Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos En Vivo

Resumen

Los monocitos son reguladores clave de la inmunidad innata y desempeñan un papel crítico en la renovación del sistema fagocítico mononuclear periférico y en caso de inflamación. Este manuscrito describe el procedimiento de obtención de imágenes en tiempo real de la médula ósea calvaria del ratón para estudiar el mecanismo de movilización de monocitos.

Resumen

Las imágenes multifotónicas en tiempo real ofrecen una gran oportunidad para estudiar el tráfico celular y las interacciones entre células en su entorno fisiológico tridimensional. Las actividades biológicas de las células inmunitarias dependen principalmente de su capacidad de motilidad. Los monocitos sanguíneos tienen una vida media corta en el torrente sanguíneo; Se originan en la médula ósea y se liberan constitutivamente de ella. En la afección inflamatoria, este proceso se intensifica, lo que conduce a la monocitosis sanguínea y la posterior infiltración de los tejidos inflamatorios periféricos. La identificación de los eventos biomecánicos que controlan el tráfico de monocitos desde la médula ósea hacia la red vascular es un paso importante para comprender la relevancia fisiopatológica de los monocitos. Realizamos imágenes de lapso de tiempo in vivo mediante microscopía de dos fotones de la médula ósea del cráneo del ratón Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue). El ratón MacBlue expresa la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) bajo el control de un promotor mieloide específico ¹, en combinación con el marcaje de la red vascular. Describimos cómo este enfoque permite el seguimiento de monocitos medulares individuales en tiempo real para cuantificar aún más el comportamiento migratorio dentro del parénquima de la médula ósea y la vasculatura, así como las interacciones célula a célula. Este enfoque proporciona nuevos conocimientos sobre la biología de los subconjuntos de monocitos de la médula ósea y permite abordar aún más cómo se puede influir en estas células en condiciones patológicas específicas.

Introducción

La médula ósea desempeña un papel central en la hematopoyesis y representa el principal reservorio de monocitos que recirculan constitutivamente entre la sangre y el parénquima medular, renuevan el conjunto de monocitos circulantes con una vida corta ^2,3 y participan en la reconstitución de los tejidos-macrófagos y células dendríticas en estado estacionario ⁴. Durante la inflamación o después de una aplasia transitoria, los monocitos se movilizan activamente desde la médula ósea o el bazo ^{5, 6, 7} y colonizan los órganos inflamados. Varios ejes quimioatrayentes han estado involucrados en el proceso de movilización de células mieloides de la médula ósea ^{8, 5, 6,9}. Más allá del compartimento mieloide, la médula ósea también es un sitio importante de cebado de linfocitos T ¹⁰ y un nicho de memoria inmunológica ^11,12. Por lo tanto, este tejido es central para numerosas investigaciones en el campo de la hematología y la inmunología. Nuestro conocimiento sobre la organización estructural de las células mieloides medulares surge principalmente del análisis de la sección histológica de los tejidos fijados ¹³. Esta visión estática no permite estudiar la dinámica del intercambio celular entre los diferentes compartimentos de la médula ósea, que es la base de su actividad funcional.

Las imágenes intravitales constituyen un importante aporte biológico en el estudio de la movilidad celular, la adherencia celular y las interacciones entre células, que anteriormente solo se describían a partir de sistemas in vitro. Los desafíos técnicos para la adquisición adecuada de imágenes intravitales incluyen la capacidad de alcanzar el tejido de interés desde un punto de vista óptico y maximizar su aislamiento de las derivas fisiológicas (contracciones respiratorias, musculares o peristálticas) o mecánicas (disrupción y extensión del tejido después de la cirugía, y exposición al objetivo del microscopio, así como a las perturbaciones de la temperatura y vascular/oxigenación). Las derivas microscópicas pueden limitar la capacidad de mantener el enfoque durante mucho tiempo y podrían introducir artefactos en la cuantificación de la motilidad celular. Una alternativa, validada para varios tejidos para reducir estas dificultades técnicas, es trabajar con tejido explantado incubado en un medio termostatizado y oxigenado; Sin embargo, la interrupción completa de la circulación linfática y vascular puede ser problemática. Las imágenes intravitales de la médula ósea del cráneo tienen varias ventajas en relación con estos temas. En primer lugar, requiere una acción quirúrgica mínima. En segundo lugar, el grosor del hueso en esta región permite la visualización directa de los nichos de la médula ósea sin abrasión, reduciendo así las perturbaciones fisiológicas. La red medular se puede visualizar en la región parasagital del hueso; Sin embargo, los sinusoides son más visibles en la zona fronto-parietal, donde la matriz ósea es más delgada^12,14.

