celular proporcionan una herramienta esencial para el estudio de las propiedades neurofisiológicas de estas neuronas. Aquí presentamos un protocolo optimizado, que se puede utilizar para el modelado in vitro de la neurodegeneración.
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Artículo de método
Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores
En este artículo
Resumen
Resumen
La degeneración de las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas (mesDA) es el sello patológico de la enfermedad de Parkinson. El estudio de los procesos biológicos implicados en las funciones fisiológicas y en la vulnerabilidad y muerte de estas neuronas es fundamental para comprender las causas subyacentes y desentrañar la cura de este trastorno neurodegenerativo común. Los cultivos primarios de neuronas mesDA proporcionan una herramienta para la investigación de las propiedades moleculares, bioquímicas y electrofisiológicas, con el fin de comprender el desarrollo, la supervivencia a largo plazo y la degeneración de estas neuronas durante el curso de la enfermedad. Aquí presentamos un método detallado para el aislamiento, cultivo y mantenimiento de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo de embriones de ratón E12.5 (o rata E14.5). Las condiciones optimizadas de cultivo celular en este protocolo dan como resultado la presencia de proyecciones axonales y dendríticas, conexiones sinápticas y otras propiedades morfológicas neuronales, lo que hace que los cultivos sean adecuados para el estudio de las características fisiológicas, biológicas y moleculares de esta población neuronal.
Introducción
La pérdida de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta conduce a los síntomas motores cardinal de la enfermedad de Parkinson (PD), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente. La causa subyacente de la desaparición de esta población neuronal mesencephalic no se conoce. Para el estudio de las vías bioquímicas responsables del desarrollo y la modulación de las propiedades neurofisiológicas y la supervivencia de las neuronas Mesda, varios de cultivo de células y sistemas de modelos animales se han utilizado. Las líneas celulares inmortalizadas, incluyendo la línea celular de rata dopaminérgica 1RB 3 AN 27 (N27), el dopam....
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Protocolo
NOTA: Los animales fueron mantenidos y manejados de acuerdo con las directrices institucionales y de todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Bienestar Animal del Colegio Imperial y Órgano de Examen de Ética (AWERB) y el Ministerio del Interior y la Universidad de Harvard Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC), de conformidad con los reglamentos federales y estatales.
1. Reactivo y Configuración del equipo
- Thaw, alícuota y almacenar 1 mg / ml solución laminina a -80 ºC. Disolver 2 l en 1 ml de DMEM / F12, resultando en una concentración de recubrimiento de 1-2 g / cm 2.
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Resultados
La inmunohistoquímica contra la tirosina hidroxilasa (TH) muestra que entre 0,5-1% de las células en cultivo son dopaminérgica. Proyecciones neuronales aparecen dentro de 2 horas después de la siembra y antes del primer día, los axones y dendritas son distinguibles (Figura 2), utilizando proteína 2 (Map2) anticuerpos asociada a los microtúbulos (Figura 3) tirosina hidroxilasa (TH) y. Las neuronas a sobrevivir durante más de seis semanas y muestran una amplia extensión. La relación neuro.......
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Discusión
Las neuronas dopaminérgicas en el mesencéfalo son la principal fuente de dopamina en el sistema nervioso central. Se dividen en tres grupos, sustancia negra pars compacta (SNpc), el área ventral tegmental (VTA) y el campo retrorubral (FRR) 10, 11. Las neuronas SNpc VTA y dan lugar a importantes vías dopaminérgicas, mesocorticales, mesolímbico y nigro-estriado, que participan en funciones como el control de las emociones, la motivación y el comportamiento motor. Desaparición de las neuronas en SNpc y alteració.......
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Divulgaciones
No se declara ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo se realizó utilizando los fondos de la División de Ciencias del Cerebro, Departamento de Medicina, Imperial College London para K.N.A.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Mezcla de nutrientes medio Eagle modificada F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS) (1X), líquida | Invitrogen | 24020-117 | |
| Suero fetal bovino, inactivado por calor (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Suplemento (100X), líquido | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucosa solución (45% (peso/vol) en agua | Sigma | G8769 | |
| Albúmina sérica bovina BSA | Sigma | A9430 | |
| de Engelbreth-Holm-Swarm membrana basal para sarcoma murino | Sigma | L2020 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen | 15070 | |
| Tripsina (0,05% (peso/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Suero bovino cultivo celular de albúmina (BSA) probado | Sigma | A9418 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa (Th) | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poli-L-ornitina, solución al 0,01% | Sigma | P4957 | |
| Anticuerpo Anti-Map2 (proteína-2A y -2B asociada a microtúbulos) | Millipore | MAB3418 | |
| anti-Sinapsina-1 | Millipore AB1543P | ||
| Alexa Fluor 488 burro anti-conejo IgG anticuerpo | Sondas moleculares | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-conejo IgG anticuerpo | Sondas moleculares | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 burro anti-ovejas IgG anticuerpo | Sondas moleculares | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-ovejas IgG anticuerpo | Sondas moleculares | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 burro anti-ratón IgG anticuerpo | Sondas moleculares | A-21203 | |
| Solución de azul de tripano (0,4% (peso/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Microscopio estereoscópico | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Microscopio de contraste de fase invertida | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Pinzas Dumont | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Pinzas deslizantes – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Dos pinzas Dumont #45 – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Portacuchillas/Rompedor Empuñadura Plana - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Tijeras de Iris para Estudiantes - Rectas 11,5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Iluminador halógeno de fibra óptica | Nikon | MKII | |
| Desechable Vidrio de borosilicato Pasteur Pipetas Fisherbrand | 13-678-20C | ||
| Hemocitómetro | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 y micro; m unidades de filtro estéril | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Placas de Petri | BD Biosciences | 351005 | |
| Cubreobjetos redondos #1 Espesor Vidrio alemán 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
Referencias
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P.
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Reimpresiones y permisos
