El análisis de los efectos de las células del estroma en el reclutamiento de leucocitos de Flujo

Resumen

La capacidad del endotelio inflamado para reclutar leucocitos de flujo se regula por las células estromales mesenquimales. Se describen dos modelos in vitro que incorporan células humanas primarias que se pueden utilizar para evaluar el reclutamiento de neutrófilos de flujo y examinar el papel que las células estromales mesenquimales desempeñan en la regulación de este proceso.

Resumen

Las células del estroma regulan el reclutamiento de leucocitos circulantes durante la inflamación a través de la diafonía con células endoteliales vecinas. Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes de flujo por las células endoteliales inflamadas. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. También describimos cómo ambos modelos se pueden adaptar para estudiar el papel de las células del estroma, en este caso las células madre mesenquimales (MSC), en la regulación de reclutamiento de leucocitos.

Células endoteliales primarias se cultivaron solas o junto con MSC humano en contacto directo en microportaobjetos ibidi o en lados opuestos de un filtro Transwell durante 24 horas. Los cultivos se estimularon con factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas y se incorporan en un ensayo de adherencia basado en el flujo. Un bolo de neutrófilos se perfundiósobre el endotelio durante 4 min. La captura de fluir neutrófilos y sus interacciones con el endotelio fue visualizado por microscopía de contraste de fase.

En ambos modelos, la estimulación de citoquinas-aumento del reclutamiento de neutrófilos endotelial que fluyen de una manera dependiente de la dosis. Análisis del comportamiento de los neutrófilos reclutados mostró una disminución dependiente de la dosis en la rodadura y un aumento dependiente de la dosis en la transmigración a través del endotelio. En co-cultivo, MSC suprimida la adhesión de neutrófilos al endotelio TNF estimulada.

Nuestros modelos de adhesión basados ​​en el flujo imitan las fases iniciales de reclutamiento de leucocitos de la circulación. Además de leucocitos, pueden usarse para examinar el reclutamiento de otros tipos de células, como las células tumorales circulantes MSC o administrados terapéuticamente. Nuestros modelos de co-cultivo de varias capas han demostrado que el MSC se comunica con el endotelio de modificar su respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias, Altering el reclutamiento de neutrófilos. Se requiere investigación adicional utilizando dichos modelos para entender completamente las células estromales de la forma de diferentes tejidos y condiciones (trastornos inflamatorios o cáncer) influyen en el reclutamiento de leucocitos durante la inflamación.

Introducción

La inflamación es una respuesta protectora a la infección microbiana o la lesión del tejido que requiere una estrecha regulación de la entrada de leucocitos y salida de el tejido inflamado para permitir la resolución ^1,2. Cross-talk entre las células endoteliales (CE) que los vasos sanguíneos línea, leucocitos circulantes y las células del estroma residente de tejidos es esencial para coordinar este proceso ^3. Sin embargo, la contratación incontrolado de leucocitos y su limpieza ineficaz de apuntalan el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas ^4. Nuestra comprensión actual de reclutamiento de leucocitos en la salud y la enfer....

Protocolo

1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales primarias humanos y células madre mesenquimales

1. Celdas de aislamiento y cultivo de humanos umbilicales endoteliales de la vena (HUVEC):
   1. Ponga el cordón umbilical en una bandeja con papel de cocina y rocíe con etanol al 70%. Colocar en una campana de cultivo de tejidos. Identificar la vena y canular en ambos extremos. Coloque un cable de sujeción alrededor del extremo canulado para asegurarlo.
   2. Lavar la sangre venosa con PBS utilizando una jeringa. Llene la jeringa con aire y pasar a través de la vena de retirar y desechar el PBS residual.
   3. Descongelar 10 mg / ml de colagenasa tipo ....