Las imágenes intravitales dependen de la disponibilidad del indicador fluorescente más preciso que marca la población de interés. El marcaje in vitro de la población de células purificadas antes de la transferencia adoptiva condujo a una importante caracterización de los nichos de células madre hematopoyéticas ¹⁵ o de los microdominios endoteliales de la médula ósea que favorecen el injerto tumoral ¹⁶, y proporcionó varias aportaciones fundamentales sobre conceptos clave en inmunología ¹⁷ . Sin embargo, este enfoque generalmente requiere cientos de miles de células para tener la oportunidad de detectarlos posteriormente in vivo. Esto podría explicarse por la alta tasa de mortalidad después de la tinción, la dilución en todo el cuerpo y el cambio en el estado de activación, lo que podría conducir a un homing sesgado. El marcaje endógeno a partir de un sistema de ratón transgénico supera en gran medida estas limitaciones y ha permitido obtener imágenes del comportamiento de los osteoblastos ^{endógenos 8}, megacariocitos ¹⁸ o subconjuntos de linaje mieloide ⁶. Sin embargo, hay que ser cauteloso al considerar la especificidad del reportero fluorescente entre el subconjunto estudiado.

El Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, llamado ratón MacBlue ¹, es un valioso sistema transgénico para estudiar monocitos medulares con imágenes en tiempo real ⁶. La inyección intravenosa de rodamina-dextrano de alto peso molecular distingue el parénquima medular de la red sinusoide vascular de la médula ósea. Con este enfoque, es posible rastrear el comportamiento de los monocitos en los diferentes compartimentos medulares en un contexto fisiopatológico específico de interés. Además, proponemos una estrategia adicional para comparar la dinámica de los monocitos con la de los neutrófilos mediante el marcaje in vivo utilizando un anticuerpo específico.

Protocolo

NOTA: Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal y Ética francés y validados por el "Servicio de Protección et Santé Animales, Environnement" con el número A-75 hasta 2065. Los tamaños de muestra se eligen para asegurar la reproducibilidad de los experimentos, y de acuerdo con el 3R de la regulación ética animal.

1. Preparación del ratón

1. Anestesia
   1. Para corto período de formación de imágenes (menos de 1 hr), anestesiar el ratón con una inyección intraperitoneal de 200 l de una solución salina que contiene ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg).
   2. Alternativamente, para el período de formación de imágenes más largo (hasta 4 horas), anestesiar el ratón con una inhalación de isoflurano 2,5% vaporizado en una mezcla 70/30 de O ₂ / N ₂ O, a través de una máscara adaptada.
   3. NOTA: Este modo proporciona la inconsciencia más estable y evita la inyección intraperitoneal en serie de fármacos.
   4. Una vez que el ratón está anestesiado, comprobar la inconsciencia a través de la estimulación de la pata con pinzas.
2. Tinción Vascular / tinción adicional
   1. Para la tinción vascular: Inyectar por vía intravenosa en la vena de la cola, 200 l de rodamina-dextrano (2 MDA, 10 mg / ml en tampón de solución salina).
   2. Para la tinción de neutrófilos: inyecte 2 g de Ly6G-PE (clon 1A8) en 100 l de solución salina por vía intravenosa en la vena de la cola.
3. Inmovilización
   1. Para la inmovilización, utilizar un soporte estereotáctica por encargo adaptado al microscopio y al inhalador de gas anestésico.
      NOTA: El titular estereotáctica es un soporte de metal con dos soportes de placa de metal, que se está fijo y la otra extraíbles y adaptables, para apretar la cabeza del animal.
   2. Instale la cabeza del ratón entre las placas de retención para asegurar el aislamiento de los movimientos respiratorios. Apriete los oídos entre placas de retención y la cabeza para estirar el sk. El registro para la estabilidad y la respiración bienestar del animal.
4. Retire el cuero cabelludo
   1. Utilizar con cuidado etanol al 70% para mojar el cabello del cuero cabelludo con un aplicador estéril, evitando el contacto con los ojos.
   2. Cortar la piel con las tijeras y alicates estériles para eliminar completamente el cuero cabelludo del retroceso del hueso parietal en el hueso frontal. Mantener alejado de hasta 3 mm de ojos y oídos para prevenir sangrado abundante. Retire el tejido conectivo laxo que cubre el cráneo (periostio). Lavar el cabello restante con una cálida toalla de papel empapada en PBS.
5. Sistema de inmersión configurado
   1. Pegue un anillo de goma de 18 mm de diámetro con pegamento quirúrgico directamente en el cráneo usando una aguja de pequeño calibre para controlar la distribución. Pegamento de toda la periferia del anillo de goma para evitar fugas (30 l deberían ser suficientes).
   2. Limpie el cráneo debajo del ring por última vez con una toalla de papel empapada en PBS y luego añadir 37 ° C PBS para la inmersión completa de lacráneo. Añadir una gota de NaCl 0.9% solución o ungüento oftálmico específico en cada ojo del ratón para evitar la sequedad de los ojos. Arrastre el titular estereotáctica con arreglo al objetivo.
   3. Aproximadamente colocar el campo utilizando el ocular del microscopio a través de la transmisión directa.

