Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.
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Artículo de método
Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las imágenes multifotónicas en tiempo real ofrecen una gran oportunidad para estudiar el tráfico celular y las interacciones entre células en su entorno fisiológico tridimensional. Las actividades biológicas de las células inmunitarias dependen principalmente de su capacidad de motilidad. Los monocitos sanguíneos tienen una vida media corta en el torrente sanguíneo; Se originan en la médula ósea y se liberan constitutivamente de ella. En la afección inflamatoria, este proceso se intensifica, lo que conduce a la monocitosis sanguínea y la posterior infiltración de los tejidos inflamatorios periféricos. La identificación de los eventos biomecánicos que controlan el tráfico de monocitos desde la médula ósea hacia la red vascular es un paso importante para comprender la relevancia fisiopatológica de los monocitos. Realizamos imágenes de lapso de tiempo in vivo mediante microscopía de dos fotones de la médula ósea del cráneo del ratón Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). El ratón MacBlue expresa la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) bajo el control de un promotor mieloide específico 1, en combinación con el marcaje de la red vascular. Describimos cómo este enfoque permite el seguimiento de monocitos medulares individuales en tiempo real para cuantificar aún más el comportamiento migratorio dentro del parénquima de la médula ósea y la vasculatura, así como las interacciones célula a célula. Este enfoque proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los subconjuntos de monocitos de la médula ósea y permite abordar aún más cómo se puede influir en estas células en condiciones patológicas específicas.
Introducción
La médula ósea desempeña un papel central en la hematopoyesis y representa el principal reservorio de monocitos que recirculan constitutivamente entre la sangre y el parénquima medular, renuevan el conjunto de monocitos circulantes con una vida corta 2,3 y participan en la reconstitución de los tejidos-macrófagos y células dendríticas en estado estacionario 4. Durante la inflamación o después de una aplasia transitoria, los monocitos se movilizan activamente desde la médula ósea o el bazo 5, 6, 7 y colonizan los órganos inflamados. Varios ejes quimioatrayentes han estado involucrados en el proceso de movilización de células ....
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Protocolo
NOTA: Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal y Ética francés y validados por el "Servicio de Protección et Santé Animales, Environnement" con el número A-75 hasta 2065. Los tamaños de muestra se eligen para asegurar la reproducibilidad de los experimentos, y de acuerdo con el 3R de la regulación ética animal.
1. Preparación del ratón
- Anestesia
- Para corto período de formación de imágenes (menos de 1 hr), anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal de 200 l de una solución salina que contiene ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
- A....
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Resultados
La estructura del cráneo del ratón ofrece una buena oportunidad para estudiar la fisiología de la médula ósea por intravital de imágenes. El hueso ser delgado alrededor de la zona frontal parietal, es posible obtener acceso a nichos medulares sin abrasión del hueso. La figura 1 representa un amplio campo 2D del cráneo de un ratón transgénico MacBlue. La matriz ósea está compuesta principalmente de colágeno I fácilmente detectable por SHG 19. La inyección de rodamina-dextrano tiñe la red vascu.......
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Discusión
Los puntos críticos de la metodología de formación de imágenes en vivo son para asegurar la estabilidad del foco a fin de maximizar la duración de la formación de imágenes y para reducir al mínimo el riesgo de contaminación bacteriana y la inflamación, lo que podría afectar la dinámica de las células inflamatorias. Imaging del hueso del cráneo ósea sigue estos objetivos como la cirugía realizada para obtener acceso a la médula ósea es mínima. El uso de material estéril y antisépticos es esencial para lim.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Anne Daron y Pierre Louis Loyher para asistencia editorial, la Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) para obtener ayuda con el microscopio de dos fotones y el Fondo para el animal "NAC" y Camille Baudesson para los ratones que se reproducen asistencia. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud del acuerdo de subvención n ° 304810 - RAID, y n ° 241440-Endostem, del Inserm, de la Université Pierre et Marie Curie "Emergence ", de la" Ligue contre le cancer ", de" Asociación para la Investigación sobre el Cáncer le "y de la" A....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anestésico | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anestésico | |
| Isofluran | Baxter | 2,5%, anestésico | |
| O2/NO2 | 70/30 mezcla, anestésico | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Tinción vascular | |
| Ly6G-PE | de Becton-Dickinson | 1A8, tinción de neutrófilos | |
| Soporte estereotáctico Cirugía | casera | ||
| Etanol 70% | cirugía | ||
| Cirugía de tijeras y pinzas | |||
| Anillo | de 18 mm de diámetro, cirugía | ||
| Glubran 2 | Queryo Médico | Quirúrgico Pegamento, fijación de anillo de goma | |
| Agujas de calibre pequeño | Cirugía Terumo | ||
| Zeiss LSM 710 NLO Microscopio multifotónico | Carl Zeiss | Microscopio | |
| zafiro | Coherente Chameleon Ultra | 140 fsec pulsos de luz NIR | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | plano de bits | , seguimiento automático 3D | |
| PBS 1X | D. Cirugía Dutscher | ||
| Cámara termostatizada | Carl Zeiss | Imágenes intravitales |
Referencias
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I.
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Reimpresiones y permisos