Resultados

Inicialmente, se analizó el efecto de estimular la CE con TNFa en el reclutamiento de neutrófilos de flujo utilizando el modelo microportaobjetos ibidi (Sección 7-9). En ausencia de TNF, poco o ningún neutrófilos se adhirieron a la monocapa endotelial (Figura 2A). Esto se esperaba, ya que sin tratar / descansando CE no expresan las moléculas necesarias de adhesión (selectinas) o quimiocinas para apoyar la unión ^25,26. En contraste, la estimulación por citoquinas aumentó signi.......

Discusión

Aquí se describen los dos modelos "in vitro" en vasculares para estudiar el reclutamiento de neutrófilos circulantes por endotelio inflamado. Una gran ventaja de estos modelos es la capacidad de analizar cada paso en la cascada de adhesión de leucocitos en orden, como ocurriría in vivo. Hemos observado anteriormente un aumento dependiente de la dosis en la adhesión de neutrófilos y la transmigración a través de TNF estimulada CE ^9,29. También describimos cómo ambos modelos se puede.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Colagenasa Tipo Ia	Sigma	C2674	Diluir en 10 ml de PBS para obtener una concentración final de 10 mg/ml. Almacenar a -20 & grados; C en alícuotas de 1 ml.
Sigma	D8662	de Dulbecco	Con cloruro de calcio y magnesio. Manténgalo estéril y guárdelo en RT.
1X Medio M199	Gibco	31150-022	Cálido en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Sulfato de gentamicina	Sigma	G1397	Conservar a 4 °C. Añadir a M199 Frasco de 500 ml.
factor de crecimiento epidérmico humano	Sigma	E9644	Tienda en -20 ° C en 10 y micro; l alícuotas.
Suero fetal de ternera (FCS)	Sigma	F9665	FCS debe ser probado por lotes para asegurar el crecimiento y la viabilidad de la CE aislada. Inactivación por calor a 56 °C. Almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 °C.
Anfotericina B	Gibco	15290-026	Potente y se vuelve tóxico en una semana, por lo que el medio HUVEC completo y fresco debe reponerse cada semana. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
Hidrocortisona	Sigma	H0135	El stock está en etanol. Almacenar a -20 ° C en 10 y micro; l alícuotas.
Colagenasa Tipo II	Sigma	C6885	Diluir el caldo en PBS hasta una concentración final de 100 mg/ml. Almacenar a -20 & grados; C en 100 y micro; l alícuotas.
Hialuronidasa	Sigma	H3631	Diluir el stock en PBS hasta una concentración final de 20.000 U/ml. Almacenar a -20 & grados; C en 100 y micro; l alícuotas.
100 y micro; Filtro de células m para tubo de centífugo de 50 ml	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	También se pueden utilizar otros filtros de células disponibles en el mercado (por ejemplo, Greiner bio-one).
DMEM baja glucosa	Biosera	LM-D1102/500	Warm en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Mezcla de penicilina/estreptomicina	Sigma	P4333	Tienda a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
Matraz de cultivo de tejidos de 25 cc	SLS 353109
matraz de cultivo de tejidos de 75 cc	SLS	353136
Frasco de células madre mesenquimales de médula ósea	Lonza	PT-2501	Almacenar en nitrógeno líquido a su llegada. Las celdas están en el pasaje 2 a su llegada, pero están designadas como pasaje 0. Explique al pasaje 3 y almacene en nitrógeno líquido para su uso posterior.
Medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 ° C Baño de agua antes de usar. Para la tinción Cell Tracker Green, use medio sin FCS.
Solución EDTA (0.02%)	Sigma	E8008	Almacene a 4 °C. Caliente en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Solución de tripsina	Sigma	T4424	Tienda a -20 ° C en alícuotas de 2 ml. Descongele en RT y úselo inmediatamente.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Mantener en hielo antes de agregar antes de agregar la suspensión celular.
Mr. Frosty Contenedor de congelación	Nalgene	5100-0001	Tienda en RT. Al agregar crioviales con células, almacene a -80 & grados; C durante 24 horas antes de transferir las células a nitrógeno líquido.