2. Dos fotones Imaging Acquisition

1. Utilice un microscopio multifotónica junto con un láser de Ti: Cristal de zafiro, que proporciona 140fs pulsos de luz NIR, sintonizable selectivamente de 680 a 1080 nm, y un modulador acústico-óptico para el control de la potencia del láser. Utilice una configuración que incluye 3 detectores externos no descanned (NDD) (que permiten la grabación simultánea de 3 canales fluorescentes) con una combinación de 2 espejos dicroicos (565 nm y 690 nm), 565/610 y 500/550 filtros de paso de banda, y un filtro de paso corto 485, con un plan de apochromat × 20 (NA = 1) objetivo de inmersión en agua.
2. Establezca la cámara de calentamiento para permitir una buena homeotermia de los ANAESratón anestesiados.,
   NOTA: La temperatura puede ajustarse de 1 hora antes de la formación de imágenes de sesión para una mejor estabilidad. En nuestro caso, 32 ° C ha sido elegido para obtener la temperatura corporal óptima del ratón anestesiado (36-37 ° C) y se mantiene hasta 4 horas. Esta temperatura puede ser adaptado para el sistema utilizado (sonda digital puede ser utilizado para comprobar este punto). Además, la cámara de calentamiento utilizado es oscuro / negro y cubre una parte del sistema (objetivos y la placa motorizada) para evitar la contaminación de luz externa.
3. Encienda el sistema
   1. Encienda el láser de Ti: Zafiro, entonces todo el sistema de microscopio. Inicie el software de adquisición. Ajuste el rango de longitud de onda del láser de 870 nm. Seleccione NDD apropiado para la grabación.
      NOTA: En nuestro caso, generación de segundo armónico (SHG) ¹⁹ y la proteína fluorescente cian (ECFP) son detectados por el DDN después del filtro de pase corto 485. ECFP también es detectado por el NDD después del filtro de paso de banda 500/550 y rodamina-dextrano es detectado por tél NDD después del filtro de paso de banda 565/610.
4. Ajustar la configuración de adquisición
   1. Utilice el comando de imágenes "adquisición en vivo" del software y utilizar el control direccional microscopio, ajustar el enfoque en una región con ECFP y Rodamina señal. Ajustar la potencia del láser al mínimo para obtener la mejor relación señal a ruido con un mínimo de foto-daño.
      NOTA: El ajuste de la potencia que se utiliza varía según la profundidad de la zona de interés. Normalmente la configuración de OMA están distribuidas alrededor de un 20%, lo que representa una potencia de láser más allá del objetivo alrededor de 15 mW. Es mejor para aumentar el poder de ganancia en los PMT para cada NDD para reducir foto-blanqueo y foto-daño. Ajustes de adquisición típicos son la exploración individual con un tiempo de permanencia de píxel de 1,58 mS, y una resolución de 512 x 512 píxeles con un aumento de 1,5.
5. Seleccione las regiones de interés
   1. Una vez que los parámetros de grabación se establecen, utilice de nuevo el comando de adquisición "en vivo",y examinar el tejido para elegir un campo deseado (x, y, z) para monitorizar en tiempo real.
      NOTA: Por lo general, se optó por un campo que incluye tanto vascular y áreas del parénquima.
   2. Registrar el campo con el comando de software "posición".
      NOTA: Este comando memoriza x, y, z las coordenadas de los diferentes campos distantes.
   3. Seleccionar y registrar campos de interés adicionales (hasta 3), utilizando el mismo procedimiento.
   4. Establecer una pila Z 3D con el comando de software "z-stack" en la primera posición memorizada de acuerdo con el volumen requerido con aumento elegido. Memorizar posición más profunda primero, y luego la posición más alta. Normalizar la potencia del láser con la profundidad.
      NOTA: Para imágenes campo concomitante múltiple, adquirimos 5 rebanadas separadas por 3 micras z pasos para cada campo para adquirir un volumen de 12 micras de espesor. Estas configuraciones pueden ser adaptados para el tipo de célula estudiado.
6. Adquisición de Lanzamiento
   1. Seleccione el220, el tiempo de la serie de comandos de software "y seleccione la duración de intervalo de tiempo y el número de ciclos. Comience time-lapse de acuerdo con el lapso de tiempo y la duración requerida seleccionando el comando de software "iniciar el experimento".
      NOTA: En nuestro caso, vamos adquiriendo un volumen cada 30 segundos durante 60 ciclos que representan a 30 min en tiempo real. Más pequeño lapso de tiempo se puede realizar para pista de rodadura celular rápido en el vaso sanguíneo. En este caso más delgado z-pila y no más de 2 campos diferentes se pueden grabar al mismo tiempo.
   2. El control regular de la puesta en marcha.
      1. Siempre controlar al animal para asegurarse de que está inconsciente.
         NOTA: Sacudida de bigotes o las piernas del animal son indicadores de avivamiento. En el caso de la respiración del animal es carne seca, la cantidad de isoflurano se puede reducir ligeramente. La deriva de tejido fuerte durante la adquisición es un indicador del renacimiento del ratón.
      2. Asegúrese de que el objetivo se sumerge correctamente. Renovar 37 ° C PBS between dos adquisiciones (30 min).
         NOTA: la desaparición progresiva de la señal durante la adquisición es indicador de PBS fugas.
7. Fin del procedimiento
   1. Una vez que se registran los videos requeridos, la eutanasia a los animales por dislocación cervical rápidamente antes de la reanimación.
      NOTA: la curación de heridas conduce a la formación de una costra en 24 a 48 horas lo que limita la posibilidad de realizar las imágenes longitudinal.