Ibidi u-Slide VI (0.4), tratamiento T/C, estéril	Ibidi	IB-80606	Los modelos alternativos incluyen capilares de vidrio, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), placas BioFlux (www.fluxionbio.com/bioflux/) y cámaras de flujo de placas paralelas GlycoTech (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Rastreador celular tinte verde Life	technologies	C2925	Tienda en 5 y micro; l alícuotas a -20 ° C. Diluir en 5 ml precalentado (a 37 ° C; C) MSCGM.
Cámaras de recuento de células	Nexcelom	SD-100	Alternativamente, se puede utilizar un hemocitómetro.
Celómetro auto T4 contador de células	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Factor de necrosis tumoral y alfa; (TNF&alfa;)	R& D Systems	210-TA-100	Diluir el stock en PBS hasta una concentración final de 100.000 U/ml. Almacenar a -80 & grados; C en 10 y micro; l alícuotas.
6 pocillos, 0,4 y micro; m Filtros PET Transwell	SLS	353090
K2-EDTA en tubos de 10ml	Sarstedt		Store en RT.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Almacenar a 4 °C. Calentar a RT antes de usar.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Almacenar a 4 °C. Calentar a RT antes de usar.
Tubo de fondo redondo de 10 ml	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fracción V solución	Life technologies	15260-037	Almacenar a 4 °C.
20 ml Jeringas Plastipak	BD falcon	300613
5 ml Jeringas Plastipak	BD falcon	302187
2 ml Jeringas Plastipak	BD falcon	300185
3M cinta quirúrgica hipoalergénica 9 m x 2,5 cm	Micropore	1530-1	Utilícelo para fijar el grifo de la jeringa en la pared de la cámara de metacrilato.
Tubo de caucho de silicona, diámetro interno/diámetro externo (ID/OD) de 1/3 mm (tubo delgado)	Fisher Scientific	FB68854	Corte el tubo de silicona al tamaño adecuado. Todos los tubos que conducen directamente a la microválvula electrónica deben ser delgados.
Tubo de caucho de silicona ID/OD de 2/4 mm (tubo grueso)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Tubo manómetro	Smiths	200/495/200	Tubo que conduce a la bomba de jeringa.
Llave de paso de 3 vías	BOC Ohmeda AB
Glass Jeringa de 50 ml para bomba	Popper Micromate 550962		Debe cebarse antes de su uso eliminando las burbujas de aire.
Cubreobjetos de vidrio	Raymond A Lamb		26 x 76 mm cubreobjetos hechos por encargo. Número de lote 2440980.
Corte			una pieza de parafilm de 26 x 76 mm con una plantilla de aluminio y corte una ranura de 20 x 4 mm con un bisturí 10a. El grosor de la junta es de aproximadamente 133 µm.
Dos placas paralelas de metacrilato Wolfson	Applied Technology Laboratory		Cámara especialmente diseñada que consta de placas paralelas unidas por 8 tornillos. La placa inferior tiene una ranura de visualización recortada en el medio y un hueco poco profundo fresado para dejar espacio para el cubreobjetos, el filtro y la junta. La placa superior de metacrilato tiene un orificio de entrada y salida colocado sobre el canal de flujo.
Microválvula electrónica de 3 vías con espacio muerto mínimo	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Conectado electrónicamente a una fuente de alimentación de CC de 12 voltios.
Bomba de jeringa para infusión/extracción (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Ajuste el diámetro a 29 mm y la tasa de llenado (flujo).
Conector en forma de L	Labhut	LE876	Para acoplar a los puertos de entrada y salida en el canal de microcorredera Ibidi.
Cámara de vídeo	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Conectada a un ordenador que permite grabar vídeos digitales.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	Para el análisis de datos. Etiquete manualmente las celdas mostrando los diferentes comportamientos. Células de seguimiento para el análisis de las velocidades de rodadura y migración.
Consulte las hojas de datos del producto para obtener detalles sobre los peligros de usar los reactivos descritos aquí.

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