Análisis 3. Datos

1. Corrección de la deriva
   1. Utilice software Imaris Bitplane para el seguimiento automático 3D.
   2. Abra la secuencia de imágenes 3D en Imaris. Seleccione "spot" de comandos, y generar el seguimiento manual (clic del ratón + shift) para todos los puntos de tiempo por un mínimo de 4 puntos de anclaje diferentes, si es posible distribuida homogéneamente en el campo.
   3. Aplicar la corrección de la deriva con el comando "deriva correcta" en la pestaña "editar pista".
   4. Compruebe tque la calidad de la corrección en x, y y z en particular para evitar la vacilación artefactual.
      NOTA: Si la corrección no es satisfactoria, pruebe otros puntos de anclaje o excluir el video del análisis.
2. Seguimiento de la célula
   1. Utilice "añadir nuevos puntos" del sistema y seleccione "puntos de la pista con el tiempo" ajuste algoritmo. Vaya al paso siguiente.
   2. Aplicar el procedimiento de seguimiento automático de células, ya sea en todo el canal de interés con el comando "canal de origen". Objetos Set (es decir, las células) de diámetro a 10 micras. Vaya al paso siguiente.
      NOTA: La elección dependerá de la distinción entre los objetos y la especificidad de la señal medida. En resumen, el seguimiento automático de todo el canal es posible sólo si la señal detectada es específica para el objeto de interés. Debido a que tanto SHG y ECFP son detectados por el NDD después del filtro 485 pase corto, de seguimiento será más específica y eficiente utilizando la señal de ECFP registrada por el NDD después de la 500/550 filtros de paso de banda. Agrupados o objetos embalados densas requieren selección manual de objetos individuales similares al paso 3.1.2.
   3. Seleccione el tipo de filtro "de calidad", ajustar el umbral para excluir el seguimiento de objetos inespecíficos. Vaya al paso siguiente.
   4. Elija "browniano algoritmo Motion" con parámetros precisos de "distancia Max" y "tamaño Gap" entre dos puntos. Validar generación pista.
   5. Una vez que las pistas se calculan automáticamente, seleccione "Duración pista" tipo de filtro, ajustar el umbral para eliminar pistas más cortas que 120 segundos (lo que representa 4 puntos de tiempo).
   6. Obligatorio: Después de seguimiento automático, comprobar la calidad de las pistas.
      1. Desenrolle la barra de tiempo para comprobar que los objetos siguen los caminos de pista. Si no, utilice las opciones de corrección de punto de seguimiento disponibles en la pestaña "editar": Eliminar pistas falsas o incorrectas con "borrar" de comandos (borrar cualquier pista point individualmente con el comando "desconexión"). Si pista de atletismo es discontinua, añadir puntos de tiempo que faltan (clic con el ratón + shift), seleccione todos los puntos en una pista dada, y el uso de "conectar" de comandos en la pestaña "editar pista".
3. Parámetros de cuantificación
   1. Seleccione la pestaña "Estadísticas" al mando "Preferencias", seleccione los parámetros dinámicos de interés de la lista. Seleccione "Exportar todas las estadísticas para presentar" comando y guardar el archivo de Excel generado.
      NOTA: Varios parámetros dinámicos se obtienen directamente desde el software como longitudes de pista, velocidad instantánea, velocidad media, y un seguimiento de la rectitud. Coeficiente de Motilidad ^{6, 20} puede determinarse, pero no está directamente proporcionada por el software.
   2. Para cada celda, calcular la media de los desplazamientos para cada período de tiempo (dt) (para una película de lapso de tiempo de 30 seg, dt será de 30, 60, 90 seg, etc).Trazar la media del desplazamiento cuadrado como una función del intervalo de tiempo. Obtener coeficiente de la motilidad mediante el cálculo de la pendiente de la parte lineal de la curva.

Resultados

La estructura del cráneo del ratón ofrece una buena oportunidad para estudiar la fisiología de la médula ósea por intravital de imágenes. El hueso ser delgado alrededor de la zona frontal parietal, es posible obtener acceso a nichos medulares sin abrasión del hueso. La figura 1 representa un amplio campo 2D del cráneo de un ratón transgénico MacBlue. La matriz ósea está compuesta principalmente de colágeno I fácilmente detectable por SHG ^19. La inyección de rodamina-dextrano tiñe la red vascu...

Discusión

Los puntos críticos de la metodología de formación de imágenes en vivo son para asegurar la estabilidad del foco a fin de maximizar la duración de la formación de imágenes y para reducir al mínimo el riesgo de contaminación bacteriana y la inflamación, lo que podría afectar la dinámica de las células inflamatorias. Imaging del hueso del cráneo ósea sigue estos objetivos como la cirugía realizada para obtener acceso a la médula ósea es mínima. El uso de material estéril y antisépticos es esencial para lim...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ketamin	Merial		100 mg/ml, anestésico
Xylazin	Bayer HealthCare		10 mg/ml, anestésico
Isofluran	Baxter		2,5%, anestésico
O2/NO2			70/30 mezcla, anestésico
Rhodamin-Dextran	Invitrogen		2 MDa, 10 mg/ml, Tinción vascular
Ly6G-PE	de Becton-Dickinson		1A8, tinción de neutrófilos
Soporte estereotáctico Cirugía	casera
Etanol 70%			cirugía
Cirugía de tijeras y pinzas
Anillo			de 18 mm de diámetro, cirugía
Glubran 2	Queryo Médico		Quirúrgico Pegamento, fijación de anillo de goma
Agujas de calibre pequeño	Cirugía Terumo
Zeiss LSM 710 NLO Microscopio multifotónico	Carl Zeiss	Microscopio
zafiro	Coherente Chameleon Ultra		140 fsec pulsos de luz NIR
Zen 2010	Carl Zeiss		Acquistion Software
Imaris Bitplane	plano de bits		, seguimiento automático 3D
PBS 1X	D. Cirugía Dutscher
Cámara termostatizada	Carl Zeiss	Imágenes intravitales